基于納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)的S100B蛋白新型檢測試劑和儀器的研究

代 晨，王 琦，江繼鵬，杜振華，汪云峰，陳凱歌，陳旭義，戰(zhàn) 麗，張 賽*，靳 穎*

（1.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院腦科中心，武警部隊(duì)腦創(chuàng)傷與神經(jīng)疾病研究所，天津市神經(jīng)創(chuàng)傷修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300162；2.武警北京總隊(duì)十二支隊(duì)衛(wèi)生隊(duì)，天津 300481；3.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300162；4.博奧賽斯（天津）生物科技有限公司，天津 300300；5.武警后勤學(xué)院救援醫(yī)學(xué)系，天津 300162；6.武警后勤學(xué)院教學(xué)考評中心，天津 300162）

0 引言

S100B蛋白是一種鈣離子結(jié)合蛋白，主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)的雪旺細(xì)胞中[1]，被認(rèn)為是腦的特異性蛋白[2]。正常情況下，S100B蛋白很少出現(xiàn)在血液中，顱腦創(chuàng)傷后，S100B蛋白釋放至細(xì)胞外間隙，并通過受損的血腦屏障進(jìn)入腦脊液和血液[3]。S100B蛋白在監(jiān)測顱腦創(chuàng)傷發(fā)展進(jìn)程[4-5]、鑒別顱腦創(chuàng)傷嚴(yán)重程度[6-7]、顱腦創(chuàng)傷的陰性排除[8-9]等方面具有重要的臨床價(jià)值。

S100B蛋白的血清學(xué)檢測方法包括放射免疫分析法、免疫放射測定法、酶聯(lián)免疫吸附法、電化學(xué)發(fā)光法等，目前以酶聯(lián)免疫吸附法為主，但是此方法操作復(fù)雜、耗時(shí)長、自動化困難，制約著S100B蛋白在臨床的廣泛應(yīng)用?；诩{米磁微粒化學(xué)發(fā)光技術(shù)的S100B蛋白檢測方法具有操作簡單、檢測速度快、可實(shí)現(xiàn)自動化等優(yōu)點(diǎn)。目前國內(nèi)此類檢測試劑的相關(guān)報(bào)道較少，因此本文研發(fā)了相關(guān)檢測試劑和儀器。

1 方法

1.1 試劑制備

1.1.1 原理

磁微粒是磁性納米粒子與無機(jī)或有機(jī)分子結(jié)合形成的可均勻分散于一定基液中具有高度穩(wěn)定性的膠態(tài)復(fù)合材料，可通過活性基團(tuán)將免疫檢測中的酶、抗體等相關(guān)成分固定于其表面。納米磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)是以化學(xué)發(fā)光劑為底物的酶免疫技術(shù)，同時(shí)應(yīng)用了納米級磁性微粒做固相載體，增加了吸附面積，使抗原、抗體最大限度結(jié)合[10]，并使其結(jié)合反應(yīng)在近似液相的條件下進(jìn)行，兼具化學(xué)發(fā)光與酶免疫技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。在反應(yīng)過程中引入生物素-親和素系統(tǒng)，即夾心法納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)。夾心法納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)的原理（如圖1所示）：待測抗原同生物素標(biāo)記的抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合形成“三明治”結(jié)構(gòu)的復(fù)合物。隨后加入連有親和素的磁微粒，通過生物素-親和素特異性結(jié)合使抗原、抗體復(fù)合物連接到磁微粒上，在外加磁場中直接沉淀，將免疫反應(yīng)形成的復(fù)合物與其他物質(zhì)分離。去上清后，清洗沉淀的復(fù)合物，加入酶促化學(xué)發(fā)光底物。底物在酶作用下被催化裂解，形成不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)激發(fā)態(tài)中間體回到基態(tài)時(shí)發(fā)出光子，通過光量子閱讀系統(tǒng)記錄光子強(qiáng)度，經(jīng)過計(jì)算機(jī)處理系統(tǒng)將光能量強(qiáng)度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上轉(zhuǎn)換為待測抗原的濃度，并報(bào)告結(jié)果。

圖1 夾心法納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)檢測原理

1.1.2 制備

試劑包括R1、R2、R0試劑和校準(zhǔn)品。

R1[生物素（Biotin）-S100B 蛋白單克隆抗體]試劑的制備：將S100蛋白單克隆抗體用0.02 mol磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）（pH=8.0）進(jìn)行透析，4℃過夜，然后收集抗體，測OD280吸光度值，計(jì)算抗體的濃度；將水溶性的Biotin用純化水稀釋至1 mg/ml；將S100B蛋白抗體與Biotin按照質(zhì)量10∶1的比例進(jìn)行混合，混勻后4℃反應(yīng)30 min；將偶聯(lián)后的抗體用0.02 mol PBS（pH=7.4）透析過夜，每2 h換液1次，透析3次；收集偶聯(lián)物，測OD280吸光度值，計(jì)算偶聯(lián)后的濃度；將交聯(lián)后的復(fù)合物Biotin-S100B蛋白單克隆抗體用R1稀釋液配制成5 μg/ml。

