微?；鞍讓λ峄T導(dǎo)大豆蛋白凝膠性質(zhì)的影響

文/王 軍 吳達雄 林少寶 郭 健 楊曉泉 許嘉偉 黎恒希

（1 廣州風(fēng)行乳業(yè)股份有限公司；2 華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院）

隨著生活水平的提高，人們越來越注重飲食的營養(yǎng)與健康，不論消費者還是食品行業(yè)從業(yè)人員，對于蛋白質(zhì)的認(rèn)識不僅僅滿足于裹腹所需，如今已轉(zhuǎn)變?yōu)椤敖∩怼⑺苌怼⒔鉀Q饑餓、保持骨骼和肌膚健康”這樣一個更全面、更科學(xué)的概念[1，2]。

酸奶由于口感獨特、品類豐富多樣以及營養(yǎng)健康等特點，受到了眾多消費者的青睞。據(jù)報道，酸奶可以減少慢性疾病如肥胖癥、Ⅱ型糖尿病和心血管疾病的發(fā)病率，并且會對腸道微生物產(chǎn)生有益影響[3～6]。追求健康成為驅(qū)動消費者購買酸奶的重要因素之一。在中國，酸奶呈現(xiàn)出非常強勁的發(fā)展態(tài)勢，新品占比從2012年的不到20%，增長至2016年的近30%，特別是2015～2016年的增長率近50%。酸奶發(fā)展的一個關(guān)鍵趨勢是增加蛋白質(zhì)含量，消費者追求蛋白質(zhì)含量的潮流帶動了希臘酸奶和冰島酸奶的火熱發(fā)展，各大品牌也相繼推出各式各樣的高蛋白酸奶。近幾年，全球酸奶市場上出現(xiàn)了很多植物基酸奶，植物酸奶的蛋白質(zhì)來源越來越多樣化，這也將是乳品企業(yè)發(fā)展的機會點之一。因此，將經(jīng)過剪切及熱處理制得的具有惰性表面、弱成膠性能及微米尺度的微粒化蛋白[7，8]添加到酸奶體系中，在提高蛋白質(zhì)含量的同時賦予酸奶細膩、嫩滑的口感，具有重要的研究意義。

葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯（glucono-delta-lactone，GDL）在食品中常被用作酸化劑，易溶于水并在水溶液中緩慢水解產(chǎn)生葡萄糖酸，導(dǎo)致溶液pH值緩慢降低。當(dāng)GDL存在于蛋白質(zhì)分散液中，隨著GDL不斷水解，體系pH值向蛋白質(zhì)等電點靠近，蛋白質(zhì)分子表面的電荷也隨之減少。在分子間斥力降低的情況下，蛋白質(zhì)彼此靠近并發(fā)生聚集；隨著pH值進一步降低，蛋白質(zhì)的聚集程度提高并最終形成凝膠[9，10]。本文以大宗農(nóng)產(chǎn)品副產(chǎn)物——大豆分離蛋白（SPI）為原料，采用GDL酸化模擬酸奶的發(fā)酵過程，以此研究微?；鞍讓Φ鞍踪|(zhì)凝膠形成過程和凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響，探討將微?；鞍讘?yīng)用于植物基酸奶食品體系中的可能性。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

低溫脫脂大豆粕；微?；榍宓鞍?；葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯（GDL）；異硫氰酸熒光素酯（Fluorescein isothiocyanate isomer，F(xiàn)ITC）；氫氧化鈉、鹽酸，均為分析純；實驗用水均為去離子水。

1．2 試驗儀器

頂置式攪拌器RW20（德國IKA公司）；分散均質(zhì)機T25（德國IKA公司）；高壓微射流均質(zhì)機（美國MFIC公司）；旋轉(zhuǎn)流變儀RheoStress 600（美國Thermo Fisher公司）；萬能材料試驗機5943（美國INSTRON公司）；紫外分光光度計Genesys 10 s（美國Thermo Fisher公司）；臺式掃描電子顯微鏡TM 3000（日本Hitachi公司）；倒置生物顯微鏡IX53（日本Olympus公司）。

1．3 大豆分離蛋白（SPI）的制備

將低溫脫脂大豆粕粉碎后過60 目篩，得到的粉末以1∶10（質(zhì)量/體積）的比例與去離子水混合。以2 N（克當(dāng)量，下同）氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至8.0，室溫下攪拌2 h，8 000 r/min離心20 min。取上清液，以2 N鹽酸調(diào)pH值至4.5，隨后再次8 000 r/min離心20 min。取沉淀復(fù)溶于水中，回調(diào)pH值至7.0，置于去離子水中透析48 h后冷凍干燥，獲得大豆分離蛋白（SPI）。

