E-cadherin和FOXO3a在胃癌組織和細(xì)胞中表達(dá)的關(guān)系*

陳發(fā)帥，薛長(zhǎng)年△，劉世佳，王夢(mèng)丹，馬子涵，孫海斌，鄭鵬遠(yuǎn)，郭彥偉，張自森△

(鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院 1普通外科， 2腫瘤內(nèi)科， 3病理科， 4消化內(nèi)科， 河南 鄭州 450052)

胃癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居于第二位[1]。盡管胃癌的分子分型可有效區(qū)分胃癌患者的預(yù)后生存，但胃癌發(fā)生的分子機(jī)制尚不明確，仍需進(jìn)一步研究。上皮鈣黏素(E-cadherin)與胃癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，可通過(guò)調(diào)節(jié)多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)通路影響胃癌細(xì)胞增殖[2]。叉頭框蛋白O3a(forkhead box protein O3a, FOXO3a)是叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族(forkhead transcription factors)中重要成員，目前被認(rèn)為是一種抑癌因子，參與了對(duì)胃癌細(xì)胞增殖調(diào)控[3]。然而，E-cadherin和FOXO3a在胃癌發(fā)生中的關(guān)系研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)檢測(cè)E-cadherin和FOXO3a在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)，探討其相關(guān)性及與臨床病理特征的關(guān)系，觀察E-cadherin過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞活力和FOXO3a表達(dá)的影響及可能的分子機(jī)制，為胃癌的個(gè)體化治療探索提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 病例資料

組織標(biāo)本取自鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院2014年6月～2017年12月期間的53例石蠟包埋胃癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織，癌旁組織距離腫瘤組織邊緣均大于5 cm。所有病例經(jīng)病理診斷證實(shí)為胃腺癌，術(shù)前均未進(jìn)行放療和化療,其中男性39例，女性14例，年齡33～83歲，中位年齡64歲，臨床分期參照美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(AJCC)第7版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)。本項(xiàng)工作經(jīng)鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)。

2 材料

人胃癌細(xì)胞株AGS購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù);E-cadherin過(guò)表達(dá)細(xì)胞株AGS由上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司構(gòu)建的慢病毒感染完成?？笶-cadhe-rin(20874-1-AP)、FOXO3a(10849-1-AP)、Bax(50599-2-Ig)、Bcl-2(12789-1-AP)和GAPDH(10494-1-AP)抗體均購(gòu)于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司(proteintech?);抗Akt1(75692)抗體購(gòu)于Cell Signaling Technology；ATP-4b(ab176992)購(gòu)于Abcam；CCK-8試劑盒購(gòu)自AbMole；F12K培養(yǎng)液購(gòu)自Millipore。

3 免疫組織化學(xué)染色與結(jié)果判斷

胃癌及癌旁組織均采用常規(guī)石蠟包埋，3 μm連續(xù)切片、烤干，二甲苯及梯度濃度的乙醇溶液脫蠟、脫水，用檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，以已知陽(yáng)性標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替Ⅰ抗作為陰性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)步驟按SP試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。E-cadherin以細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)，F(xiàn)OXO3a以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。觀察陽(yáng)性細(xì)胞百分比及染色強(qiáng)度，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比(陰性為0，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分)，評(píng)判陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度(無(wú)陽(yáng)性染色為0分，淺黃色為1分，深黃色為2分，棕黃色為3分)。最終結(jié)果以染色評(píng)分及染色細(xì)胞所占比率相乘，≤6分為陰性表達(dá)，>6分為陽(yáng)性表達(dá)。免疫組化染色判斷由2位病理醫(yī)師通過(guò)獨(dú)立雙盲法判斷。

4 方法

4.1細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%的胎牛血清的F12K培養(yǎng)液(含青霉素1×105U/L和鏈霉素100 mg/L)，在37 ℃、5%CO2條件下于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)2～3 d傳代1次。

4.2免疫細(xì)胞化學(xué) 胰酶消化細(xì)胞后重懸細(xì)胞于完全培養(yǎng)液中，充分吹打，使之成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)。以每孔1×108/L接種于6孔板上，制備細(xì)胞爬片，甲醇固定，封閉、Ⅰ抗和Ⅱ抗孵育，脫水、透明、鏡檢。