R2[辣根過氧化物酶（HRP）-S100B 蛋白抗體]試劑的制備：稱取5 mg HRP溶解于1 ml蒸餾水中，再加入0.2 ml新配的0.1 mol NaIO4溶液，室溫下避光攪拌20 min；將上述溶液裝入透析袋中，用1 mmol pH 4.4的醋酸鈉緩沖液進(jìn)行透析，4℃過夜；加20 μl 0.2 mol pH 9.5的碳酸鹽緩沖液，使以上醛化HRP的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入5 mg S100B蛋白抗體在1 ml 0.01 mol碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2 h；加0.1 ml新配的4 mg/ml NaBH4液后混勻，4℃下靜置2 h；將上述液體裝入透析袋中，用0.15 mol pH 7.4的PBS進(jìn)行透析，4℃過夜；進(jìn)行收集，測定偶聯(lián)復(fù)合物的蛋白濃度；用R2稀釋液將HRP-S100B蛋白抗體復(fù)合物配制成0.5 μg/ml。

R0試劑的制備：鏈霉親和素與粒徑1 μm的羧基磁珠通過碳二亞胺（EDC）交聯(lián)劑，按照10 mg磁珠交聯(lián)0.3 mg鏈霉親和素的比例，交聯(lián)后用R0稀釋液將交聯(lián)后的磁珠稀釋至0.5 mg/ml。

校準(zhǔn)品的制備：用校準(zhǔn)品稀釋液稀釋S100B蛋白抗原，制備校準(zhǔn)品。

1.2 儀器

1.2.1 原理

化學(xué)發(fā)光免疫分析儀包含免疫反應(yīng)系統(tǒng)和化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)2個(gè)部分。免疫反應(yīng)系統(tǒng)是將發(fā)光物質(zhì)（在反應(yīng)劑激發(fā)下生成激發(fā)態(tài)中間體）直接標(biāo)記在抗原或抗體上?；瘜W(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)在臨床檢驗(yàn)和醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室有廣泛的應(yīng)用[11]，利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)經(jīng)催化劑的催化和氧化劑的氧化，形成激發(fā)態(tài)中間體,當(dāng)這種激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定的基態(tài)時(shí)發(fā)射出光子，采用光電倍增管，由單光子計(jì)數(shù)器檢測并傳輸至放大器，并加高壓電流放大，放大器將模擬電流轉(zhuǎn)化為數(shù)字電流，數(shù)字電流將發(fā)光信號由數(shù)據(jù)線傳輸給計(jì)算機(jī)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品建立的數(shù)學(xué)模型對樣品中的待測物濃度進(jìn)行定量分析,經(jīng)過軟件處理轉(zhuǎn)換成待測物濃度。不使用任何光源，避免了背景光和雜散光的干擾，降低了噪聲，提高了信噪比，可測定納克級或皮克級化學(xué)成分。同時(shí)開發(fā)設(shè)備的管理與控制軟件，采用Windows界面風(fēng)格，與實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)（laboratory information system，LIS）進(jìn)行交換和共享數(shù)據(jù)。

1.2.2 構(gòu)造

檢測儀器主要由試劑模塊、反應(yīng)模塊、清洗模塊、檢測模塊4個(gè)部分組成，具體由試劑盤、樣本盤、磁微粒盤、裝載臺、反應(yīng)盤、清洗盤和檢測盤構(gòu)成，如圖2~4所示。

圖2 S100B蛋白檢測儀器實(shí)物圖

試劑模塊包括試劑盤、樣本盤和磁微粒盤。試劑盤用于存放試劑，提供2~8℃冷藏環(huán)境，具有試劑掃描定位功能；可以實(shí)現(xiàn) 360°旋轉(zhuǎn)，能同時(shí)容納30組試劑位；由步進(jìn)電動機(jī)驅(qū)動，傳動結(jié)構(gòu)為同步帶傳動，精度高、成本低；可以靈活取下，方便試劑保存。樣本盤用于存放待測樣本，可以自動檢測標(biāo)本中的凝塊并探測液面高度；最多支持6個(gè)樣本架，均可作為急診樣本架，每個(gè)樣本架可裝載10個(gè)樣本，支持原采血管上機(jī)；能夠?qū)崿F(xiàn)360°旋轉(zhuǎn)，由步進(jìn)電動機(jī)驅(qū)動，傳動結(jié)構(gòu)為齒輪傳動，精度高、壽命長；樣本針和試劑針雙針一體，位于樣本盤和試劑盤中間，分別用于吸取樣本和試劑。磁微粒盤用于存放磁微粒，儀器運(yùn)行時(shí)，自動混勻磁微粒，其中外圈有8個(gè)小磁珠位（12 ml），內(nèi)圈有1個(gè)大磁珠位（120 ml）；結(jié)構(gòu)緊湊，采用行星齒輪結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)8組磁微粒在機(jī)混勻，同時(shí)參與試劑匹配，中間大容量磁微?？梢詽M足多種試劑需要。