1．4 酸誘導(dǎo)蛋白凝膠的制備

將SPI和微?；榍宓鞍追謩e用去離子水配制成分散液，調(diào)節(jié)pH值為7.0，將兩者按不同的比例混合（樣品中總蛋白質(zhì)含量為10%），然后在90 ℃水浴中靜置20 min，冷卻至室溫后加入GDL溶液（終濃度為100 mg/g蛋白質(zhì)），輕微攪拌混合均勻后放置在40 ℃水浴中使其形成凝膠。

1．5 凝膠的流變學(xué)特性分析

取1 mL加入了GDL的蛋白質(zhì)分散液置于旋轉(zhuǎn)流變儀樣品臺上，選用平行板（直徑為35 mm）進行測試，記錄樣品在酸化成膠過程中彈性模量G'及黏性模量G''的變化（頻率為1 Hz，應(yīng)變?yōu)?%），隨后對樣品進行頻率掃描（0.1～100 Hz，應(yīng)變?yōu)?%）和應(yīng)變掃描（頻率為1 Hz）。

1．6 凝膠的機械特性分析

采用萬能材料試驗機對蛋白凝膠進行壓縮測試。將酸化制得的凝膠切成直徑5 mm、高10 mm的圓柱體，選用直徑為25 mm的探頭，測試前、后速度均為1 mm/s，測試速度為0.2 mm/s，凝膠壓縮程度為80%，觸發(fā)力0.1 g。Hencky應(yīng)變（∈h）和應(yīng)力（σ）分別根據(jù)式（1）和（2）計算，斷裂應(yīng)變（εf）和斷裂應(yīng)力（σf）是應(yīng)力-應(yīng)變曲線的最高峰點，楊氏模量是應(yīng)力-應(yīng)變曲線中初始線性區(qū)域的斜率，通過線性回歸得到，用來反映凝膠的剛性。式中h0和A0分別是測試凝膠的原始高度和面積；h（t）和F（t）是凝膠在t時間的高度和受到的力。

1．7 凝膠的微觀形貌觀察

把制備好的凝膠用2.5%戊二醛溶液（含20 mmol/L pH值7.0的磷酸鹽緩沖液）固定過夜，磷酸鹽緩沖液漂洗3 次后，用不同濃度的乙醇對凝膠進行梯度脫水（30%～100%，每個濃度乙醇均停留10 min），在通風(fēng)櫥風(fēng)干后切片，用導(dǎo)電雙面膠固定在樣品臺上，使用離子濺射儀對其表面進行噴金處理（噴金時電流設(shè)置為20 mA，時間為45 s），然后將樣品放入樣品室，以15 kV電壓進行觀察并拍照。

1．8 凝膠的持水性分析

準(zhǔn)確稱取1.0 g加入了GDL的蛋白質(zhì)分散液，置于2 mL離心管中，靜置6 h等待其成膠，4 000 r/min離心20 min，用濾紙小心吸干凝膠表面水分，通過凝膠離心前后的質(zhì)量差異計算得出凝膠持水性（WHC），見式（3），其中M1為凝膠離心前的質(zhì)量，M2為凝膠離心后的質(zhì)量。

2 結(jié)果與討論

2．1 酸化誘導(dǎo)成膠的流變學(xué)特性分析

食品的流變學(xué)特性在很大程度上決定其口感，并影響消費者對于食品的可接受程度[11，12]。本文將微?；鞍滋娲糠諷PI制備GDL誘導(dǎo)的蛋白凝膠（蛋白質(zhì)總濃度為10%，其中微?；鞍追謩e占0%、2%、4%、6%、8%和10%）。酸化誘導(dǎo)蛋白凝膠的外觀圖片（圖1）直觀地表明凝膠隨著微?；鞍滋娲康脑黾佣饾u被弱化。當(dāng)微粒化蛋白的添加量為8%時，凝膠呈現(xiàn)軟塌不堅實狀態(tài)，已經(jīng)不能保持自支持圓柱體形狀，當(dāng)微?；鞍椎奶砑恿繛?0%時，蛋白質(zhì)分散液經(jīng)GDL誘導(dǎo)后仍具有流動性，不形成凝膠。

