柴胡皂苷a抑制PTZ誘導(dǎo)的小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞活化*

單 萍，張繼龍，笱玉蘭，羅利俊

(武漢市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 湖北 武漢 430022)

癲癇是一種全球范圍內(nèi)最為常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)綜合征，主要表現(xiàn)為神經(jīng)過(guò)度興奮以及神經(jīng)元突發(fā)性產(chǎn)生生物電信號(hào)導(dǎo)致的癲癇發(fā)作，其特點(diǎn)是反復(fù)發(fā)作，擾亂正常的大腦功能，并有可能損傷大腦，使原有的神經(jīng)系統(tǒng)缺陷持續(xù)惡化。其中，顳葉癲癇是成人癲癇患者中最為常見(jiàn)的類(lèi)型，其主要特點(diǎn)是海馬區(qū)硬化。由于藥物治療的臨床療效不佳，顳葉癲癇現(xiàn)已成為具有藥物抵抗性的難治性癲癇，占難治性癲癇總?cè)藬?shù)的50%以上[1]。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，癲癇的發(fā)生是由神經(jīng)元異常產(chǎn)生的，但越來(lái)越多的研究數(shù)據(jù)顯示，星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能紊亂和代謝穩(wěn)態(tài)失調(diào)參與神經(jīng)元的過(guò)度興奮、神經(jīng)毒性和癲癇的發(fā)作[2-3]。使用代謝抑制劑抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞新陳代謝時(shí)，可導(dǎo)致癲癇的發(fā)作[4]。這表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞在維持正常大腦活性中具有關(guān)鍵的作用。研究發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和神經(jīng)炎癥與癲癇發(fā)生、復(fù)發(fā)和自發(fā)性發(fā)作有關(guān)[5-6]。柴胡皂苷a(Saikosaponin a, SSa)是臨床常用中藥柴胡的主要藥理成分柴胡皂苷的一種單體成分，具有多種藥理功能，如抗癲癇、抗抑郁和抗驚厥等[7-8]。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，使用戊四氮(pentylenetetrazole, PTZ)和SSa處理原代培養(yǎng)的小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)一步探究SSa對(duì)PTZ誘導(dǎo)的小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料

DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco(11320082)；PTZ購(gòu)自Sigma(P6500)；柴胡皂苷a購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(xw080063)；小鼠抗膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)單克隆抗體和小鼠熒光II抗購(gòu)自Abcam(ab10062和ab150116)；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒和Hoechst 33258染色液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司(C1052、C1062和C1011)；小鼠GFAP和間隙連接蛋白43(connexin 43,Cx43)的ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Biocompare(orb409337和MBS2019835)。

2 方法

2.1小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的分離及培養(yǎng) 小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的體外原代培養(yǎng)參考Mccarihy法并加以改進(jìn)[9]。取1～3 d新生C57BL/6小鼠，乙醇消毒后開(kāi)顱處理，小心剔除血管和腦膜，分離海馬組織，剪碎組織，并進(jìn)行細(xì)胞消化和離心，差速貼壁40 min后，采用含15%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基接種細(xì)胞，細(xì)胞密度控制為1×109/L。將接種細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)7～9 d，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)，將培養(yǎng)瓶置于37.0 ℃恒溫旋轉(zhuǎn)搖床(240 r/min)上搖18 h后，后續(xù)傳代培養(yǎng)即可獲得純化的星形膠質(zhì)細(xì)胞。

2.2細(xì)胞鑒定 采用免疫熒光檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP對(duì)分離培養(yǎng)的小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。將培養(yǎng)的小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞接種至預(yù)先放置有蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時(shí)，取出細(xì)胞培養(yǎng)皿，清洗細(xì)胞后依次采用4%多聚甲醛、0.5%Triton X-100和5%BSA處理細(xì)胞，隨后加入GFAP I抗稀釋液，室溫孵育1 h后，清洗后加入熒光II抗稀釋液，避光室溫孵育1 h。取出干凈的載玻片，滴1滴抗熒光淬滅封片液(含DAPI)(15～20 μL)，用鑷子小心取出蓋玻片，將紙巾搭在邊緣吸去多余液體，細(xì)胞面朝下，小心貼在載玻片上。熒光顯微鏡鏡檢觀察。