圖3 S100B蛋白檢測儀器各部件示意圖

圖4 S100B蛋白檢測儀器結(jié)構(gòu)原理圖

反應(yīng)模塊包括裝載臺、反應(yīng)盤。裝載臺內(nèi)置反應(yīng)管，樣本、試劑和磁微粒在此處混合，共有2個(gè)反應(yīng)杯盒，每個(gè)反應(yīng)杯盒裝載96個(gè)反應(yīng)管；具備位置記憶、夾管探測及自動跳轉(zhuǎn)功能，包括X軸移動機(jī)構(gòu)、Y軸移動機(jī)構(gòu)和抓手三大部分。反應(yīng)盤用于抗原、抗體和磁珠的孵育，共有90個(gè)反應(yīng)位，具有氣浴恒溫結(jié)構(gòu)[（37±0.5）℃]、被動旋轉(zhuǎn)混勻結(jié)構(gòu)；由步進(jìn)電動機(jī)驅(qū)動，利用同步帶結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定位；同時(shí)在線容納90個(gè)孵育位，37℃精確控溫，實(shí)現(xiàn)全天在機(jī)穩(wěn)定性8%以內(nèi)。

清洗模塊由清洗盤構(gòu)成。將含有磁微粒子的試劑和待測物形成的復(fù)合物從液體中分離出來，依靠永磁鐵吸附磁珠，避免磁珠的損耗；清洗時(shí)自動抖動旋轉(zhuǎn)，保證充分清洗；末端裝載有底物注液針，方便將底物加入清洗盤。清洗盤由轉(zhuǎn)盤、進(jìn)液吐液結(jié)構(gòu)、磁鐵3個(gè)部分組成，轉(zhuǎn)盤負(fù)責(zé)傳動反應(yīng)杯，進(jìn)吐液結(jié)構(gòu)負(fù)責(zé)抽取廢液和吐出洗液，磁鐵部分負(fù)責(zé)收放磁微粒。

檢測模塊由檢測盤構(gòu)成，用于標(biāo)本的檢測，具有密閉的溫控結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，可以實(shí)現(xiàn)恒溫檢測；具有獨(dú)特的回形避光結(jié)構(gòu)，同時(shí)采用知名品牌檢測單元，檢測數(shù)據(jù)精準(zhǔn)。

1.2.3 主要技術(shù)指標(biāo)

（1）反應(yīng)區(qū)溫度控制的準(zhǔn)確性和波動度：反應(yīng)區(qū)溫度控制在（37±0.5）℃范圍內(nèi)，波動度不超過1.0℃。（2）穩(wěn)定性：開機(jī)處于穩(wěn)定工作狀態(tài)后，第4小時(shí)、第8小時(shí)的測試結(jié)果與處于穩(wěn)定工作狀態(tài)初始時(shí)的測試結(jié)果的相對偏倚不超過±10%。批內(nèi)測量重復(fù)性[變異系數(shù)（coefficientofvariation，CV）]≤8%。（3）線性相關(guān)性：在不小于2個(gè)數(shù)量級的濃度范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)r≥0.95。（4）攜帶污染率：≤10-5。（5）工作條件：電源（220±22）V，（50±1）Hz；功率 1 500 W；環(huán)境溫度10～30℃；相對濕度≤80%；大氣壓力85.0～106.0 kPa。

1.2.4 檢測流程

該儀器檢測血清S100B蛋白的流程（如圖5所示）如下：（1）在裝載臺的反應(yīng)管中加入樣本，加樣步驟為：R1試劑50μl+樣本或校準(zhǔn)品25μl+R2試劑50μl，在37℃條件下反應(yīng)10min；加入R0試劑50 μl，在37℃條件下反應(yīng)5min。孵育過程在反應(yīng)盤中進(jìn)行。（2）孵育成功后，在清洗盤中利用磁分離技術(shù)反復(fù)清洗3次，將磁微粒-S100B蛋白復(fù)合物與液體環(huán)境分開，達(dá)到徹底清洗的目的。（3）加入發(fā)光底物液A、B各100 μl，產(chǎn)生光子，通過單光子計(jì)數(shù)器進(jìn)行檢測，30s后讀取發(fā)光值，計(jì)算S100B蛋白的含量。