圖1 以不同微?；鞍滋娲频盟峄疭PI凝膠的外觀

圖2 酸化誘導(dǎo)SPI/微粒化蛋白體系的成膠動力學(xué)分析

圖3 酸化誘導(dǎo)SPI/微?；鞍左w系的頻率掃描分析

為此，本文選取微?；鞍滋娲繛?%～6%的復(fù)合蛋白質(zhì)樣品，觀察其成膠動力學(xué)過程（圖2），結(jié)果顯示，各體系的模量在酸化過程中均呈上升趨勢；隨著微?；鞍滋娲吭黾?，最終所成凝膠的彈性模量和黏性模量則呈顯著下降趨勢；而只含有微?；鞍椎捏w系在GDL酸化過程中，體系的彈性模量和黏性模量都沒有超過10 Pa，未能形成凝膠。凝膠的頻率掃描結(jié)果（圖3）顯示，當(dāng)微粒添加量為0%和2%時，凝膠表現(xiàn)出較弱的頻率依賴性，具有較高的凝膠強度；隨著微?；鞍滋娲吭黾?，模量降低且頻率依賴性下降，凝膠減弱至不形成凝膠。這表明，微粒化蛋白的加入明顯弱化凝膠的強度，且隨著替代程度提高，凝膠的強度降低。

在凝膠的線性黏彈區(qū)域內(nèi)，彈性模量與應(yīng)變無關(guān)，不隨應(yīng)變而變化，超出這個區(qū)域是凝膠的非線性黏彈區(qū)域，凝膠的彈性模量隨應(yīng)變增大而呈下降趨勢。凝膠的彈性行為是由其網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)決定的，GDL誘導(dǎo)蛋白凝膠的應(yīng)變掃描（圖4）顯示，不同微?；鞍滋娲恐苽涞哪z具有不同的線性黏彈區(qū)域；隨著微?；鞍滋娲吭黾?，凝膠的彈性變?nèi)酰辉谕瑯油饬ψ饔孟?，由微?；鞍撞糠痔娲鶶PI形成的凝膠更容易斷裂。因此，可以通過添加不同量的微粒化蛋白達到調(diào)控蛋白凝膠組織結(jié)構(gòu)的目的，從而開發(fā)出易被大眾接受的食品或滿足特定人群的口感需求。

2．2 酸化誘導(dǎo)蛋白凝膠的機械性能

為了考察GDL酸化誘導(dǎo)蛋白凝膠的機械特性，對以微?；鞍撞糠痔娲鶶PI體系所成凝膠進行單向壓縮測試（圖5）。壓縮曲線出現(xiàn)的第1個峰值稱為屈服極限點，表示承受外力到一定程度時，其變形不再與外力成正比而產(chǎn)生明顯的塑性變形，當(dāng)外力繼續(xù)增大到材料破壞時的應(yīng)力，稱為材料的強度極限。屈服極限和強度極限分別表示材料抵抗破壞和抵抗塑性變形的能力，楊氏模量用以表示凝膠的剛性。

表1結(jié)果顯示，隨著微?；鞍滋娲吭黾樱z的斷裂應(yīng)變從0.87降低至0.58，斷裂應(yīng)力從13.62 kPa降低至3.9 kPa，說明加入微?；鞍缀?，蛋白凝膠抵抗破壞和抵抗塑性變形的能力下降，即在外力作用下，凝膠結(jié)構(gòu)容易被破壞。此外，凝膠的楊氏模量也從26.58 kPa降低至10.92 kPa，表明蛋白凝膠的剛性也出現(xiàn)很大程度的降低。

表1 酸化誘導(dǎo)SPI/微?；鞍左w系所成凝膠的機械特性

圖4 酸化誘導(dǎo)SPI/微?；鞍左w系的應(yīng)變掃描分析

圖5 酸化誘導(dǎo)SPI/微?；鞍左w系所成凝膠的應(yīng)力-應(yīng)變曲線

流變學(xué)分析及機械性能的數(shù)據(jù)均表明，微?；鞍椎募尤肟娠@著弱化大豆蛋白在酸化過程中形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)。這是由于微?；鞍捉?jīng)剪切處理后，其疏水基團內(nèi)卷，表面用于蛋白質(zhì)聚集的位點減少；將其加入至SPI體系后，阻礙了大豆蛋白聚集體間形成相互作用，進而影響了所成的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。壓縮測試進一步證明加入微?；鞍缀螅鞍啄z變得容易被咀嚼，微粒化蛋白可用于調(diào)控蛋白質(zhì)基食品的質(zhì)構(gòu)。

