富T-DNA-納米氧化石墨烯熒光探針檢測(cè)乳制品中的三聚氰胺

常晨陽(yáng)，單 嬌，常 凱，劉立波，朱秀煥，劉 偉，張為黨

（1.聊城檢驗(yàn)檢疫局，山東 聊城 252000；2.黃島檢驗(yàn)檢疫局，山東 青島 266500；3.董家口港檢驗(yàn)檢疫局，山東 青島 266400；4.唐縣農(nóng)業(yè)局，河北 唐縣 072350）

三聚氰胺（Melamine），C3H6N6，俗稱密胺、蛋白精，是一種重要的氮雜環(huán)有機(jī)化工原料，具有生物毒性，食用三聚氰胺能誘發(fā)腎衰竭并導(dǎo)致死亡，是一種禁止用于食品及動(dòng)物飼料中的化學(xué)物質(zhì)[1-2]。由于三聚氰胺中含氮量高達(dá)66%，多出蛋白質(zhì)氨基酸中氮含量300%～400%，摻雜添加三聚氰胺可虛假提高蛋白質(zhì)含量，被非法添加曾引起過(guò)較大的社會(huì)負(fù)面效應(yīng)[3-5]。對(duì)食品尤其是乳制品中三聚氰胺的監(jiān)控事關(guān)人民生命及政府形象和執(zhí)法公信力，技術(shù)檢測(cè)部門非常重視三聚氰胺的檢測(cè)工作。

中國(guó)已就乳制品制定了多個(gè)三聚氰胺檢測(cè)國(guó)家及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，最常用的方法有高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[6-9]。高效液相色譜串聯(lián)紫外或二極管陣列檢測(cè)器（DAD檢測(cè)器）可直接檢測(cè)三聚氰胺，而氣質(zhì)聯(lián)用法需要對(duì)三聚氰胺進(jìn)行衍生化處理，增加處理過(guò)程[10]。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀具有高的檢測(cè)靈敏度，在部分實(shí)驗(yàn)室作為確定陽(yáng)性定量使用，但因儀器昂貴，也限制了某些檢測(cè)平臺(tái)的廣泛使用[11-12]。近年來(lái)，用于三聚氰胺檢測(cè)的納米探針不斷被報(bào)道，但多數(shù)研究限于檢測(cè)簡(jiǎn)單水相，尚未實(shí)現(xiàn)在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域的技術(shù)突破。尋找高靈敏度、高選擇性、適合快速現(xiàn)場(chǎng)篩選、開(kāi)發(fā)新的檢測(cè)方法和新平臺(tái)一直是三聚氰胺檢測(cè)研究的持續(xù)熱點(diǎn)[13-15]。

氧化石墨烯（GO）作為一種新型的納米材料，由于其獨(dú)特的物理化學(xué)和光學(xué)性質(zhì)，近年來(lái)在生物傳感方面的應(yīng)用越來(lái)越廣泛[16-19]。本研究設(shè)計(jì)了通過(guò)可特異性識(shí)別三聚氰胺的富胸腺嘧啶的DNA堿基序列，標(biāo)記熒光素作為信號(hào)基團(tuán)，根據(jù)在有無(wú)三聚氰胺分子作用后的不同，在有三聚氰胺分子存在時(shí)將形成折疊的雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，沒(méi)有結(jié)合三聚氰胺分子保持單鏈狀態(tài)；再通過(guò)與單雙鏈DNA作用力明顯不同且對(duì)熒光素有高猝滅性能的氧化石墨烯后組裝，形成不同的熒光信號(hào)，且信號(hào)大小與三聚氰胺的存在量呈正相關(guān)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)三聚氰胺的定量檢測(cè)[20-23]。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

試劑：氧化石墨烯（批號(hào)：7782-42-5；純度：99.6wt%）購(gòu)自南京先豐納米材料科技有限公司；5'端標(biāo)記熒光染料（FAM）標(biāo)記的富胸腺嘧啶DNA鏈T-ssDNA-FAM由上海生物工程公司合成并經(jīng)過(guò)HPLC純化，序列為5'-FAM-TTTTT TTTTT TTTTT TTTTTT-3'；三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自德國(guó)Dr公司；試驗(yàn)所用水均為Mill-Q二次超純水。

儀器：pH-3C型酸度計(jì)，F(xiàn)LS-980型熒光分光光度計(jì)，高速離心機(jī)，電子天平。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 氧化石墨烯用量的優(yōu)化

使用氧化石墨烯水溶液初始濃度為1 mg·mL-1。改變氧化石墨烯（GO）的使用濃度：0、2、3、4、5、6、8、10μg·mL-1分別與50 nM的T-ssDNA-FAM混合37℃水浴孵育30 min后測(cè)熒光強(qiáng)度的猝滅程度。檢測(cè)5'端標(biāo)記熒光染料（FAM）設(shè)定參數(shù)為激發(fā)波長(zhǎng)為490 nm，掃描范圍為500～600 nm，檢測(cè)發(fā)射波長(zhǎng)為519 nm，狹縫寬為2 nm。