圖5 檢測流程圖

2 結(jié)果

2.1 試劑

基于納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)研制了檢測血清S100B蛋白的試劑。該試劑具有以下幾個(gè)特點(diǎn)：（1）利用順磁鐵微粒為固相載體，外包被單克隆抗體，增加抗原、抗體的接觸面積及底物發(fā)光面積，提高反應(yīng)靈敏度；采用旋轉(zhuǎn)磁場使磁微粒-S100B蛋白復(fù)合物與雜質(zhì)分離，具有分離速度快、效率高、可重復(fù)性好的特點(diǎn)。（2）使用單克隆抗體，提高反應(yīng)的特異性。引入的生物素-親和素系統(tǒng)具有多級信號放大作用，不增加非特異性干擾，具有特異性好、穩(wěn)定性高、實(shí)用性強(qiáng)、實(shí)驗(yàn)成本低的優(yōu)點(diǎn)。（3）在液相反應(yīng)中，使用發(fā)光增強(qiáng)劑，將水分子從發(fā)光底物的發(fā)光位點(diǎn)排開，減少干擾，同時(shí)還可縮短發(fā)光的達(dá)峰時(shí)間，提高檢測速度。（4）該檢測方法所需標(biāo)本量少，磁微粒綠色環(huán)保，無放射性污染。

2.2 磁微粒全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀器

設(shè)計(jì)并制造了磁微粒全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀器，該儀器有自動稀釋、準(zhǔn)確加樣、恒溫反應(yīng)等功能，可滿足隨機(jī)、批量、急診檢測模式；具有反應(yīng)盤被動混勻結(jié)構(gòu)，利于抗原、抗體和磁珠的孵育；具有清洗位旋轉(zhuǎn)震蕩清洗功能，使清洗更徹底，檢測結(jié)果更準(zhǔn)確；具有樣本針、試劑針雙針設(shè)計(jì)，凝塊和液面自動探測，試劑恒溫冷藏等多種功能；設(shè)備的管理與控制軟件穩(wěn)定性強(qiáng)、操作簡單、擴(kuò)充性強(qiáng)，符合實(shí)驗(yàn)室的業(yè)務(wù)工作流程需要。

2.3 臨床實(shí)驗(yàn)

選取2017年12月至2018年2月某醫(yī)院16例顱腦創(chuàng)傷住院患者，入院即刻采集患者靜脈血4 ml，3 000 r/min離心10 min，獲得血清樣本，每例樣本分為2份，分別采用本文研究的試劑和檢測儀器（方法一）、羅氏S100B蛋白檢測試劑和Elecsys2010設(shè)備（方法二）進(jìn)行測試，結(jié)果見表1。使用Pearson相關(guān)系數(shù)分析2種檢測方法的相關(guān)性（如圖6所示），r值為 0.959，P＜0.01，2種測試方法相關(guān)性好。

表1 2種方法檢測S100B蛋白結(jié)果ng/ml

圖6 2種檢測方法檢測S100B蛋白的相關(guān)性

3 結(jié)語

S100B蛋白對顱腦創(chuàng)傷的診斷有重要參考價(jià)值，可以優(yōu)化該類患者的檢查流程，減少輕型顱腦創(chuàng)傷患者接受輻射的劑量，節(jié)約醫(yī)療資源，降低醫(yī)療費(fèi)用。在瑞典，S100B蛋白被納入顱腦創(chuàng)傷指南：低風(fēng)險(xiǎn)輕型顱腦創(chuàng)傷患者受傷6 h內(nèi)，如血清S100B蛋白＜0.1 ng/ml，可先進(jìn)行臨床觀察[8]。美國急診醫(yī)師學(xué)會的指南亦推薦，創(chuàng)傷后4 h內(nèi)血清S100B蛋白＞0.1 ng/ml為頭顱CT檢查的最佳適應(yīng)證[12]。國內(nèi)研究也表明，血清S100B蛋白含量越高，顱腦創(chuàng)傷越嚴(yán)重，預(yù)后越差，血清S100B蛋白測定可作為判斷顱腦創(chuàng)傷嚴(yán)重程度及預(yù)后的重要指標(biāo)，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值[13]?；诩{米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的S100B蛋白檢測方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、線性范圍寬、簡單快速、可重復(fù)性好、安全無毒等優(yōu)點(diǎn)；檢測儀器穩(wěn)定可靠，可以提供樣本的快速、批量檢測，自動化程度高。盡管該檢測目前尚未被廣泛應(yīng)用于臨床工作中，但相信該檢測試劑及儀器的國產(chǎn)化，可以為臨床診斷和科研工作提供可靠的檢測方法。