2.3細(xì)胞分組及處理 將鑒定成功的小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔5×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，采用無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基更換細(xì)胞培養(yǎng)基，將細(xì)胞隨機(jī)分為4組：對(duì)照(control)組、PTZ組、0.625 mg/L SSa組和1.25 mg/L SSa組。PTZ組細(xì)胞采用10 mmol/L PTZ進(jìn)行藥物誘導(dǎo)刺激2 h；0.625 mg/L SSa組和1.25 mg/L SSa組細(xì)胞在采用10 mmol/L PTZ進(jìn)行藥物刺激之前，依次采用0.625 mg/L SSa和1.25 mg/L SSa預(yù)處理細(xì)胞6 h。

2.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度后，接種2.5×104個(gè)細(xì)胞于96孔板內(nèi)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，輕輕混勻后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。各組按照相應(yīng)的處理方式進(jìn)行處理，待藥物作用時(shí)間結(jié)束后，每孔加入20 μL 0.5% MTT溶液，混勻后繼續(xù)孵育4 h，小心去掉上清后加入150 μL DMSO，低速震蕩混勻后，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度(A)值。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 待各組細(xì)胞藥物處理時(shí)間結(jié)束后，采用胰酶消化制備和收集單細(xì)胞懸液, 300×g4 ℃離心5 min，棄去上清后采用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞1次后加入300 μL PBS重懸細(xì)胞，逐滴加入700 μL預(yù)冷的70%乙醇，輕輕吹打混勻后置于4 ℃固定24 h。1 000×g離心5 min，沉淀細(xì)胞后棄去上清。每個(gè)樣本加入500 μL染色緩沖液重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)入1.5 mL 離心管中，然后加入10 μL RNase A溶液，25 μL 碘化丙啶染色液，輕輕混勻后置于37 ℃避光溫浴30 min。隨后置于冰上，即時(shí)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光信號(hào)。

2.6Hoechst 33258染色 將各組細(xì)胞培養(yǎng)液去掉，PBS清洗2次后加入800 μL 4%多聚甲醛固定細(xì)胞，室溫固定10 min，清洗后，均勻地滴加300～500 μL Hoechst 33258染色液，室溫孵育3～5 min。染色結(jié)束后采用PBS清洗3遍后，取出干凈的載玻片，滴1滴抗熒光淬滅封片液(15～20 μL)，用鑷子小心取出蓋玻片，將紙巾搭在邊緣吸去多余液體，細(xì)胞面朝下，小心貼在載玻片上。熒光顯微鏡鏡檢觀察。

2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 待各組細(xì)胞藥物處理時(shí)間結(jié)束后，收集單細(xì)胞懸液，1 000×g，室溫離心5 min，棄上清，采用PBS清洗2次后采用100 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞，依次加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染色液，輕輕混勻后，室溫避光孵育30 min。孵育時(shí)間結(jié)束后加入300 μL Binding buffer終止反應(yīng)，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.8ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞中GFAP和Cx43表達(dá) 待各組細(xì)胞藥物處理時(shí)間結(jié)束后，收集細(xì)胞沉淀，采用小鼠的GFAP和Cx43的ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞中GFAP和Cx43蛋白表達(dá)水平。具體操作參照ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。各組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性檢驗(yàn)采用單因素方差分析，組間多重比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定

鏡檢顯示，原代分離培養(yǎng)的小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞突起明顯可見(jiàn)，向外伸出，長(zhǎng)短不一,見(jiàn)圖1A。采用細(xì)胞免疫熒光法鑒定，結(jié)果顯示細(xì)胞呈GFAP陽(yáng)性表達(dá)，證明分離的細(xì)胞為星形膠質(zhì)細(xì)胞，見(jiàn)圖1B。

Figure 1.Mouse hippocampal astrocytes and their GFAP immunofluorescence staining. A: the morphological changes of mouse hippocampal astrocytes culturedinvitro(×200); B: mouse hippocampal astrocyte GFAP immunofluorescence positive expression (×200).

