miR-221通過調節(jié)PTEN影響肺癌細胞對吉非替尼的耐藥性*

鄭禮平，陳藝丹，張 楠，全 文，梁翠微，龔五星

(珠海市人民醫(yī)院， 暨南大學附屬珠海醫(yī)院腫瘤科， 廣東 珠海 519000)

肺癌目前是我國常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率都占惡性腫瘤的首位，嚴重威脅人民健康[1]。非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)占肺癌總數的85%左右，而大部分患者確診時已是晚期，無法行根治性手術切除。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)，如吉非替尼和厄洛替尼等，因為有療效確切、不良反應輕微、口服給藥方便等優(yōu)點，已成為晚期NSCLC極其重要的治療手段,但在10～11個月的無進展生存后，患者會對EGFR-TKI產生耐藥[2-3]。

微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一組進化保守的內源性非編碼小分子RNA，能在轉錄后水平負性調控基因的表達。大量研究已證實，miRNA在腫瘤細胞產生耐藥性的過程中發(fā)揮著重要的作用[4-5]。miR-221參與了腫瘤的發(fā)生，我們前期研究也證實miR-221能夠促進肺癌A549細胞增殖[6]。但miR-221是否會影響NSCLC 對EGFR-TKI的耐藥，目前還沒有報道。因此本研究將miR-221抑制物轉染至吉非替尼耐藥細胞株PC9/GR中，觀察其對細胞耐藥性的影響，并探討具體的作用機制，為肺癌新的治療方法提供實驗基礎。

材 料 和 方 法

1 材料和試劑

人肺腺癌細胞PC9/GR(吉非替尼耐藥細胞) 和PC9 (吉非替尼敏感細胞)由本實驗室保存。吉非替尼(gefitinib, 商品名：易瑞沙)購自AstraZeneca；RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco；抗人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten, PTEN)抗體購自Abcam； miR-221 inhibitor和miR-NC購自上海吉瑪制藥；CCK-8試劑購自日本同仁化學研究所；RNA提取試劑TRIzol和脂質體LipofectamineTM2000購自Invitrogen；辣根過氧化物酶標記的抗兔、抗鼠II抗均購自武漢博士德公司；雙螢光素酶檢測試劑盒購自Promega。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng)及轉染 肺癌PC9/GR細胞和PC9細胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，放置于37 ℃、5% CO2和相對濕度95%的恒溫培養(yǎng)箱中。當細胞生長至約90%融合時，用胰酶消化細胞，吹打為單細胞懸液后進行離心，后使用RPMI-1640培養(yǎng)基進行稀釋，制成5×108/L的懸液。將PC9/GR細胞轉種在6孔板中,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，在細胞融合80%～90%時轉染,在轉染前2 h更換成未含血清的新鮮培養(yǎng)基,將細胞分為：實驗(miR-221 inhibitor)組，轉染miR-221 inhibitor；對照(control)組，轉染miR-NC；空白(blank)組，單用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。轉染過程按照LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明書進行，轉染24～48 h后收集細胞進行各項指標檢測。

2.2RT-qPCR檢測細胞中miR-221的表達 收集細胞，采用TRIzol法提取各組細胞的總RNA，后用紫外分光光度計來檢測RNA的濃度和純度，控制A260/A280于1.8～2.0之間。依照RT-qPCR試劑盒提供的操作說明合成cDNA。擴增反應條件設置為:95 ℃預變性30 s; 95 ℃變性5 s、55 ℃延伸20 s、最后72 ℃退火20 s，40個循環(huán)。U6為內參照。標本重復檢測3次，使用2-ΔΔCt法來分析計算。miR-221的上游引物序列為5’-CAGCATACATGATTCCTTGTGA-3’，下游引物序列為5’-CTTTGGTGTTTGAGATGTTTGG-3’；U6的上游引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列為：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

