防逆流納米Ag-CHA-SiO2抗菌型導(dǎo)尿管體外生物安全性研究

孫 欣，趙 吟，裴澤軍

（無(wú)錫市第二人民醫(yī)院，江蘇無(wú)錫 214002）

0 引言

導(dǎo)尿管是目前臨床使用非常廣泛的一種醫(yī)用人體植入物，其在住院患者中的使用率約25%。而導(dǎo)尿管相關(guān)性尿路感染（catheter-associated urinary tract infections，CAUTI）隨之成為臨床治療過(guò)程中常見(jiàn)的一個(gè)棘手問(wèn)題。根據(jù)Johnson等[1]的統(tǒng)計(jì)，美國(guó)CAUTI患者占醫(yī)院獲得性感染的40%，位居醫(yī)院獲得性感染的第二位，僅次于呼吸系統(tǒng)感染；美國(guó)每年CAUTI患者超過(guò)100萬(wàn)例，占醫(yī)院獲得性尿路感染的80%。在我國(guó)，CAUTI患者占醫(yī)院獲得性感染的37.3%～56.0%，其中2%～4%的患者誘發(fā)為菌血癥和（或）敗血癥，其病死率高達(dá)13%～30%[2]。因此，CAUTI不僅給患者帶來(lái)巨大的痛苦，還給患者的生命與健康帶來(lái)潛在的威脅，此外，也無(wú)形中對(duì)衛(wèi)生資源產(chǎn)生很大的消耗。為此，課題組創(chuàng)新性設(shè)計(jì)研發(fā)了防逆流納米Ag-CHA-SiO2（銀離子-醋酸氯己定-二氧化硅）抗菌型導(dǎo)尿管（以下簡(jiǎn)稱“抗菌型導(dǎo)尿管”），以杜絕CAUTI的發(fā)生，切實(shí)保障患者安全?，F(xiàn)對(duì)其體外抑菌能力與細(xì)胞毒性進(jìn)行研究，以評(píng)價(jià)其體外生物安全性，為后期產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化與開(kāi)發(fā)做好準(zhǔn)備。

1 儀器與材料

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料與試劑

新西蘭雄兔[浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（浙）2013-0055]，大腸桿菌（ATCC11229），金黃色葡萄球菌（ATCC6538），DMEM/F12培養(yǎng)液（Gibco，批號(hào)8117196），胎牛血清（fetalbovine serum，F(xiàn)BS；四季青 11011-8611），普通 F8 醫(yī)用導(dǎo)尿管（以下簡(jiǎn)稱“普通導(dǎo)尿管”，廣州維力醫(yī)療器械股份有限公司，5.3mm（16FR）15ml，批號(hào) 20160601），醋酸氯己定（Aladdin，批號(hào)F1606020），硝酸銀（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20160704），納米二氧化硅（先豐納米，XF105，批號(hào)100365），四甲基偶氮唑鹽（MTT）試劑盒（KeyGE-NBio-TECH Cat.NO：KGA312，批號(hào) 20170303）。

1.1.2 試驗(yàn)儀器

酶標(biāo)儀：廠商Molecular Devices，型號(hào)SpectraMax M4；恒溫CO2培養(yǎng)箱：廠商Thermo，型號(hào)HEPA CLASS100；顯微鏡：廠商 OLYMPUS，型號(hào) CKX41。

1.2 兔尿道上皮細(xì)胞的制備

新西蘭雄兔行全麻術(shù)，以膀胱組織活檢鉗夾取尿道球部腹側(cè)壁黏膜組織剪取0.4 cm×0.3 cm，迅速置入預(yù)先裝有青霉素+鏈霉素的D-hank's液，黏膜組織漂洗 2～3 遍，浸入 DispaseⅡ液（2.4 U/ml），靜置 30 min予以消化。分離提取上皮層并充分剪碎，以胰酶消化，振蕩15~20 min，加適量的D-hank's液，離心5 min（1 000 r/min），移除離心液，加D-hank's液吹打使其為單細(xì)胞懸液，用200目篩網(wǎng)一次性過(guò)濾，接種入T25培養(yǎng)瓶，加入DMEM/F12培養(yǎng)液，排除混雜細(xì)胞（采用差速貼壁法）。然后置于5%CO2培養(yǎng)箱37℃恒溫培養(yǎng)，2 d換液1次，當(dāng)細(xì)胞增殖至70%～80%融合時(shí)以1∶3傳代培養(yǎng)。

