芪藶強(qiáng)心顆粒對(duì)心腎綜合征大鼠腎組織細(xì)胞凋亡的影響*

段曉宇，朱 虹，孫 珊，胡紅玲，卜曉芬，明小燕，賀映俠

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院綜合二科， 湖北 武漢 430014)

心腎綜合征(cardiorenal syndrome，CRS)是指心、腎同時(shí)出現(xiàn)功能紊亂而導(dǎo)致病理生理變化的臨床綜合征[1]。臨床上，心、腎疾病共存可顯著增加患者的病死率和致殘率[2]。目前，CRS的治療主要集中在糾正血流動(dòng)力學(xué)紊亂和腎臟的替代治療上，但這種既要降低心臟負(fù)荷，又要保證腎臟血流灌注量的治療方式本身就具有一定的矛盾性。如何合理避免這一矛盾的出現(xiàn)，是提高CRS治療效果、改善患者病情的關(guān)鍵。芪藶強(qiáng)心顆粒(Qiliqiangxin granule, Q)是一種我國傳統(tǒng)中藥復(fù)方制劑，是一種被我國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于心衰的臨床用藥。金敬順等[3]研究表明，芪藶強(qiáng)心顆粒不僅可以改善心衰合并腎損傷患者的心功能，還對(duì)患者腎臟功能有一定的改善作用；盧金萍等[4]已證實(shí)，芪藶強(qiáng)心顆粒能夠明顯改善老年慢性心腎綜合征患者的心腎功能，并無不良反應(yīng)發(fā)生。然而，有關(guān)芪藶強(qiáng)心顆粒對(duì)CRS患者腎功能保護(hù)作用的機(jī)制研究鮮有報(bào)道。為此本研究擬采用左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎結(jié)合腎臟急性缺血再灌注損傷的方法建立急性CRS大鼠模型，探討芪藶強(qiáng)心顆粒對(duì)急性CRS模型大鼠腎功能改善的機(jī)制，以期為提高CRS治療效果提供更充分的理論基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠80只，雄性，6～7周齡，220～250 g，購自于武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證編號(hào)為SCXK(鄂)2017-0018。飼養(yǎng)環(huán)境保持晝夜12 h節(jié)律，恒溫25 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，通風(fēng)換氣8次/h，自由飲食。

2 主要試劑

芪藶強(qiáng)心膠囊購自于石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司(批號(hào)A1705005)，稱取芪藶強(qiáng)心顆粒12 g，加入30 mL生理鹽水溶解，配成400 g/L的溶液；抗血管緊張素II (angiotensin II，Ang II)、Bax和 Bcl-2抗體均購自Abcam；抗GAPDH抗體購自Cell Signaling Technology；大鼠血管緊張素 II酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒、大鼠中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒和大鼠胱抑素 C(cystatin C，Cys-C)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒均購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；肌酐(creatinine，Cre)測(cè)定試劑盒(貨號(hào)C011-2)購自南京建成生物工程研究所；TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒購自Roche。

3 主要方法

3.1實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物模型制備 將80只大鼠按照體質(zhì)量隨機(jī)分成6組：2周假手術(shù)(2-week sham operation，2w sham,n=10)組、2周模型(2-week CRS, 2w CRS,n=15)組、2周藥物(2 weeks CRS-Q, 2w CRS-Q,n=15)組、4周假手術(shù)(4w sham，n=10)組、4周模型(4w CRS,n=15)組和4周藥物(4w CRS-Q,n=15)組。2w CRS組、2w CRS-Q組、4w CRS組和4w CRS-Q組均采用左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎結(jié)合腎臟急性缺血再灌注損傷制備CRS:采用戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉，備皮消毒，打開腹腔，暴露分離左右側(cè)腎蒂，結(jié)扎阻斷30 min后解除阻斷，恢復(fù)血流，完成腎臟急性缺血再灌注損傷；另沿左側(cè)第5肋間切口，切開胸腔，顯露心臟，在左耳與肺動(dòng)脈根部之間、肺動(dòng)脈根部2 mm左右，用6-0帶針的手術(shù)絲線，縫扎左冠狀動(dòng)脈前降支。肉眼可觀察左心室壁由紅色變?yōu)樯n白色，同時(shí)結(jié)扎遠(yuǎn)端心肌活動(dòng)度減弱或消失，表明心肌梗死模型建立。2w sham組和4w sham組大鼠僅暴露器官或血管，不做任何缺血再灌注及結(jié)扎處理。術(shù)后腹腔滴入慶大霉素預(yù)防感染，關(guān)閉腹腔和胸腔。