4.3E-cadherin過(guò)表達(dá)AGS細(xì)胞的構(gòu)建與驗(yàn)證 構(gòu)建E-cadherin過(guò)表達(dá)的長(zhǎng)效慢病毒載體，感染AGS細(xì)胞，嘌呤霉素篩選并建立穩(wěn)轉(zhuǎn)株。Real-time PCR驗(yàn)證穩(wěn)轉(zhuǎn)株中E-cadherin mRNA的表達(dá)。E-cadherin的上游引物序列為5’-AACGCATTGCCACATACA-3’，下游引物序列為5’-CGGGCTTGTTGTCATTC-3’，產(chǎn)物114 bp。GAPDH的上游引物序列為5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’，下游引物序列為5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’， 產(chǎn)物121 bp。反應(yīng)條件： 95 ℃變性15 s， 60 ℃退火30 s, 95 ℃變性15 s。Western blot驗(yàn)證穩(wěn)轉(zhuǎn)株中E-cadherin蛋白表達(dá)。

4.4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 細(xì)胞經(jīng)過(guò)消化重懸計(jì)數(shù)，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AGS細(xì)胞以及E-cadherin過(guò)表達(dá)AGS細(xì)胞，設(shè)置3個(gè)密度梯度，分別為以每孔2×106/L、5×106/L和1×107/L的密度接種于14塊96孔板中，每個(gè)96孔板設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔加入200 μL，分別培養(yǎng)12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h和144 h后，每孔加入100 μL CCK8溶液，用酶聯(lián)檢測(cè)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度(A)值。

4.5Western blot檢測(cè) 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞裂解并提取總蛋白。半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶封閉后用Tris-HCl緩沖液(TBST)洗凈，分別加入Ⅰ抗4 ℃過(guò)夜，TBST洗后加人辣根過(guò)氧化物酶(HRP)Ⅱ抗，1 h后洗膜，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)底物顯影。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。計(jì)數(shù)資料數(shù)據(jù)比較采用2檢驗(yàn)，兩指標(biāo)相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析，兩樣本比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 E-cadherin在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)

E-cadherin以細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá),見(jiàn)圖1。E-cadherin在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于癌旁組織(P<0.01),見(jiàn)表1。E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)與胃癌組織分化程度和TNM有關(guān)(P<0.05)，與年齡、性別、部位、T分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，見(jiàn)表2。

2 FOXO3a在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)

FOXO3a以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá),見(jiàn)圖1。 FOXO3a在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于癌旁組織(P<0.01)，見(jiàn)表1。FOXO3a在胃癌組織中的表達(dá)與分化程度有關(guān)(P<0.05)，與年齡、性別、部位、T分期、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，見(jiàn)表2。

Figure 1.The expression of E-cadherin and FOXO3a in gastric cancer and corresponding adjacent tissues was detected by immunohistochemistry (SP method). A: E-cadherin was negatively expressed in adjacent tissues of gastric cancer; B: E-cadherin was positively expressed in adjacent tissues of gastric cancer; C: E-cadherin was negatively expressed in gastric cancer tissues; D: E-cadherin was positively expressed in gastric cancer tissues; E: FOXO3a was negatively expressed in adjacent tissues of gastric cancer; F: FOXO3a was positively expressed in adjacent tissues of gastric cancer; G: FOXO3a was negatively expressed in gastric cancer tissues; H: FOXO3a was positively expressed in gastric cancer tissues.

圖1免疫組化檢測(cè)胃癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織中E-cadherin和FOXO3a的表達(dá)

表1E-cadherin和FOXO3a在胃腺癌及癌旁正常組織中表達(dá)的關(guān)系

Table 1.The expression of E-cadherin and FOXO3a in gastric adenocarcinoma and their adjacent normal tissues (Mean±SD.n=53)

GroupE-cadherinFOXO3a+-+-Gastric carcinoma22(41.5)31(58.5)17(32.1)36(67.9)Para-carcinoma44(83.0)9(17.0)37(69.8)16(30.2)2/P19.433/<0.0115.100/<0.01