2.3CCK-8法檢測肺癌細胞對吉非替尼的敏感性 將各組細胞接種于96孔板內，每孔1 000個細胞,置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，在細胞貼壁后加入不同濃度的吉非替尼,設置7個呈2倍遞增梯度的濃度(1～64 μmol/L)，對照孔則不加藥物,每個藥物濃度設平行重復6孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，往每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃繼續(xù)孵育2 h。然后在酶標儀上采用450 nm波長測量各孔的吸光度(A)。重復進行實驗3次。計算細胞存活率：存活率(%)=實驗孔A值/對照孔A值×100%。根據細胞存活率計算出吉非替尼的半數抑制濃度(the half-maximal inhibitory concentration，IC50)。

2.4Western blot檢測PTEN蛋白的表達 收集各組細胞，用RIPA細胞裂解液提取蛋白質樣品,用BCA法測定總蛋白濃度。取樣品蛋白50 μg，然后用SDS-PAGE進行分離，后轉移蛋白至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加抗PTEN抗體及GAPDH抗體，4 ℃搖床孵育過夜;次日在室溫下用TBST液漂洗3次；同樣方法稀釋 II 抗，室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，最后用ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光、顯影及分析。

2.5雙螢光素酶報告基因檢測 首先合成PTEN 3’-UTR序列片段以及突變的3’-UTR序列片段，其中PTEN 3’-UTR序列片段能和miR-221相應序列互補結合,然后克隆這2個片段到pGL3-Luciferase基因下游多克隆位點上。肺癌PC9/GR細胞按4×108/L接種在6孔板中。用LipofectamineTM2000將螢光素酶報告載體與miR-221 inhibitor及miR-NC進行共轉染。轉染48 h后收集細胞，根據Promega公司雙螢光素酶報告基因進行相應檢測。

3 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數據分析。實驗數據用均數±標準差(mean±SD)表示。兩組間均數比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 miR-221在肺癌細胞中的表達

RT-qPCR結果顯示，PC9/GR細胞中的miR-221表達量明顯高于PC9細胞(P<0.01)，見圖1。轉染miR-221 inhibitor能夠顯著降低PC9/GR細胞中miR-221的表達，實驗組miR-221表達量較對照組明顯減少(P<0.01)；對照組和空白組間miR-221含量的差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖2。

Figure 1.The expression levels of miR-221 in the lung cancer PC9 cells and PC9/GR cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsPC9 cells.

圖1肺癌PC9細胞和PC9/GR細胞中miR-221的表達

Figure 2.The expression level of miR-221 in the PC9/GR cells transfected with miR-221 inhibitor. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank group.

圖2肺癌PC9/GR細胞轉染miR-221inhibitor后miR-221的表達

2 PC9/GR細胞轉染miR-221 inhibitor后對吉非替尼耐藥性的變化

實驗組細胞的存活率低于對照組(P<0.05)，見圖3。吉非替尼對實驗組、對照組和空白組細胞的IC50分別是(4.65±0.48)μmol/L、(15.78±0.78)μmol/L和(14.54±0.85)μmol/L,實驗組細胞對吉非替尼的耐藥性明顯低于對照組(P<0.01)，見圖4。

Figure 3.The viability of PC9/GR cells treated with gefitinib for 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖3吉非替尼處理48h后PC9/GR細胞的存活率

Figure 4.The IC50of gefitinib for PC9/GR cells after gefitinib treatment for 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖4吉非替尼處理48h后PC9/GR的IC50

3 Western blot檢測PTEN蛋白的表達

與PC9細胞相比，PC9/GR細胞中的PTEN蛋白表達量明顯下降(P<0.05)，見圖5。轉染miR-221 inhibitor能夠顯著增加PC9/GR細胞中PETN的表達, Western blot顯示實驗組的PTEN蛋白水平較對照組和空白組升高(P<0.05)，見圖6。

4 PTEN是miR-221的下游靶基因

通過生物信息學軟件TargetScan預測miR-221的靶基因，提示PTEN可能是其下游作用基因。雙螢光素酶報告基因結果顯示，含野生型PTEN的 3’-UTR序列細胞中，轉染miR-221 inhibitor后螢光素酶活性較對照組和空白組明顯增強(P<0.05)；而含突變型PTEN的3’-UTR序列細胞中，3組的螢光素酶活性的差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖 7。

Figure 5.The relative protein expression of PTEN in the lung cancer PC9 cells and PC9/GR cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsPC9 cells.