1.3 樣品浸提液的制備

將普通導(dǎo)尿管、抗菌型導(dǎo)尿管分別進(jìn)行紫外線照射滅菌，分別隨機(jī)截取2 cm，以6 cm2/ml的比例加入浸提液，于5%CO2培養(yǎng)箱37℃條件下浸提24 h，浸提介質(zhì)為含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，浸提后原液經(jīng)一次性過(guò)濾器過(guò)濾除菌后，用于細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1MTT法

依據(jù)GB/T 16886.5—2017《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)》進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察與MTT 試驗(yàn)[3]。

2.1.1 細(xì)胞形態(tài)觀察

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的兔子尿道上皮細(xì)胞，用胰蛋白酶進(jìn)行消化，制成105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，用96孔型培養(yǎng)板接種，細(xì)胞貼壁后換液，用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液（陰性對(duì)照組）及抗菌型導(dǎo)尿管浸提液（樣品組）、普通導(dǎo)尿管浸提液培養(yǎng)細(xì)胞（樣品組），于72 h后顯微鏡倒置觀察，拍取照片。根據(jù)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行毒性評(píng)判[4-5]：

（1）無(wú)毒：細(xì)胞形態(tài)正常，貼壁生長(zhǎng)好，細(xì)胞呈鋪路石狀。

（2）輕度毒性：細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)好，但可見(jiàn)少數(shù)細(xì)胞圓縮，偶見(jiàn)懸浮細(xì)胞。

（3）中度毒性：細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)不佳，細(xì)胞圓縮較多，達(dá)1/3以上，見(jiàn)懸浮死細(xì)胞。

（4）重度毒性：細(xì)胞基本不貼壁，90%以上為懸浮死細(xì)胞。

2.1.2 MTT試驗(yàn)

MTT試驗(yàn)[3]分組：以10%FBS的 DMEM/F12培養(yǎng)液為陰性對(duì)照組，以抗菌型導(dǎo)尿管浸提液、普通導(dǎo)尿管浸提液作為樣品組，每組各平行測(cè)試3份。根據(jù)其試劑盒操作步驟加入MTT，4 h后加入二甲基亞砜（DMSO），取酶標(biāo)儀測(cè)定OD值（490 nm處）并計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率（relative growth rate，RGR）（RGR=樣品組OD值/陰性對(duì)照組OD值×100%）。根據(jù)RGB對(duì)細(xì)胞毒性進(jìn)行分級(jí)[4-5]：99%≤RGR≤100%，細(xì)胞毒性為0級(jí)；75%≤RGR<99%，細(xì)胞毒性為1級(jí)；50%≤RGR<75%，細(xì)胞毒性為2級(jí)；25%≤RGR<50%，細(xì)胞毒性為3級(jí)；1%≤RGR<25%，細(xì)胞毒性為4級(jí)；0≤RGR<1%，細(xì)胞毒性為5級(jí)。0級(jí)和1級(jí)為無(wú)毒性，2級(jí)為輕度毒性或結(jié)合細(xì)胞形態(tài)綜合評(píng)價(jià)，3級(jí)和4級(jí)為中度毒性，5級(jí)為重度毒性；3~5級(jí)為不合格材料。

2.2 抑菌環(huán)試驗(yàn)