1.2.2 DNA鏈特異性識(shí)別溶液中的三聚氰胺

在緩沖溶液（Tris 20 mM，NaCl 100 mM，KCl 5 mM，MgCl21 mM）中，以終濃度為100 nm富T-ssDNA-FAM探針，加入待檢測(cè)三聚氰胺的溶液中，37℃水浴下，孵育30 min，反應(yīng)體系為500μL。

1.2.3 氧化石墨烯-DNA納米探針

取1 mg·mL-1氧化石墨烯儲(chǔ)備液5μL，加入到反應(yīng)體系中，用磷酸緩沖溶液定容至1 000μL反應(yīng)體系，此時(shí)為50 nM濃度的熒光標(biāo)記的富T-ssDNA-FAM，后組裝5μg·mL-1的氧化石墨構(gòu)成的納米熒光探針，加入石墨烯后繼續(xù)水浴中孵育30 min后，通過(guò)熒光分光光度計(jì)檢測(cè)熒光信號(hào)即可完成對(duì)三聚氰胺的檢測(cè)。

1.2.4 納米探針的熒光恢復(fù)曲線

利用以上優(yōu)化好的數(shù)據(jù)，在1 mL體系中，以50 nM的富T-dsDNA-FAM，后組裝5μg·mL-1氧化石墨烯納米探針，檢測(cè)0～3 000 nM不同濃度的三聚氰胺，在37℃下孵育30 min后的響應(yīng)熒光信號(hào)，繪制探針檢測(cè)三聚氰胺的熒光恢復(fù)曲線。

1.2.5 納米探針的特異性試驗(yàn)

納米探針（5μg·mL-1）與10 mM葡萄糖、麥芽糖、果糖、賴氨酸、酪氨酸分別在37℃下孵育30 min后測(cè)其熒光強(qiáng)度，與500 nM三聚氰胺的響應(yīng)值做柱狀圖對(duì)比。

1.2.6 對(duì)乳制品樣品進(jìn)行應(yīng)用分析

預(yù)處理步驟如下：取液態(tài)乳品1 mL（或粉狀樣品1 g）與高純水8 mL溶于10 mL離心管中，然后加入1.0 mL 1%三氯乙酸（m·m-1），超聲處理10 min后，1 2000 r·min-1離心5 min，上清液用二次水稀釋到10 mL后用1 M的Na2CO3溶液中和至pH為7，進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 氧化石墨烯用量的優(yōu)化

氧化石墨烯的使用濃度：0、2、3、4、5、6、8、10μg·mL-1分別與富T-ssDNA-FAM 50 nM混合反應(yīng)后的熒光猝滅曲線見(jiàn)圖1。FAM的熒光強(qiáng)度隨著氧化石墨烯濃度的增加而降低，當(dāng)氧化石墨烯的濃度為5μg·mL-1時(shí)，便可以將溶液中FAM的熒光基本全部猝滅，所以選擇GO濃度為5μg·mL-1進(jìn)行以下試驗(yàn)。

圖1 加入不同GO濃度對(duì)應(yīng)熒光的猝滅程度

2.2 熒光表征

驗(yàn)證基于氧化石墨烯檢測(cè)平臺(tái)的傳感器的原理，見(jiàn)圖2。圖中曲線c為5μg·mL-1氧化石墨烯溶液的熒光強(qiáng)度值；圖中曲線a表示和富T-DNA序列探針50、500 nM三聚氰胺、后組裝5μg·mL-1氧化石墨烯在20 mM Tris緩沖溶液中測(cè)量的熒光強(qiáng)度，此時(shí)由于剛性DNA雙鏈結(jié)構(gòu)已形成，氧化石墨烯不會(huì)猝滅掉形成雙鏈的富T-dsDNAFAM，所以檢測(cè)到游離的FAM的熒光信號(hào)；曲線b為沒(méi)有三聚氰胺存在下，在上述同樣的緩沖溶液中加入5μg·mL-1氧化石墨烯和50 nM富T-ssDNA-FAM檢測(cè)到的熒光信號(hào)，此時(shí)，由于不能形成折疊結(jié)構(gòu)，富T-ssDNA以單鏈形式存在，導(dǎo)致其5'端標(biāo)記的FAM熒光基團(tuán)在氧化石墨烯上被吸附，熒光信號(hào)被猝滅。

圖2 三種不同溶液的熒光曲線

2.3 探針響應(yīng)動(dòng)力學(xué)