圖5肺癌PC9和PC9/GR細胞中PTEN的表達

Figure 6.The relative protein expression of PTEN in the lung cancer PC9/GR cells transfected with miR-221 inhibitor. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖6轉染miR-221inhibitor后PC9/GR細胞的PTEN表達

Figure 7.The role of miR-221 in the targeting sequence of PTEN evaluated by detecting the activity of luciferase. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖7螢光素酶活性檢測miR-221對PTEN靶序列的作用

討 論

我國以及亞裔人群肺腺癌患者的EGFR基因敏感突變陽性率可高達40%～50%左右[7]。國內外多個已發(fā)表的研究證實EGFR-TKI藥物極大地改善和延長攜帶這些驅動基因的NSCLC患者的預后以及生存[8-9],但患者最終會出現TKI耐藥，導致疾病進展，這無疑限制了TKI藥物的進一步發(fā)展。獲得性耐藥的部分機制已清楚，包括EGFR激酶第二位點突變(T790M突變等)、組織轉化(上皮間質轉化、小細胞轉化)等，但還有很多的機制需要進一步研究。

miRNA是一類長約19～25個核苷酸的非編碼小RNA，其廣泛存在于真核生物體內。miRNA通過與靶基因信使RNA特異性結合進而誘導其降解或抑制其翻譯，引起靶蛋白的表達水平發(fā)生變化，從而調控下游的信號通路，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和耐藥等方面發(fā)揮了重要作用[4-5, 10]。miR-221定位于X染色體P11.3區(qū)約1 kb的區(qū)域內，屬于成簇分布的miRNA。miR-221 在前列腺癌、結直腸癌和肝癌等多種腫瘤中表達上調，扮演了“癌基因”的角色[11-13]。最近許多研究發(fā)現miR-221能影響腫瘤對抗癌藥物的耐藥性。在腦膠質瘤中，miR-221通過調控PI3K/Akt信號通路增強了癌細胞對卡莫司汀的耐藥性[14]。在乳腺癌MCF7細胞中轉染miR-221后，會增加腫瘤細胞對氟維司群的耐藥程度[15]。

本課題組前期研究證實，miR-221在肺癌組織中高表達，轉染miR-221 mimics后能促進肺癌A549細胞增殖[6]。RT-qPCR結果顯示，PC9/GR細胞中的miR-221表達量是PC9細胞的7.15倍，說明miR-221對肺癌細胞吉非替尼耐藥可能起到重要作用。在PC9/GR細胞中轉染miR-221 inhibitor能降低肺癌細胞對吉非替尼的耐藥程度。通過使用TargetScan靶基因預測軟件及結合發(fā)表的文獻，我們發(fā)現PTEN可能是miR-221的直接靶標。研究發(fā)現在人腦膠質瘤中PTEN表達的下降會增強癌細胞對卡莫司汀的耐藥性[16]。Kim等[17]對129例胃癌患者進行分析發(fā)現使用曲妥珠治療4個月內就出現進展的患者，其PTEN的表達水平較那些療效很好的患者明顯減少，多變量分析證實PTEN表達缺失是曲妥珠耐藥的獨立預測因子。本研究發(fā)現PC9/GR細胞中PTEN表達較PC9明顯減少；抑制PC9/GR細胞中miR-221表達后PTEN的表達會顯著升高；而且雙螢光素酶報告基因進一步確定了PTEN為miR-221的下游靶基因。

綜上所述，miR-221可能通過靶基因PTEN來調控肺腺癌PC9/GR細胞對吉非替尼的耐藥性，有望為肺癌的治療提供可能的作用靶點。