柚皮苷對(duì)人肺癌順鉑耐藥株A549/DDP細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用

崔美英，賀紅柳，李 盼，毛 穎

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科， 河南 鄭州 450052)

肺癌是對(duì)人類(lèi)健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率一直都位居全球首位。全世界每年肺癌的發(fā)病人數(shù)與死亡人數(shù)約為186萬(wàn)例和160萬(wàn)例[1]。在中國(guó)，男性肺癌的發(fā)病率和死亡率均占所有惡性腫瘤的第1位，女性發(fā)病率占第2位，死亡率占第1位[2]。順鉑(cisplatin，cis-dichlorodiammine platinum，DDP) 是目前廣泛采用且效果較好的治療肺癌的化療藥物，但耐藥性的產(chǎn)生是限制其療效的主要原因[3]，因此逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥性對(duì)延長(zhǎng)肺癌患者的生存期十分有益。柚皮苷(naringin，NRG)是一種雙氫黃酮類(lèi)化合物，主要存在于蕓香科植物葡萄柚、橘、橙的果皮和果肉中，也是骨碎補(bǔ)、枳實(shí)、枳殼和化橘紅等中藥的主要有效成分之一。研究發(fā)現(xiàn)，柚皮苷具有抗炎、抗氧化、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化和調(diào)節(jié)血糖等藥理作用[4-8]。近年來(lái)的研究顯示，柚皮苷可通過(guò)誘導(dǎo)凋亡、抑制增殖、阻礙侵襲和轉(zhuǎn)移以及提高化療藥物敏感性而發(fā)揮抗腫瘤活性[9-11]。但關(guān)于柚皮苷對(duì)人肺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP是否具有逆轉(zhuǎn)作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在體外觀察柚皮苷對(duì)人肺癌耐藥株A549/DDP細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用，并探討其可能的分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

人肺癌細(xì)胞A549和順鉑耐藥株A549/DDP購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。柚皮苷購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone；順鉑購(gòu)自Sigma；CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗人P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白1(multidrug resistance-associated protein 1，MRP1)、p-Akt、CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3和β-actin單克隆抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自Abcam。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌A549細(xì)胞和順鉑耐藥株A549/DDP細(xì)胞用含10% FBS、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng)。每2～3 d常規(guī)傳代1次。為保持A549/DDP細(xì)胞的順鉑耐藥性，每次換液時(shí)在細(xì)胞培養(yǎng)液中均添加順鉑(終濃度為1 mg/L)。

2.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549/DDP細(xì)胞，以每孔5 000個(gè)接種于96孔板，置于培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜,實(shí)驗(yàn)分成4組：(1)順鉑+A549細(xì)胞組：順鉑終濃度分別為2 μmol/L、4 μmol/L、6 μmol/L、8 μmol/L和10 μmol/L；(2)順鉑+A549/DDP細(xì)胞組：順鉑終濃度分別為4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L和64 μmol/L；(3)柚皮苷+A549/DDP細(xì)胞組：柚皮苷終濃度分別為10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L和160 μmol/L；(4)順鉑+柚皮苷+A549/DDP細(xì)胞組：順鉑和柚皮苷的梯度濃度分別與(2)、(3)組相同，二者聯(lián)用的濃度比為1∶2.5；每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)無(wú)細(xì)胞調(diào)零組和無(wú)藥對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃培養(yǎng)1 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm波長(zhǎng)吸光度A值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按照下列公式計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞活力的抑制率：抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。使用SPSS 16.0軟件的Probit回歸模型計(jì)算半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)，并計(jì)算出耐藥倍數(shù)，耐藥倍數(shù)=DDP對(duì)耐藥細(xì)胞的IC50/DDP對(duì)敏感細(xì)胞的IC50。