3.2給藥方法 手術(shù)后第1天開始進(jìn)行藥物干預(yù)，2w CRS-Q組大鼠給予4 g·kg-1·d-1芪藶強(qiáng)心顆粒灌胃治療2周，4w CRS-Q組大鼠給予4 g·kg-1·d-1芪藶強(qiáng)心顆粒灌胃治療4周。各模型組和假手術(shù)組給予相同體積生理鹽水灌胃處理。

3.3標(biāo)本取材 (1)24 h尿液：于取材前 1 d 放置代謝籠，收集24 h尿液，3 000 r/min離心20 min，取上清-80 ℃保存待檢；(2)血清：采用戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉，剖腹暴露腹主動(dòng)脈并采血，不抗凝收集血清或抗凝收集血漿于-80 ℃保存待檢；(3)腎組織：采血后取腎臟組織，生理鹽水沖洗干凈后分成2部分，分別置于4%多聚甲醛固定后進(jìn)行石蠟包埋保存和-80 ℃冷凍保存。

3.4生化指標(biāo)檢測(cè) 采用肌氨酸氧化酶法檢測(cè)血清Cre含量；采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定血清Cys-C、尿NGAL和尿微量白蛋白(urine microalbumin,UMA)等含量；采用競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定血漿Ang II含量。

3.5HE染色觀察腎臟組織的病理變化 取大鼠腎臟組織蠟塊切片，切片厚度為4 μm，置于65 ℃恒溫烘箱烤片6 h左右。將組織切片經(jīng)過梯度乙醇常規(guī)脫蠟至水，經(jīng)蘇木精-伊紅染色、二甲苯透明后中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

3.6RT-qPCR檢測(cè)腎臟組織Ang II、Bax和Bcl-2的mRNA表達(dá) 取部分凍存腎臟組織，用TRIzol法提取總RNA，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度及濃度，利用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，擴(kuò)增目的基因。GAPDH的上游引物序列為5’-CGCTAACATCAAATGGGGTG-3’，下游引物序列為5’-TTGCTGACAATCTTGAGGGAG-3’；Ang II的上游引物序列為5’-GATGCCAGATACTGCGAA AGC-3’，下游引物序列為5’-CTTCCATTCGCACCACAGAC-3’；Bax的上游引物序列為5’-TGAACTGGACAACAACATGGAG-3’，下游引物序列為5’-AGCAAAGTAGAAAAGGGCAACC-3’；Bcl-2的上游引物序列為5’-TTGTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3’，下游引物序列為5’-TTCAGAGACAGCCAGGAGAAATC-3’。PCR條件為:95 ℃預(yù)變性1 min; 94 ℃變性15 s、58 ℃退火20 s、72 ℃延伸45 s，共40個(gè)循環(huán); 72 ℃延伸7 min。以GAPDH為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA表達(dá)量。

3.7Western blot 檢測(cè)腎臟組織Ang II、Bax和Bcl-2的蛋白表達(dá) 取部分凍存腎臟組織，液氮中碾碎，加入適量RIPA裂解液，提取總蛋白，采用BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品蛋白濃度。取20 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，并將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入 I 抗 [anti-Ang II(1∶1 000)、 anti-Bax(1∶1 000)、 anti-Bcl-2(1∶1 000)和anti-GAPDH(1∶1 000)]置于4 ℃孵育過夜，洗滌后加入HRP標(biāo)記的 II 抗山羊抗兔IgG(1∶10 000)室溫孵育30 min，洗滌后滴加新鮮配制的顯色液ECL，于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀中曝光檢測(cè)。

3.8TUNEL染色檢測(cè)腎臟組織細(xì)胞凋亡情況 取大鼠腎臟組織蠟塊進(jìn)行切片，切片厚度為4 μm，65 ℃恒溫烘干。經(jīng)梯度酒精脫蠟至水，3% H2O2封閉30 min，PBS洗滌后經(jīng)蛋白酶K消化液作用25 min，加入TUNEL反應(yīng)液于37 ℃孵育60 min，加入過氧化物酶標(biāo)記的抗熒光素抗體(Converter-POD)，置于濕盒內(nèi)避光孵育30 min，PBS洗滌后DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹脂封片。光鏡下觀察染色結(jié)果，陽性染色為深褐色即為凋亡細(xì)胞。凋亡率以統(tǒng)計(jì)5個(gè)隨機(jī)視野中陽性細(xì)胞百分比的均值表示。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 芪藶強(qiáng)心顆粒對(duì)CRS模型大鼠腎功能的影響