圖6 酸化誘導(dǎo)SPI/微?；鞍左w系所成凝膠的持水性分析

2．3 酸化誘導(dǎo)蛋白凝膠的持水性分析

圖6結(jié)果顯示，加入微粒化蛋白不僅能弱化凝膠強度，也對凝膠的持水性有所影響。隨著微粒化蛋白替代量從0%提高至6%，凝膠持水性從47%下降至28%。持水性對于酸奶及凝膠類食品的保藏品質(zhì)、口感等均有較大影響。微?；鞍纂m然可以在提高產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量的同時弱化體系的機械強度，提供良好口感，但也會對產(chǎn)品的持水性產(chǎn)生不利影響。

2．4 酸化誘導(dǎo)蛋白凝膠的微觀形貌觀察

圖7 酸化誘導(dǎo)SPI/微?；鞍左w系所成凝膠的掃描電鏡圖片

圖8 微粒化蛋白在酸化過程中微觀形貌變化

凝膠的網(wǎng)絡(luò)強度及持水性與其微觀結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)。為此，本文將凝膠用戊二醛固定干燥后利用掃描電鏡觀察其微結(jié)構(gòu)（圖7）。當(dāng)沒有添加微?；鞍讜r，GDL誘導(dǎo)形成SPI凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)致密而規(guī)則有序，因而具有相對較強的機械性能；在此有序的結(jié)構(gòu)中，水分可被束縛在其致密的空間網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部，不易流失，因而該凝膠的持水性較好。添加微?；鞍椎哪z網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)則呈現(xiàn)不一樣的狀態(tài)，致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)消失，球狀顆粒清晰可見，鑲嵌于SPI所成網(wǎng)絡(luò)之中。隨著微?；鞍滋砑恿康脑黾?，在凝膠中可以觀察到的微粒數(shù)量也隨之增加。微?；鞍自谀z中仍以微粒形式存在，不與其他微?；虻鞍踪|(zhì)發(fā)生交聯(lián)作用，表明微?；鞍卓梢宰鳛楦叩鞍资称分械慕Y(jié)構(gòu)破碎塊，破壞SPI所成的凝膠網(wǎng)絡(luò)。同時，隨著微?；鞍椎募尤耄蠖沟鞍啄z內(nèi)部規(guī)則有序的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞，結(jié)構(gòu)疏松，孔隙增大，凝膠強度降低的同時，截留水分子的能力也降低。

蛋白質(zhì)冷致凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成是一個逐漸完善的過程，在GDL酸化過程中，由于靜電斥力減小，大豆蛋白彼此靠近并發(fā)生聚集，最終形成相互連接的凝膠網(wǎng)絡(luò)。為了探究蛋白質(zhì)微粒在凝膠形成過程中的作用，本文以FITC標(biāo)記微?；鞍祝捎脽晒怙@微鏡記錄微?；鞍自谒峄^程中的微觀形貌變化（圖8）。在4 h的酸化過程中，體系pH值從7.12逐漸下降至5.27，且酸化速度逐漸降低。圖8顯示，微?；鞍椎男蚊苍诖诉^程中沒有發(fā)生明顯變化，一直保持完整的球狀外觀，顆粒尺度也沒有顯著增加；顆粒彼此之間也沒有發(fā)生聚集或交聯(lián)，表明微粒化蛋白在凝膠形成過程中獨立存在，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。因此，微粒化蛋白可以作為良好的惰性填充材料應(yīng)用于酸奶食品體系中，并起到弱化凝膠網(wǎng)絡(luò)的作用。

3 結(jié)論

本文采用GDL酸化來模擬酸奶的發(fā)酵過程，以微?；鞍滋娲糠諷PI，并經(jīng)過GDL酸化誘導(dǎo)制備凝膠。在此過程中，微粒化蛋白沒有發(fā)生顯著變化，仍然保持其球狀外貌，沒有參與大豆蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成。酸致凝膠的流變學(xué)分析及機械性能測試結(jié)果表明，該網(wǎng)絡(luò)的強度被顯著弱化，其持水性也有所降低。這表明，微粒化蛋白可在植物基酸乳食品體系中應(yīng)用，能夠提高產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量的同時，賦予其良好的口感。