3 E-cadherin與FOXO3a在胃癌組織中表達(dá)的相關(guān)性

在E-cadherin蛋白陽(yáng)性表達(dá)組中，F(xiàn)OXO3a蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為22.6%，在E-cadherin陰性組中，F(xiàn)OXO3a蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為9.4%，E-cadherin與FOXO3a蛋白在胃癌組織中的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.376，P=0.003)，見(jiàn)表3。

4 E-cadherin在穩(wěn)轉(zhuǎn)AGS細(xì)胞中的表達(dá)驗(yàn)證

Real-time PCR檢測(cè)2組細(xì)胞中E-cadherin的mRNA相對(duì)表達(dá)，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)基因轉(zhuǎn)染的AGS細(xì)胞中E-cadherin的mRNA水平顯著升高(P<0.05)。Western blot分析顯示過(guò)表達(dá)基因轉(zhuǎn)染后，AGS細(xì)胞中E-cadherin蛋白可見(jiàn)明顯表達(dá)(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

5 免疫細(xì)胞化學(xué)分析E-cadherin過(guò)表達(dá)對(duì)AGS細(xì)胞中FOXO3a表達(dá)的影響

表2E-cadherin和FOXO3a在胃腺癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系

Table 2.Expression of E-cadherin and FOXO3a in gastric adenocarcinoma and their relationship with clinicopathological features (Mean±SD.n=53)

Clinicopathologic featureE-cadherinFOXO3an-+2P-+2PSexMale3922170.2630.60826130.1070.743Female1495104Age (year)≤60201280.0300.8621370.1260.723>603319142310LocationCardia2413113.0840.21414101.8560.395Gastric body83562Pylorus21156165DifferentiationHigh-medium 11299.7270.008656.6610.036Middle-low138567Low29218245StagingⅠ-Ⅱ12484.0440.044662.2880.130Ⅲ-Ⅳ4127143011T stagingT1-T214770.5650.452861.0150.314T3-T43924152811Lymph node metastasisNo15870.2290.632872.0440.153Yes3823152810

表3E-cadherin和FOXO3a在胃腺癌中表達(dá)的相關(guān)性

Table 3.Correlation between E-cadherin and FOXO3a expression in gastric adenocarcinoma

E-cadherinFOXO3a-+rP-2650.3760.003+1012

與NC組相比，對(duì)照組AGS細(xì)胞呈分散性生長(zhǎng)，E-cadherin過(guò)表達(dá)的AGS細(xì)胞呈團(tuán)簇狀生長(zhǎng)。E-cadherin過(guò)表達(dá)的AGS細(xì)胞之間黏附能力增加，更易成團(tuán)。E-cadherin過(guò)表達(dá)后，細(xì)胞中FOXO3a的表達(dá)量明顯增高,見(jiàn)圖3。

6 CCK-8法分析E-cadherin過(guò)表達(dá)對(duì)AGS細(xì)胞活力的影響

Figure 2.Verification of E-cadherin mRNA (A) and protein (B) expression in stably transfected AGS cells. NC: negative control AGS cells; OE: E-cadherin-over-expressing AGS cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNC group.

圖2穩(wěn)轉(zhuǎn)AGS細(xì)胞中E-cadherinmRNA和蛋白表達(dá)驗(yàn)證

與對(duì)照AGS細(xì)胞相比，E-cadherin過(guò)表達(dá)的AGS細(xì)胞活力明顯下降，12 h、72 h和96 h的對(duì)照組和E-cadherin過(guò)表達(dá)的AGS細(xì)胞組細(xì)胞活力的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，24和48 h的細(xì)胞活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖4。

7 Western blot檢測(cè)E-cadherin過(guò)表達(dá)對(duì)FOXO3a、Akt、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

與正常AGS細(xì)胞組相比，E-cadherin過(guò)表達(dá)的AGS細(xì)胞中FOXO3a、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著升高，Akt蛋白表達(dá)量顯著降低，內(nèi)參調(diào)整后的Bax/Bcl-2相對(duì)表達(dá)比值顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