為確定三聚氰胺與ssDNA-FAM形成T-三聚氰胺-T結(jié)合的雙鏈結(jié)構(gòu)的最佳時(shí)間，將500 nM的三聚氰胺后，分別加入50 nM的ssDNA-FAM混合37℃下反應(yīng)0、5、10、15、20、30 min后，加入5μg·mL-1的GO，測(cè)其在 37℃下孵育30 min后檢測(cè)的熒光強(qiáng)度的變化見(jiàn)圖3?？梢?jiàn)，三聚氰胺與富T-ssDNA-FAM混合雜交10 min就能大部分形成折疊的雙鏈結(jié)構(gòu)，檢測(cè)到相應(yīng)的熒光信號(hào)強(qiáng)度。當(dāng)雜交反應(yīng)的時(shí)間20～30 min后，熒光強(qiáng)度基本不再發(fā)生變化，最終使得富T-ssDNA-FAM探針最大程度的特異性識(shí)別三聚氰胺目標(biāo)分子，選擇30 min作為第一步中形成T-三聚氰胺-T結(jié)構(gòu)的最佳反應(yīng)時(shí)間。

圖3 T-三聚氰胺-T結(jié)構(gòu)形成時(shí)間的優(yōu)化

2.4 探針的檢測(cè)性能分析

為確定該后組裝納米探針對(duì)靶標(biāo)的熒光信號(hào)檢測(cè)情況，配制不同三聚氰胺濃度的溶液中加入熒光探針，觀察熒光強(qiáng)度變化情況，見(jiàn)圖4。隨著三聚氰胺濃度的增加，熒光信號(hào)逐漸增大，到最后能達(dá)到未加入氧化石墨烯猝滅前體系的熒光強(qiáng)度的80%，即相當(dāng)于標(biāo)記FAM的DNA絕大多數(shù)形成了折疊結(jié)構(gòu)全部游離在溶液中狀態(tài)。三聚氰胺在體系中的終濃度分別為0、10、30、50、100、300、600、800、1 000、1 200、1 500、1 800、2 000、2 300 nM。

圖4 不同濃度三聚氰胺對(duì)應(yīng)的熒光曲線

2.5 傳感器的特異性評(píng)價(jià)

評(píng)價(jià)設(shè)計(jì)的納米探針檢測(cè)的特異性，研究了牛奶制品中常見(jiàn)干擾葡萄糖、麥芽糖、果糖及與三聚氰胺有結(jié)構(gòu)相似的賴氨酸、酪氨酸分子對(duì)目標(biāo)物的干擾。試驗(yàn)證明，納米探針能與低濃度的三聚氰胺特異性結(jié)合產(chǎn)生較大的熒光恢復(fù)，而對(duì)高出幾十倍濃度（10 mM）的葡萄糖、麥芽糖、果糖、賴氨酸、酪氨酸熒光響應(yīng)極小，說(shuō)明納米探針的富T序列對(duì)三聚氰胺具有很好的選擇性，該探針檢測(cè)三聚氰胺的特異性良好，見(jiàn)圖5。

圖5 探針的特異性實(shí)驗(yàn)

2.6 實(shí)際樣品的檢測(cè)

乳制品基質(zhì)相對(duì)于水相體系，主要是去除蛋白質(zhì)類雜質(zhì)對(duì)三聚氰胺檢測(cè)的干擾，因此選用1%的三氯乙酸對(duì)樣品進(jìn)行簡(jiǎn)單預(yù)處理，以沉淀乳制品中的蛋白質(zhì)。通過(guò)在不同種類市售乳制品添加500 nM濃度的三聚氰胺進(jìn)行檢測(cè)加標(biāo)回收，結(jié)果見(jiàn)附表。經(jīng)預(yù)處理后的乳制品上機(jī)檢測(cè)后，可見(jiàn)加標(biāo)樣品的回收率為76%～119%，且重現(xiàn)性良好。該探針對(duì)奶粉中三聚氰胺的檢測(cè)下限可達(dá)10 nM，遠(yuǎn)低于我國(guó)規(guī)定的乳制品中三聚氰胺含量≤1 mg·kg-1的要求，可應(yīng)用于實(shí)際乳制品中三聚氰胺的檢測(cè)，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

附表 樣品的回收率測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

本研究利用堿基胸腺嘧啶（T）與三聚氰胺（Melamine）的特異性結(jié)合的原理，設(shè)計(jì)了一種由熒光標(biāo)記的富T-DNA分子與氧化石墨烯后組裝的納米熒光探針。利用氧化石墨烯對(duì)單雙鏈DNA作用力的差異，造成的標(biāo)記熒光染料的猝滅程度的不同，實(shí)現(xiàn)對(duì)三聚氰胺的特異性檢測(cè)。該探針的設(shè)計(jì)合成簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、成本低且有較高的靈敏度，線性響應(yīng)濃度范圍50～1 000 nM，并且可成功用于牛奶、乳飲料、奶粉等乳制品中三聚氰胺的檢測(cè)，在食品安全領(lǐng)域?qū)⒂袕V闊的應(yīng)用前景。本方法省時(shí)省力，無(wú)需使用大型的昂貴的儀器，為三聚氰胺的檢測(cè)提供一種便捷實(shí)用的方法。