分別與2w sham和4w sham組比較，2w CRS組和4w CRS組大鼠血清Cre、血清Cys-C、UMA和尿NAGL含量顯著升高(P<0.01)；與2w CRS組和4w CRS組比較，芪藶強(qiáng)心顆粒干預(yù)后的2w CRS-Q組和4w CRS-Q組大鼠血清Cre、血清Cys-C、UMA和尿NAGL含量均顯著降低(P<0.05)；芪藶強(qiáng)心膠囊干預(yù)后的2w CRS-Q組Cre、Cys-C、UMA和NAGL水平均顯著高于2w sham組(P<0.05)，而4w CRS-Q組僅Cre水平顯著高于4w sham組(P<0.05)，其它指標(biāo)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖1。

2 芪藶強(qiáng)心膠囊對(duì)CRS模型大鼠腎組織病理學(xué)的影響

光鏡下觀察HE染色結(jié)果顯示，2w sham和4w sham組大鼠腎臟組織未見明顯病理改變，腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)清晰，小管上皮細(xì)胞排列整齊；2w GRS組大鼠腎臟組織可見腎小管上皮細(xì)胞脫落、水腫和壞死，腎小管擴(kuò)張，腎間質(zhì)充血，4w GRS組大鼠腎臟組織損傷更加嚴(yán)重；芪藶強(qiáng)心膠囊干預(yù)2w CRS-Q和4w CRS-Q組大鼠腎臟組織損傷減輕，與2w和4w GRS組比較，2w和4w CRS-Q組腎小管上皮細(xì)胞脫落、水腫和壞死，腎小管擴(kuò)張，腎間質(zhì)充血等現(xiàn)象明顯減輕，見圖2。

Figure 1.The effects of Qiliqiangxin granule (Q) on serum Cre, serum Cys-C, UMA and urine NAGL in the rats with CRS. Mean±SD.n=15.*P<0.05,**P<0.01vssham groups;#P<0.05,##P<0.01vsCRS groups.

圖1芪藶強(qiáng)心顆粒對(duì)CRS模型大鼠血清Cre、血清Cys-C、UMA和尿NAGL含量的影響

Figure 2.Observation of the pathological changes in the renal tissues of each group with HE staining (×200).

圖2HE染色觀察各組大鼠腎臟組織病理學(xué)變化

3 芪藶強(qiáng)心膠囊對(duì)CRS模型大鼠腎臟組織及血漿中Ang II水平的影響

分別與2w sham組和4w sham組比較，2w CRS組和4w CRS組大鼠血漿中Ang II含量顯著升高(P<0.01)；藥物干預(yù)2周和4周后，2w和4w CRS-Q組大鼠血漿Ang II含量較各自CRS組顯著降低(P<0.05)，見圖3A。且2w和4w CRS組大鼠腎臟組織中Ang II的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著高于各sham組(P<0.05)，芪藶強(qiáng)心膠囊干預(yù)后，2w和4w CRS-Q組大鼠腎臟組織中Ang II的mRNA和蛋白表達(dá)水平則又顯著低于2w和4w CRS組(P<0.05)，見圖3B、C。

Figure 3.The effects of Qiliqiangxin granule (Q) on the levels of Ang II in plasma and renal tissues of rats with CRS. A: the serum level of Ang II in the rats was detected by ELISA; B: the mRNA level of Ang II in the renal tissues of the rats was determined by RT-qPCR; C: the protein level of Ang II in the renal tissues of the rats was evaluated by Western blot. Mean±SD.n=15.*P<0.05,**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsCRS group.

