HPLC法快速測定良附丸中高良姜素和α-香附酮的含量

朱鏈鏈，王麗瓊

（1樂山職業(yè)技術學院藥學系；2樂山市食品藥品檢驗檢測中心，四川樂山 614000）

良附丸主治溫胃理氣。用于寒凝氣滯，腕痛吐酸，胸腹脹滿。有研究顯示對胃脘痛的治愈率高[1]，能提高脾胃虛寒型消化性潰瘍的治療效果[2]，化療聯(lián)合加味良附丸可提高晚期胃癌患者的生活質(zhì)量[3-4]。處方為高良姜和醋香附兩味藥材。高良姜的主要成分有高良姜素、槲皮素、異鼠李素和山奈素，其中，高良姜素含量最高[5-6]，《中國藥典》2015 年版一部“高良姜”藥材以“高良姜素”為含量控制指標。盧君蓉等建立了良附丸的HPLC 指紋圖譜評價體系[7-8]，魏娜等對高良姜正丁醇萃取部位化學成分進行研究[9]，陳凌霄等采用頂空固相-微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析比較鮮/干高良姜揮發(fā)性成分[10]。揮發(fā)油為香附的主要活性成分[11]。陳雅蘭等[12]、曹慶璽等[13]、陳華師等[14]、韓曉萍等[15]、王紅等[16]、王浩浩等[17]、呂霞等[18]等對香附及其制劑的研究中均以α-香附酮為指標。綜上，高良姜素和α-香附酮是良附丸的主要質(zhì)量指標，現(xiàn)行標準[19]鑒別項采用高良姜對照藥材薄層對比，含量測定采用HPLC法控制α-香附酮含量，標準還不夠完善，缺少高良姜的控制內(nèi)容。本文采用常規(guī)C18柱，簡單二元流動相等度洗脫，直接超聲提取，建立快速測定良附丸中高良姜素和α-香附酮含量的質(zhì)量控制方法，為有效快速控制良附丸質(zhì)量提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent 1260 高效液相色譜儀，DAD 檢測器(美國)；XS205梅特勒-托利多電子天平(瑞士)；CQ-100B超聲波清洗機(上海躍進醫(yī)用光學器械廠)；16K臺式離心機(珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司)。

圖1 對照品溶液(A)和良附丸(B)色譜圖

對照品高良姜素（Lot:DST170215-020，≥99%，成都德思特生物技術有限公司）、α-香附酮對照品(110748-201513，中國食品藥品檢定研究院，99.7%)。良附丸(市售，批號17081049 CC、17081104 KP、1708105 CC)。甲醇（色譜純，分析純），磷酸（分析純）試驗用水（純化水）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters XTerra C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)；以甲醇-0.05%磷酸溶液(70∶30)為流動相；檢測波長：249 nm；進樣量：10 μL；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃。對照品溶液和供試品溶液的色譜圖見圖1，高良姜素、α-香附酮與相鄰峰分離度符合要求。

2.2 對照品溶液制備

取對照品高良姜素48.62 mg和對照品α-香附酮11.64 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品貯備溶液；精密吸取對照品貯備溶液1 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取本品，粉碎，取粉末約1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理60 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得。

2.4 定量限試驗

分別精密稱取高良姜素和α-香附酮對照品，加甲醇使溶解并稀釋制成系列濃度的溶液，按“2.1”方法進樣分析。根據(jù)信噪比（S/N）=10，得兩組分定量限分別為0.27 μg/mL和0.13 μg/mL。

2.5 線性與范圍考察

精密吸取“2.2”對照品溶液1 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為線性第一點溶液；精密吸取“2.2”對照品溶液2 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為線性第二點溶液；分別精密量取“2.2”對照品貯備溶液2、4、8 mL，分別置10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得線性系列濃度的標準溶液；精密量取線性第一點溶液、線性第二點溶液、對照品溶液和線性系列濃度的標準溶液共6個溶液各10 μL，照“2.1”色譜條件測定峰面積。分別以兩組分濃度X(μg/mL)為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：高良姜素Y=25.208 X-15.259（r=0.9999，n=6），范圍9.72～777.92 μg/mL；α-香附酮Y=33.382 X+12.717，（r=0.9999，n=6），范圍2.32～185.68 μg/mL。

2.6 精密度試驗

精密吸取“2.2”項下的對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果RSD(n=6)分別為高良姜素0.4%，α-香附酮0.9%，顯示精密度良好。

2.7 重復性試驗

取批號為“17081049 CC”的良附丸，照“2.3”項方法平行制備6 份供試品溶液，分別進樣測定。結(jié)果高良姜素和α-香附酮的質(zhì)量分數(shù)分別為3.40 mg/g 和0.67 mg/g，RSD(n=6)分別為1.7%和1.5%，顯示重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取6 份已知含量的樣品（批號17081049 CC，測得高良姜素、α-香附酮的含量分別為3.40 mg/g 和0.67 mg/g）約0.75 g，精密稱定，分別精密加入“2.2”項下對照品貯備液2.5 mL，按“2.3”項方法制備，精密吸取以上6種溶液各10 μL進樣測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表1，表明加樣回收率良好。

表1 回收率試驗結(jié)果

2.9 穩(wěn)定性試驗

取“17081049CC”批樣品，按“2.3”項下方法處理，室溫條件下分別于0、2、4、6、8、12、24 h 進樣10 μL，記錄峰面積。結(jié)果RSD（n=7）分別為高良姜素0.9%，α-香附酮0.4%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 含量測定

精密稱取3 批良附丸，每批平行測定3 份，照“2.3”方法制備樣品溶液，照“2.1”色譜條件測定，采用外標法計算，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果

3 討論

根據(jù)高良姜素和α-香附酮的紫外光譜圖進行分析，高良姜素在267 nm波長處有最大吸收，在249 nm 波長處有最小吸收；α-香附酮在249 nm 波長處有最大吸收。波峰和波谷處曲線平緩，適用于作為測定波長，考慮樣品中α-香附酮濃度較小，選擇249 nm波長較為合適。

以校正因子（單位濃度的峰面積）為指標，比較提取方法①（取樣品約6 g，甲醇25 mL，超聲30 min）、方法②（取樣品約6 g，甲醇25 mL，超聲60 min）、方法③（取樣品約6 g，甲醇25 mL，超聲120 min）和方法④（取樣品約1.5 g，甲醇50 mL，超聲60 min）對兩組分提取能力的影響。結(jié)果表明采用方法④時，提取完全。

本實驗采用HPLC法快速測定良附丸中高良姜素和α-香附酮的含量，實驗中采用常規(guī)的C18色譜柱，直接超聲提取，過程簡單，色譜分析時間短。通過方法學驗證，方法專屬性高、精密度好、準確度高、簡單快速，可作為快速測定良附丸含量得方法。通過對同一個廠家3 個批次樣品進行檢驗，高良姜素的含量為3.377～3.579 mg/g，α-香附酮的含量為0.675～1.252 mg/g，高良姜素的質(zhì)量較穩(wěn)定，α-香附酮的質(zhì)量波動范圍較大，可能與香附產(chǎn)地不同相關[20]，但是對于制定良附丸中高良姜素和α-香附酮的含量控制限度，樣本量遠遠不夠，可考慮收集更多的樣本，制定良附丸的質(zhì)量標準。