2.3藥物聯(lián)合效應(yīng)的評(píng)價(jià) 采用Chou-Talalay中效分析法對(duì)藥物聯(lián)合效應(yīng)進(jìn)行評(píng)估。中效方程式為:fa/fu =(D/Dm)m，其中fa為抑制率，fu=1-fa，D為藥物濃度，Dm為中效濃度，m為中效曲線斜率。兩邊取對(duì)數(shù)得lg(fa/fu)=mlgD-mlgDm，設(shè)Y=lg(fa/fu)，X=lgD, b=m，a=-mlgDm，得線性方程式：Y=a+bX。兩藥合用在不同效應(yīng)的聯(lián)合指數(shù)(combination index，CI)的計(jì)算公式為：CI=D1/DX1+D2/DX2，其中DX1和DX2為兩藥單用產(chǎn)生X效應(yīng)時(shí)各自所需濃度，D1和D2為兩藥聯(lián)用產(chǎn)生X效應(yīng)時(shí)各自所需濃度，均可由中效方程式求得。應(yīng)用CompuSyn 1.0軟件繪制Fa-CI曲線，若CI<1，認(rèn)為兩藥為協(xié)同作用，CI=1為相加作用，CI>1為拮抗作用。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549/DDP細(xì)胞，分為無(wú)藥對(duì)照(control)組、順鉑(DDP)組、柚皮苷(NRG)組及順鉑與柚皮苷聯(lián)用(NRG+DDP)組，其中順鉑和柚皮苷的終濃度分別為16 μmol/L和40 μmol/L。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，收集各組細(xì)胞，PBS洗滌2次，先加入200 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，再加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI染色液，輕輕混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，送流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)。

2.5Western blot法檢測(cè)蛋白水平 裂解細(xì)胞提取總蛋白，用紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，取25 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用脫脂奶粉封閉1 h，加入I 抗(抗P-gp、MRP1、p-Akt、CXCR4、Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3抗體均以1∶1 000稀釋?zhuān)功?actin抗體以1∶2 000稀釋)，于4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，加入 II 抗(1∶1 000稀釋)室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，暗室X膠片顯影，拍照，使用ImageJ 1.45 s軟件進(jìn)行灰度分析。以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參照β-actin灰度值的灰度比值作為目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件分析數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，Shapiro-Wilk法檢驗(yàn)正態(tài)分布，Levene法檢驗(yàn)方差齊性。細(xì)胞抑制率、流式細(xì)胞術(shù)和Western blot檢測(cè)數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布且方差齊性，故采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Bonferroni法進(jìn)行組間兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 順鉑耐藥前后A549細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)的變化

我們采用Western blot法檢測(cè)了順鉑耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)與非順鉑耐藥株A549細(xì)胞相比，順鉑耐藥株A549/DDP細(xì)胞中的P-gp、MRP1、p-Akt和CXCR4蛋白水平均顯著上調(diào)(P<0.05)，表明A549細(xì)胞順鉑耐藥性的產(chǎn)生可能與上述蛋白的高表達(dá)密切相關(guān)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The protein expression of P-gp, MRP1, p-Akt and CXCR4 in A549 and A549/DDP cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsA549 cells.

圖1A549和A549/DDP細(xì)胞中P-gp、MRP1、p-Akt和CXCR4蛋白的表達(dá)

2 柚皮苷和順鉑對(duì)A549/DDP細(xì)胞活力的影響

與0 μmol/L組相比，2～10 μmol/L DDP組的A549細(xì)胞活力均明顯降低(P<0.05)，IC50為6.37 μmol/L，見(jiàn)圖2。A549/DDP細(xì)胞經(jīng)順鉑和柚皮苷單獨(dú)處理24 h后，細(xì)胞活力受到顯著抑制，且呈劑量依賴性(P<0.05)，IC50分別為36.92 μmol/L和129.77 μmol/L；與DDP單獨(dú)用藥組相比，當(dāng)2種藥物按1∶2.5聯(lián)合作用時(shí)，對(duì)細(xì)胞活力的抑制作用顯著強(qiáng)于相同濃度的順鉑處理組(P<0.05)，見(jiàn)圖3。藥物聯(lián)合作用24 h的IC50為57.72 μmol/L，其中順鉑和柚皮苷的濃度分別為16.49 μmol/L和41.23 μmol/L。這表明柚皮苷與順鉑單獨(dú)或聯(lián)合作用對(duì)人肺癌順鉑耐藥株A549/DDP均具有毒性作用，且二者聯(lián)用效應(yīng)更強(qiáng)。

3 柚皮苷和順鉑聯(lián)合應(yīng)用評(píng)價(jià)

依據(jù)上述CCK-8法結(jié)果，采用CompuSyn 1.0軟件計(jì)算得出Fa-CI曲線，當(dāng)Fa<0.15時(shí)，CI>1，柚皮苷和順鉑聯(lián)用呈拮抗效應(yīng)；當(dāng)Fa>0.15時(shí)，CI<1，兩藥合用產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，見(jiàn)圖4。

Figure 2.The effect of DDP on the viability of the A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖2DDP對(duì)A549細(xì)胞活力的影響