根據(jù)WS/T 367—2012《醫(yī)療機(jī)構(gòu)消毒技術(shù)規(guī)范》中的抑菌環(huán)操作規(guī)范[6]，以10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液為陰性對(duì)照，對(duì)抗菌型導(dǎo)尿管、普通導(dǎo)尿管進(jìn)行抑菌環(huán)試驗(yàn)，每組均平行試驗(yàn)3份。

2.2.1 菌種的活化

將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌菌種（4℃保存）接種至新鮮營(yíng)養(yǎng)瓊脂的斜面，置5%CO2培養(yǎng)箱18～24 h，使菌種活化[7]。

2.2.2 菌懸液制備

取典型的單菌落接種于盛有LB培養(yǎng)基的三角瓶中，200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)；1∶100稀釋至新的LB培養(yǎng)基中，200 r/min培養(yǎng)3~4 h使細(xì)菌達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。調(diào)整細(xì)菌濃度至 OD600=0.2±0.02（約 108 cfu/min），完成菌懸液制備[8]。

2.2.3 抑菌板制備

加熱融化培養(yǎng)基并分裝試管，每根試管20 ml。用橡皮塞封口，進(jìn)行121℃高壓蒸汽滅菌20 min，稍冷卻，置于恒溫水浴鍋50℃保溫。在超凈工作臺(tái)上制備抑菌板[7]，每個(gè)培養(yǎng)皿倒入20 ml培養(yǎng)基，將培養(yǎng)皿底部全部覆蓋，吹干冷凝水。凝固后，用滅菌打孔器在制備好的平板上垂直打出3個(gè)孔，每孔直徑約6 mm，3個(gè)孔分布均勻，各孔間隔25 mm，孔洞與培養(yǎng)皿壁之間間隔15 mm，并用滅菌牙簽將瓊脂塊挑出。

2.2.4 菌液涂布

使用經(jīng)滅菌處理的藥棉取100 μl制備好的細(xì)菌菌液均勻涂布在LB瓊脂培養(yǎng)基上[7]，在超凈臺(tái)中自然條件下干燥。

2.2.5 材料選取及測(cè)量

隨機(jī)截取長(zhǎng)1 cm的抗菌型導(dǎo)尿管、普通導(dǎo)尿管插入培養(yǎng)基中，各樣品均平行測(cè)試3份。將培養(yǎng)皿放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，卡尺量取各樣品的抑菌圈直徑。

2.2.6 抗菌性能評(píng)判

（1）陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)抑菌環(huán)；（2）抑菌環(huán)直徑≥7 mm時(shí)（即最外端向外延伸1 mm以上）即判定具有抑菌、抗菌作用；（3）對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有抗菌、抑菌作用，即認(rèn)定該材料具有抗菌、抑菌性能[7]。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞形態(tài)觀察

倒置顯微鏡濾光片顯色觀察發(fā)現(xiàn)，樣品組及陰性對(duì)照組72 h時(shí)后細(xì)胞均明顯增多，細(xì)胞呈正常的多變長(zhǎng)卵形鋪路石狀，排列規(guī)則密集，未見(jiàn)懸浮死細(xì)胞。普通導(dǎo)尿管浸提液及陰性對(duì)照組未見(jiàn)圓縮細(xì)胞，抗菌型導(dǎo)尿管浸提液偶見(jiàn)圓形細(xì)胞，如圖1～3所示。

圖1 抗菌型導(dǎo)尿管浸提液細(xì)胞形態(tài)圖（100×）

圖2 普通導(dǎo)尿管浸提液細(xì)胞形態(tài)圖（100×）

圖3 陰性對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)圖（100×）

3.2 MTT檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的OD值計(jì)算抗菌型導(dǎo)尿管浸提液、普通導(dǎo)尿管浸提液RGR分別為92.0%、99.5%。結(jié)合細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果，抗菌型導(dǎo)尿管浸提液、普通導(dǎo)尿管浸提液MTT試驗(yàn)分級(jí)分別為1級(jí)、0級(jí)，具體見(jiàn)表1。