圖3芪藶強(qiáng)心顆粒對(duì)CRS模型大鼠血漿及腎臟組織中AngII水平的影響

4 芪藶強(qiáng)心顆粒對(duì)CRS模型大鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡的影響

大鼠腎臟組織TUNEL染色結(jié)果顯示,分別與2w和4w sham組比較，2w和4w CRS組大鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡率顯著上升(P<0.05)；分別與2w和4w CRS組比較，藥物干預(yù)2周和4周后的2w和4w CRS組大鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，見圖4。

與2w和4w sham組比較，2w和4w CRS組大鼠腎臟組織中凋亡蛋白Bax表達(dá)顯著增高，抗凋亡蛋白Bcl-2顯著降低；與2w和4w CRS組比較，芪藶強(qiáng)心顆粒干預(yù)2周和4周的2w和4w CRS-Q組的Bax蛋白表達(dá)又顯著降低，Bcl-2蛋白又顯著升高(P<0.05)；同時(shí)，Bax和Bcl-2的mRNA表達(dá)水平與其蛋白表達(dá)水平趨勢(shì)一致，見圖5。

討 論

根據(jù)心腎發(fā)病的先后和急慢，將CRS分成5個(gè)亞型：I型急性心腎綜合征、Ⅱ型慢性心腎綜合征、Ⅲ型急性腎心綜合征、Ⅳ型慢性腎心綜合征和Ⅴ型繼發(fā)性心腎綜合征[5]。急慢性CRS的發(fā)病機(jī)制有心輸出量減少致腎臟血流灌注不足缺血缺氧、中心靜脈壓升高致腎靜脈充血、內(nèi)臟淤血水腫致腹內(nèi)壓增高，以及交感神經(jīng)系統(tǒng)、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)激活釋放血管活性物質(zhì)等多種因素共同參與[6-7]。芪藶強(qiáng)心顆粒是一種傳統(tǒng)中藥復(fù)方制劑，具有益氣溫陽、活血通絡(luò)和利水消腫功效。已有研究表明，芪藶強(qiáng)心顆?？梢酝ㄟ^抗氧化應(yīng)激、抑制炎癥反應(yīng)和改善腎動(dòng)脈血流等機(jī)制抑制大鼠心梗后心腎綜合征病程進(jìn)展[8]。也有研究表明，芪藶強(qiáng)心顆粒可以通過抑制RAAS系統(tǒng)的激活，改善慢性心力衰竭患者心功能[9]。然而，本研究通過構(gòu)建急性CRS動(dòng)物模型，證實(shí)芪藶強(qiáng)心顆?？赏ㄟ^抑制腎組織細(xì)胞凋亡改善急性CRS大鼠腎功能，其機(jī)制可能與抑制RAAS系統(tǒng)的激活有關(guān)。

早期臨床常使用血清Cre和UMA作為檢測(cè)腎損傷的金標(biāo)準(zhǔn)，但受患者年齡、性別和肌肉質(zhì)量等多因素影響并不能及時(shí)可靠地反映急性腎損傷[10]。Cys-C是一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，在機(jī)體內(nèi)的含量很穩(wěn)定，且不受客觀因素的影響。當(dāng)腎小球受損時(shí)血液中Cys-C含量會(huì)突然增高，其靈敏度要比Cre高，是一種早期腎功能損傷的標(biāo)志物[11]。NGAL是發(fā)現(xiàn)最早的腎小管損傷標(biāo)志物，能在腎小管受損時(shí)迅速釋放，可以在急性腎損傷后2 h內(nèi)即可檢測(cè)到，具有較高的特異性和敏感性[12]。已有研究證實(shí)，芪藶強(qiáng)心顆粒可改善CRS患者腎功能[13]。本研究聯(lián)合血清Cre、血清Cys-C、UMA和尿NGAL等4個(gè)指標(biāo)檢測(cè)CRS大鼠腎損傷情況。結(jié)果顯示，CRS組大鼠這4項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)在造模后2周和4周較sham組大鼠均出現(xiàn)顯著升高，說明CRS組大鼠腎損傷嚴(yán)重；采用芪藶強(qiáng)心顆粒干預(yù)2周和4周后，發(fā)現(xiàn)CRS-Q組Cre、Cys-C、UMA和NGAL等4個(gè)腎損傷指標(biāo)較CRS組顯著下降。另外，腎組織病理染色結(jié)果也顯示，造模后2周和4周CRS-Q組大鼠腎損傷情況均較CRS組輕，說明芪藶強(qiáng)心顆粒對(duì)CRS大鼠腎損傷具有改善作用。

Figure 4.Detection of the apoptosis in the renal tissues of each group by TUNEL staining (×200). The positive cells were stained brown. Mean±SD.n=15.*P<0.05,**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsCRS group.