4 柚皮苷和順鉑對(duì)A549/DDP細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，順鉑組、柚皮苷組以及柚皮苷與順鉑聯(lián)用組的細(xì)胞凋亡率均顯著升高(P<0.05)，其中順鉑和柚皮苷的終濃度分別為16 μmol/L和40 μmol/L；此外，柚皮苷與順鉑聯(lián)用組的細(xì)胞凋亡率顯著高于順鉑組(P<0.05),提示柚皮苷可協(xié)同增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)的A549/DDP細(xì)胞凋亡，見(jiàn)圖5。

Figure 3.The inhibitory effect of NRG and/or DDP on the viability of A549/DDP cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsDDP group.

圖3柚皮苷與順鉑單獨(dú)或聯(lián)合抑制A549/DDP細(xì)胞活力

Figure 4.The graph of combination index (CI) and fraction affected (Fa).

圖4藥物聯(lián)合指數(shù)(CI)與抑制率(Fa)曲線圖

Figure 5.The effects of NRG and DDP on the apoptosis of A549/DDP cells. Mean±SD.n=3.*P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsDDP group.

圖5柚皮苷和順鉑對(duì)A549/DDP細(xì)胞凋亡的影響

5 柚皮苷與順鉑對(duì)Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3蛋白水平的影響

Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，順鉑組、柚皮苷組以及柚皮苷與順鉑聯(lián)用組的Bax和cleaved caspase-3蛋白水平上調(diào)(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平下調(diào)(P<0.05)；與順鉑組相比，柚皮苷與順鉑聯(lián)用組的Bax和cleaved caspase-3蛋白水平明顯升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平明顯降低(P<0.05),提示柚皮苷協(xié)同增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)A549/DDP細(xì)胞凋亡可能與Bcl-2/Bax比率下調(diào)有關(guān)，見(jiàn)圖6。

Figure 6.The effects of NRG and DDP on the protein levels of Bcl-2, Bax and cleaved caspase-3 in the A549/DDP cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsDDP group.

圖6柚皮苷和順鉑對(duì)Bcl-2、Bax和cleavedcaspase-3蛋白水平的影響

6 柚皮苷對(duì)P-gp、MRP1、p-Akt和CXCR4蛋白水平的影響

Western blot法的檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度柚皮苷處理24 h后，A549/DDP細(xì)胞中的P-gp、MRP1、p-Akt和CXCR4蛋白水平明顯下調(diào)，且呈劑量依賴性(P<0.05)，見(jiàn)圖7。

討 論

肺癌是我國(guó)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一,由于大多數(shù)患者確診時(shí)已發(fā)展至晚期，失去了手術(shù)治療機(jī)會(huì)，因此化療成為治療肺癌的主要手段。順鉑是臨床治療肺癌常用的一線化療藥物，多數(shù)患者在化療初期對(duì)順鉑敏感，但隨后產(chǎn)生的耐藥性限制了順鉑的臨床應(yīng)用。順鉑耐藥性的產(chǎn)生涉及多種機(jī)制，其中膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的藥物外排是導(dǎo)致順鉑耐藥的重要機(jī)制之一，如P-gp和MRP1等過(guò)度表達(dá)可降低藥物對(duì)肺癌細(xì)胞的毒性作用[12]。此外，肺癌細(xì)胞還可通過(guò)提高抗凋亡能力降低對(duì)順鉑的敏感性[13]。在本研究中，順鉑對(duì)A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞的IC50分別為6.37 μmol/L和36.92 μmol/L，耐藥株A549/DDP細(xì)胞的耐藥倍數(shù)為5.80;Western blot法檢測(cè)也證實(shí)順鉑耐藥相關(guān)蛋白P-gp、MRP1、p-Akt和CXCR4在順鉑耐藥株A549/DDP細(xì)胞中呈高表達(dá)。

Figure 7.The effects of NRG on the protein levels of P-gp, MRP1, p-Akt and CXCR4 in the A549/DDP cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group;#P<0.05vs20 μmol/L group;△P<0.05vs40 μmol/L group.