圖1小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞及其GFAP免疫熒光染色

2 PTZ誘導(dǎo)小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞活化及SSa的干預(yù)作用

采用MTT法檢測(cè)PTZ誘導(dǎo)下星形膠質(zhì)細(xì)胞的活力，結(jié)果顯示，PTZ組細(xì)胞活力顯著高于對(duì)照組(P<0.05);與PTZ組比較，PTZ+0.625 mg/L SSa組和PTZ+1.25 mg/L SSa組細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05)；且PTZ+1.25 mg/L SSa組細(xì)胞活力較PTZ+0.625 mg/L SSa組更低(P<0.05)。這表明PTZ能夠顯著活化體外培養(yǎng)的小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞，而SSa對(duì)PTZ的這一作用具有顯著的抑制作用，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The viability of the astrocytes in each group was mea-sured by MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPTZ group;&P<0.05vsPTZ+0.625 mg/L SSa group.

圖2MTT法檢測(cè)各組星形膠質(zhì)細(xì)胞的活力

3 SSa對(duì)PTZ激活的小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞周期的影響

進(jìn)一步檢測(cè)SSa對(duì)PTZ活化的小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖周期的影響，結(jié)果顯示，PTZ組G0/G1期細(xì)胞百分比較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，但G2/M期細(xì)胞百分比較對(duì)照組顯著升高(P<0.05);與PTZ組相比，PTZ+0.625 mg/L SSa組和PTZ+1.25 mg/L SSa組G0/G1期細(xì)胞百分比均明顯升高，G2/M期細(xì)胞百分比均顯著降低(P<0.05)；且PTZ+0.625 mg/L SSa組與PTZ+1.25 mg/L SSa組各時(shí)期細(xì)胞百分比也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見(jiàn)圖3。這一結(jié)果表明，PTZ能夠促進(jìn)海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖，SSa能抑制PTZ誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖。

4 SSa對(duì)小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響

PTZ組Hoechst 33258染色強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較少，與對(duì)照組類(lèi)似；但與PTZ組比較，PTZ+0.625 mg/L SSa和PTZ+1.25 mg/L SSa組Hoechst 33258染色強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增加，見(jiàn)圖4A。進(jìn)一步流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示，PTZ組和對(duì)照組細(xì)胞凋亡率均較少，組間比較無(wú)顯著差異；與PTZ組比較，PTZ+0.625 mg/L SSa和PTZ+1.25 mg/L SSa組細(xì)胞的凋亡百分比均顯著增加(P<0.05)，見(jiàn)圖4B。這表明，SSa可促使小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

Figure 3.The detection of cell cycle of astrocytes by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPTZ group;&P<0.05vsPTZ+0.625 mg/L SSa group.

圖3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞周期

Figure 4.Apoptosis level detection and quantitative statistics in the astrocytes. A: apoptosis of the astrocytes was detected by Hoechst 33258 staining (×200); B: flow cytometry for the detection and statistical analysis of apoptosis of the astrocytes. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPTZ group;&P<0.05vsPTZ+0.625 mg/L SSa group.

圖4星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡水平檢測(cè)及定量統(tǒng)計(jì)

5 SSa對(duì)PTZ激活的小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP和Cx43蛋白表達(dá)的影響

檢測(cè)不同處理?xiàng)l件下星形膠質(zhì)細(xì)胞中GFAP和Cx43蛋白表達(dá)水平時(shí)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，PTZ可顯著增加細(xì)胞中GFAP蛋白表達(dá)水平，同時(shí)上調(diào)Cx43蛋白的表達(dá)(P<0.05)；與PTZ組相比，PTZ+0.625 mg/L SSa組和PTZ+1.25 mg/L SSa組細(xì)胞中GFAP和Cx43蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖5。這些結(jié)果表明，SSa能夠抑制PTZ誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中GFAP和Cx43的表達(dá)。

Figure 5.Protein expression levels of GFAP and Cx43 in the astrocytes of each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPTZ group;&P<0.05vsPTZ+0.625 mg/L SSa group.

圖5各組星形膠質(zhì)細(xì)胞中GFAP和Cx43的蛋白表達(dá)水平

討 論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球癲癇患者數(shù)量高達(dá)五千萬(wàn)，我國(guó)癲癇患者占比全球癲癇患者的18%，其中55%～67%的癲癇患者為活動(dòng)性癲癇患者[10]。目前，癲癇的治療手段仍是以抗癲癇藥物治療為主，盡管藥物治療已取得了明顯的進(jìn)步和療效，由于癲癇患者對(duì)藥物的耐藥性或其他原因，仍有30%患者的治療效果不佳，成為難治性癲癇[11]。