圖4TUNEL染色檢測(cè)大鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡情況

Bcl-2家族對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控起著重要的作用，其家族成員中既可促進(jìn)細(xì)胞凋亡(如Bax和Bid等)，又可抑制細(xì)胞凋亡(如Bcl-2和Bcl-x等)。細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的敏感取決于胞內(nèi)Bcl-2/Bax競(jìng)爭(zhēng)性的二聚體化過程，Bax同源二聚體的形成則可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與Bcl-2蛋白形成異二聚體則可抑制細(xì)胞凋亡[14]。急慢性CRS常因心輸出量減少而導(dǎo)致腎臟血流灌注不足，缺血再灌注可造成腎臟組織缺血缺氧，并誘發(fā)腎臟細(xì)胞凋亡[15]。肖駿等[16]研究也發(fā)現(xiàn)藶強(qiáng)心膠囊可抑制心肌梗死后大鼠心肌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，造模后2周和4周與sham組比較，CRS組大鼠腎組織中Bax mRNA和蛋白水平均顯著增高，而Bcl-2 mRNA和蛋白水平則顯著降低；采用芪藶強(qiáng)心顆粒干預(yù)2周和4周后，CRS-Q組Bax mRNA和蛋白水平較CRS組顯著降低，Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)則較CRS組顯著增高。TUNEL凋亡染色結(jié)果也顯示，造模后2周和4周，CRS組大鼠腎臟組織細(xì)胞的凋亡率顯著高于sham組，而CRS-Q組的凋亡率又顯著低于CRS組。說明芪藶強(qiáng)心顆粒也可抑制CRS模型大鼠腎臟組織的細(xì)胞凋亡。

Figure 5.The effects of Qiliqiangxin granule (Q) on the mRNA (A) and protein (B) levels of Bax and Bcl-2 in renal tissues of rats with CRS. Mean±SD.n=15.*P<0.05,**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsCRS group.

圖5芪藶強(qiáng)心顆粒對(duì)CRS模型大鼠腎臟組織Bax和Bcl-2mRNA和蛋白表達(dá)的影響

Ang II是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)中的主要生物活性成分，除了具有調(diào)節(jié)血管張力并維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定外，還參與了體內(nèi)細(xì)胞生長、凋亡、氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥反應(yīng)[17]。有研究表明，發(fā)生心力衰竭時(shí)心臟局部出現(xiàn)RAAS系統(tǒng)過度激活，從而導(dǎo)致心排血量減少，引起腎臟血流灌注不足，最終導(dǎo)致腎損傷[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，造模后2周和4周與sham組比較，CRS組大鼠血漿Ang II含量顯著升高，且使用芪藶強(qiáng)心顆粒干預(yù)后CRS-Q組血漿Ang II含量又顯著降低，說明芪藶強(qiáng)心顆粒可抑制Ang II外分泌作用，從而減少由心排血量減少引起的腎損傷。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)造模后2周和4周，CRS組大鼠腎臟組織中Ang II的mRNA和蛋白表達(dá)量顯著高于sham組，藶強(qiáng)心顆粒干預(yù)后CRS-Q組Ang II的mRNA和蛋白表達(dá)量又顯著降低，說明芪藶強(qiáng)心顆?？梢种艭RS大鼠腎臟中Ang II的表達(dá)。葉勇等[19]研究也證實(shí)，芪藶強(qiáng)心膠囊可以抑制心肌肥厚模型大鼠心肌組織中AngⅡ的表達(dá)；涂珊等[20]研究表明，外源AngII預(yù)處理可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡；周安宇等[21]研究顯示，抑制腎臟AngII表達(dá)可改善腎病綜合征模型大鼠的腎功能。因此，芪藶強(qiáng)心顆粒抑制腎臟組織細(xì)胞凋亡改善CRS大鼠腎臟功能的機(jī)制可能與抑制Ang II表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，芪藶強(qiáng)心顆?？梢酝ㄟ^抑制腎組織細(xì)胞凋亡促進(jìn)CRS模型大鼠腎功能恢復(fù)，其機(jī)制可能與抑制Ang II表達(dá)有關(guān)，這將成為我們下一步研究的重點(diǎn)。