圖7柚皮苷對(duì)P-gp、MRP1、p-Akt和CXCR4蛋白水平的影響

近年來(lái)，多項(xiàng)人體研究發(fā)現(xiàn)柚皮苷是一種安全高效的P-gp抑制劑，并對(duì)藥物代謝動(dòng)力產(chǎn)生影響[14-16]，提示柚皮苷在逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥方面潛力較大。Zhu等[11]研究證實(shí)，柚皮苷可通過(guò)下調(diào)P-gp蛋白逆轉(zhuǎn)人卵巢癌SKOV3/DDP細(xì)胞的順鉑耐藥性。但目前對(duì)于柚皮苷對(duì)人肺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP的逆轉(zhuǎn)作用尚未見(jiàn)報(bào)道。在本研中，我們采用CCK-8法檢測(cè)了柚皮苷與順鉑對(duì)人肺癌順鉑耐藥株A549/DDP細(xì)胞的毒性作用，結(jié)果表明，柚皮苷與順鉑均可顯著抑制A549/DDP細(xì)胞活力且具有劑量依賴性，兩藥聯(lián)用則對(duì)細(xì)胞活力的抑制作用更加顯著。進(jìn)一步采用Chou-Talalay中效分析法對(duì)兩藥的聯(lián)合效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)抑制率超過(guò)15%時(shí)，兩藥聯(lián)用可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。與之相一致，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果也表明，柚皮苷可增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。上述結(jié)果表明，柚皮苷可逆轉(zhuǎn)A549/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性。

為初步探究柚皮苷與順鉑協(xié)同誘導(dǎo)A549/DDP細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，我們采用Western blot法檢測(cè)了Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3及p-Akt蛋白水平的變化。Bcl-2是Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白，而B(niǎo)ax為促凋亡蛋白。當(dāng)Bcl-2表達(dá)上調(diào)和/或Bax表達(dá)下調(diào)時(shí)，順鉑的促凋亡作用可被顯著抑制[17-18]。Zhang等[19]研究證實(shí)，使用PI3K/Akt通路抑制劑wortmannin可誘導(dǎo)A549/DDP細(xì)胞凋亡，并逆轉(zhuǎn)其順鉑耐藥性。本研究結(jié)果顯示，柚皮苷和順鉑單獨(dú)作用均可顯著下調(diào)Bcl-2蛋白水平、上調(diào)Bax和cleaved caspase-3蛋白水平，兩藥聯(lián)用可協(xié)同增強(qiáng)對(duì)Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3蛋白水平的調(diào)控。同時(shí)柚皮苷還可劑量依賴性地下調(diào)p-Akt蛋白水平。這初步揭示了柚皮苷增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)A549/DDP細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。

CXCR4是G蛋白偶聯(lián)的7次跨膜受體。研究發(fā)現(xiàn)CXCR4在多種惡性腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[20-23]。近年來(lái)多項(xiàng)研究證實(shí)，CXCR4與多種腫瘤的順鉑耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)[24-25]。Xie等[26]研究發(fā)現(xiàn)，CXCR4在順鉑耐藥患者的肺癌組織中的表達(dá)明顯高于其在順鉑敏感患者的肺癌組織中的表達(dá)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在體外沉默CXCR4基因表達(dá)可逆轉(zhuǎn)A549/DDP細(xì)胞的順鉑耐藥性。在本研究中，柚皮苷可劑量依賴性地下調(diào)CXCR4蛋白水平。由此推測(cè)，這可能是柚皮苷逆轉(zhuǎn)A549/DDP細(xì)胞順鉑耐藥性的機(jī)制之一。

P-gp和MRP1同為ATP結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette transporters, ABC transporters)超家族成員，這類(lèi)蛋白質(zhì)能夠結(jié)合ATP 并利用能量將細(xì)胞內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外。Zheng等[27]采用改良的納米顆粒將P-gp的siRNA導(dǎo)入A549/DDP細(xì)胞后，可顯著提高A549/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。采用RNA干擾技術(shù)沉默MRP1基因表達(dá)也同樣可以增強(qiáng)順鉑對(duì)A549/DDP細(xì)胞的毒性作用[28]。本研究證實(shí)，柚皮苷可劑量依賴性地下調(diào)P-gp和MRP1的蛋白水平,這將有助于減少順鉑的外排，從而提高A549/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。

綜上所述，柚皮苷可協(xié)同增強(qiáng)人肺癌耐藥株A549/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，這可能與柚皮苷上調(diào)Bax蛋白水平，下調(diào)P-gp、MRP1、p-Akt和CXCR4蛋白水平，進(jìn)而促進(jìn)凋亡和減少順鉑外排有關(guān)。本研究為柚皮苷改善肺癌治療現(xiàn)狀提供了一定的證據(jù)支持。