表1 MTT法檢測(cè)兔尿道上皮細(xì)胞OD值、RGR和細(xì)胞毒性分級(jí)（n=3）

3.3 抑菌環(huán)試驗(yàn)結(jié)果

抗菌型導(dǎo)尿管對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為（11.24±0.54）、（7.63±0.34）mm，均＞7 mm，有抑菌、抗菌作用；普通導(dǎo)尿管對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑均為（6.00±0.00）mm，均＜7 mm，無(wú)抑菌作用。2種導(dǎo)尿管對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果對(duì)比如圖4、5所示。

圖4 2種導(dǎo)尿管對(duì)大腸桿菌的抑菌效果對(duì)比圖

圖5 2種導(dǎo)尿管對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果對(duì)比圖

4 討論

細(xì)胞毒性試驗(yàn)是目前一致認(rèn)可的有效評(píng)價(jià)材料生物相容性的方法[9]。其中MTT法因其靈敏、客觀、重現(xiàn)性好而成為金標(biāo)準(zhǔn)[10]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察比較圖1~3細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)可知，樣品組與陰性對(duì)照組比較，細(xì)胞形態(tài)均生長(zhǎng)正常，僅抗菌型導(dǎo)尿管浸提液細(xì)胞緊密度略低，并偶見(jiàn)圓形細(xì)胞。細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)與MTT檢測(cè)結(jié)果表明，抗菌型導(dǎo)尿管浸提液為1級(jí)、普通導(dǎo)尿管浸提液為0級(jí)，均判定為無(wú)毒性材料。

抑菌環(huán)試驗(yàn)結(jié)果顯示，普通導(dǎo)尿管對(duì)大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑均為（6.00±0.00）mm，＜7 mm，無(wú)抑菌作用。抗菌型導(dǎo)尿管對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑達(dá)（11.24±0.54）mm，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為（7.63±0.34）mm，均>7 mm，具有抑菌作用。由試驗(yàn)結(jié)果可知，抗菌型導(dǎo)尿管對(duì)大腸桿菌的抑菌效果顯著，但對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果不夠理想。鑒于CAUTI通常以革蘭氏陰性菌感染為主[11]，因此當(dāng)前抗菌型導(dǎo)尿管能對(duì)大部分的CAUTI起到良好的預(yù)防作用，但其仍存在不足，后期應(yīng)該在如何提高對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果上加以改進(jìn)?？紤]到Ag-CHA-SiO2中CHA具有良好的廣譜抗菌作用，后期將著重于研究CHA的含量調(diào)整與釋放度，以使抗菌型導(dǎo)尿管能對(duì)包括金黃色葡萄球菌在內(nèi)的各種微生物起到良好的抑菌作用，達(dá)到廣譜抗菌效果。

此外，抗菌型導(dǎo)尿管創(chuàng)新性地從引起CAUTI的內(nèi)、外2種途徑進(jìn)行了全面防范[12]，對(duì)內(nèi)部利用單向閥杜絕導(dǎo)尿管內(nèi)部逆流污染引起的感染，對(duì)外部則通過(guò)納米Ag-CHA的復(fù)合體進(jìn)行聯(lián)合抗菌，有效地提高了抗菌效果。同時(shí)納米Ag-CHA具有抗菌譜廣、不易產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性等特點(diǎn)，適于長(zhǎng)期使用，安全可靠。

綜上所述，抗菌型導(dǎo)尿管無(wú)細(xì)胞毒性，屬無(wú)毒范疇，為合格生物材料。其生物安全性能符合要求，抑菌性能良好，作用全面，值得進(jìn)行轉(zhuǎn)化推廣，尤其對(duì)部隊(duì)野外操作更有優(yōu)勢(shì)[13]。后續(xù)應(yīng)進(jìn)一步深入開(kāi)展體內(nèi)有效性的研究，同時(shí)進(jìn)一步進(jìn)行有效作用時(shí)間延長(zhǎng)的研究，使其臨床應(yīng)用效果更好，真正造?；颊?。