研究顯示，柴胡總皂苷可抑制PTZ慢性點(diǎn)燃大鼠的癇性放電，進(jìn)而抑制癲癇大鼠的發(fā)作，降低癲癇發(fā)作的級(jí)別和發(fā)作次數(shù)，即對(duì)PTZ慢性點(diǎn)燃癲癇進(jìn)程具有一定的抑制作用[12]。柴胡總皂苷是中草藥柴胡的主要成分，依據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同可分為多種單體，其中SSa和柴胡皂苷d(SSd)是柴胡皂苷的有效成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒和抗癲癇等多種作用[13-14]。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，SSa能夠顯著降低PTZ點(diǎn)燃大鼠癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度和持續(xù)時(shí)間，同時(shí)顯著提高了癲癇發(fā)作的潛伏期，且能夠通過(guò)下調(diào)mTOR信號(hào)通路抑制海馬神經(jīng)元的凋亡[15]。SSa能夠抑制慢性點(diǎn)燃癲癇大鼠海馬和顳葉皮層PGP的表達(dá)并抑制腦電圖的癇性放電，也能夠降低PTZ誘導(dǎo)海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α的表達(dá)并抑制TNFR1的高表達(dá)[9, 11]。

星形膠質(zhì)細(xì)胞在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、神經(jīng)興奮傳遞和血腦屏障等多方面發(fā)揮著重要作用[16-17]。GFAP是一種中間絲蛋白，廣泛存在于發(fā)育和成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，構(gòu)成星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞骨架。因此，GFAP通常用作星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志蛋白，其表達(dá)量的多少也用于反映膠質(zhì)細(xì)胞的功能狀態(tài)[18]。本實(shí)驗(yàn)中原代分離培養(yǎng)海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞，免疫熒光檢測(cè)GFAP表達(dá)水平鑒定細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞GFAP免疫熒光呈陽(yáng)性，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，可以確定海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的成功分離，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

目前，星形膠質(zhì)細(xì)胞增生、神經(jīng)元損傷是癲癇患者大腦的病理特征，并被認(rèn)為是癲癇發(fā)作的誘發(fā)因素[19-20]。一般情況下，星形膠質(zhì)細(xì)胞可有效清除興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸，將其轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺后釋放到細(xì)胞外；但在病理情況下，星形膠質(zhì)細(xì)胞增生可下調(diào)神經(jīng)細(xì)胞的興奮閾值，還可促使炎性因子和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等釋放，參與海馬硬化，促進(jìn)癲癇的發(fā)生[21]。楊展能等[22]的研究也發(fā)現(xiàn)PTZ誘導(dǎo)的癲癇模型中星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生活化。本研究數(shù)據(jù)顯示，PTZ能夠活化海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞增殖，增加GFAP的表達(dá)；但SSa處理能夠有效抑制PTZ誘導(dǎo)的海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，抑制細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。此外，縫隙連接(gap junction, GJ)是由一系列的縫(間)隙連接蛋白(connexin， Cx)組成，主要行使細(xì)胞間直接信息交流的功能，其中Cx43是星形膠質(zhì)細(xì)胞中最為常見(jiàn)的縫隙連接蛋白。有研究顯示，在癲癇和帕金森病等疾病情況下，海馬組織中Cx43蛋白表達(dá)水平及功能發(fā)生異常[23]。例如，在致癲大鼠模型的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，致癇組大鼠海馬區(qū)與皮層區(qū)Cx43免疫陽(yáng)性表達(dá)在癲癇發(fā)作1 h后開(kāi)始增強(qiáng)，24 h達(dá)到高峰，且致癇24 h時(shí)海馬區(qū)Cx43免疫陽(yáng)性表達(dá)明顯高于同一時(shí)限的皮層區(qū)[24]。采用免疫組化及Westem blot對(duì)難治性顳葉癲癇患者的臨床樣本進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，癲癇患者較無(wú)癲癇病史者的海馬組織中Cx43蛋白表達(dá)異常增強(qiáng)，提示海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞中Cx43的表達(dá)異常在癲癇等疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[25]。而在帕金森大鼠模型中同樣發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠Cx43 mRNA表達(dá)較正常組和假手術(shù)組均顯著升高[26]。本文研究數(shù)據(jù)顯示，SSa可顯著降低PTZ誘導(dǎo)的海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞中Cx43的高表達(dá)。