討 論

E-cadherin對(duì)上皮細(xì)胞黏附性起著重要作用，能夠抑制細(xì)胞遷移，保持細(xì)胞之間的連接以及組織的完整性，在多數(shù)腫瘤中表達(dá)下調(diào)或缺失，從而促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4-6]。E-cadherin與胃癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切，可調(diào)節(jié)多種信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)揮作用，在胃癌診斷、預(yù)后判斷和治療方面具有重要價(jià)值[2, 7]。本研究結(jié)果也表明E-cadherin在腫瘤組織中表達(dá)顯著下調(diào)，且與胃癌組織的分化程度和臨床分期顯著相關(guān)，提示E-cadherin表達(dá)下調(diào)可能促進(jìn)了胃癌發(fā)生，這與部分文獻(xiàn)報(bào)道不一致[8]，可能存在人群和種族差異。

Figure 3.The expression of E-cadherin and FOXO3a in AGS cells was detected by immunocytochemistry. A: strong positive expression of E-cadherin in E-cadhe-rin-over-expressing gastric cancer AGS cells; B: negative expression of E-cadherin in gastric cancer AGS cells; C: strong positive expression of FOXO3a in E-cadherin-over-expressing gastric cancer AGS cells; D: negative expression of FOXO3a in gastric cancer AGS cells.

圖3免疫細(xì)胞化學(xué)分析AGS細(xì)胞中的E-cadherin和FOXO3a表達(dá)

Figure 4.Difference of theAvalues between the 2 groups of cells at different time points. NC: negative control AGS cells; OE: E-cadherin-over-expressing AGS cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group.

圖42組細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間的A值差異

Figure 5.Relative expression of FOXO3a, Akt, Bcl-2 and Bax proteins analyzed by Western blot. NC: negative control AGS cells; OE: E-cadherin-over-expressing AGS cells. Mean±SD.n=3.#P<0.05vsE-cadherin overexpressed gastric cancer AGS cells group.

圖5Westernblot分析FOXO3a、Akt、Bcl-2和Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)水平

FOXO3a是叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族重要成員，多數(shù)研究表明其是一種腫瘤抑制因子，其導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生可能與DNA損傷有關(guān)，并與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、預(yù)后和腫瘤耐藥關(guān)系密切[9-10]。FOXO3a在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用還不清楚，現(xiàn)有研究中出現(xiàn)了截然相反的結(jié)果[11-13]。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中FOXO3a的表達(dá)顯著低于對(duì)應(yīng)癌旁組織，提示其可能是腫瘤抑制因子，與Yang等[11]研究結(jié)果相一致，與其它研究結(jié)果不一致的原因可能在于胃癌分子表型的個(gè)體化差異和結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)差異等因素的影響，還需要同一標(biāo)準(zhǔn)下的大樣本病例研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究結(jié)果首次表明E-cadherin和FOXO3a在胃癌組織中表達(dá)均下調(diào)，并存在顯著正相關(guān)，胃癌AGS細(xì)胞中E-cadherin過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致FOXO3a表達(dá)相應(yīng)增加，說(shuō)明E-cadherin和FOXO3a可能共同參與了胃癌的發(fā)生，其可能的機(jī)制與兩者顯示的抑癌基因功能有關(guān)，兩者共同下調(diào)促進(jìn)了胃癌的發(fā)生，兩者是否參與了共同分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。也有研究觀察到FOXO3a可通過(guò)調(diào)節(jié)E-cadherin表達(dá)影響腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性[14-15]，說(shuō)明兩者存在共同的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，兩者之間是否存在交叉對(duì)話尚需進(jìn)一步研究。Akt/FOXO3a信號(hào)傳導(dǎo)通路在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[16-17]。本研究結(jié)果也顯示，E-cadherin過(guò)表達(dá)能有效抑制AGS細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞間黏附，并導(dǎo)致Akt表達(dá)抑制，同時(shí)FOXO3a、Bcl-2和Bax表達(dá)上調(diào)，這提示E-cadherin可能通過(guò)影響Akt/FOXO3a信號(hào)傳導(dǎo)抑制胃癌AGS細(xì)胞增殖。

綜上所述，本研究表明E-cadherin和FOXO3a在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)并存在顯著正相關(guān)，過(guò)表達(dá)E-cadherin可上調(diào)FOXO3a表達(dá)，E-cadherin過(guò)表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞增殖可能與調(diào)節(jié)Akt/FOXO3a信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)，可能是胃癌個(gè)體化治療潛在治療靶點(diǎn)。