敲減FGFR1基因表達對嬰幼兒血管瘤內皮細胞生物學特性的影響*

徐 南，徐 杰，李 函，錢麗娟，李忠堂

(1東南大學附屬中大醫(yī)院無錫分院兒科， 江蘇 無錫 214011； 2東南大學附屬中大醫(yī)院兒科， 江蘇 南京 210009)

血管瘤是一種常發(fā)生于嬰幼兒的良性腫瘤，主要的病理表現(xiàn)為血管的惡性形成，生物學特點表現(xiàn)為血管瘤內皮細胞(hemangioma endothelial cells, HemECs)的異常增生，具有明顯的增生期和退化期[1-2]。雖然部分血管瘤可自行消退，但仍有部分血管瘤未退化并可進行可持續(xù)生長；一些血管瘤生長部位特殊，可引起毀容和破潰等，具有一定的危險性并影響局部器官功能。目前血管瘤的臨床治療具有多種治療方法，但對于血管瘤的生長分子機制尚不清楚。研究表明，在血管瘤快速增生期，可能由于HemECs內部分基因的突變，從而激活相應的信號通路，從而促進HemECs大量快速生長和增殖，而血管瘤消退的主要原因是HemECs的凋亡增加和分化、轉移[3-5]。成纖維細胞生長因子受體1(fibroblast growth factor receptor 1，F(xiàn)GFR1)在血管生長過程中發(fā)揮重要作用[6]。 因此，本文通過RNA干擾技術敲減體外培養(yǎng)的HemECs細胞中FGFR1基因的表達，分析其表達量對HemECs細胞生物學特點的影響，為理解嬰幼兒血管瘤的病程形成機制提供實驗基礎。

材 料 和 方 法

1 主要實驗材料

EGM-2MV培養(yǎng)基購自Lonza；小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)、Lipofectamine 2000和TRIzol購自Sigma；反轉錄試劑盒、熒光定量PCR(qPCR)試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒和RIPA細胞裂解液購自上海碧云天生物研究所；Cell Counting Kit-8(CCK-8)購自日本同仁公司；Transwell小室購自Corning；Matrigel購自BD；抗磷脂酰肌醇3-激酶(phospoinositide 3-kinase，PI3K)單克隆抗體、抗蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)單克隆抗體、抗磷酸化AKT(p-AKT)單克隆抗體和抗GAPDH單克隆抗體購自Cellular Signaling Technology；辣根過氧化物酶標記的II 抗購自武漢博士德有限公司。流式細胞儀購自BD；實時熒光定量PCR儀購自ABI；酶標儀購自Thermo。

2 方法

2.1嬰幼兒血管瘤內皮細胞的分離和培養(yǎng) 共收集經病理鑒定的嬰幼兒血管瘤6例，均獲得家屬知情或同意。根據(jù)參考文獻[7]的技術方法分選并鑒定內皮細胞。將細胞培養(yǎng)于EGM-2MV培養(yǎng)基，放入37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中，細胞傳至2～3代時，接種至6孔板中。

2.2細胞的轉染 將對數(shù)生長期嬰幼兒血管瘤內皮細胞隨機分為3組：對照(control)組、陰性對照siRNA(negative control siRNA, siRNA-NC)組和FGFR1 siRNA (si-FGFR1)組。根據(jù)Lipofectamine 2000說明書將siRNA-NC和si-FGFR1分別轉染入HemECs，常規(guī)培養(yǎng)的細胞作為對照。

2.3qPCR檢測FGFR1 mRNA的表達量 收集各組轉染后48 h細胞，采用TRIzol提取細胞中總RNA。根據(jù)試劑說明書進行反轉錄和熒光定量PCR檢測。FGFR1 擴增引物由Invitrogen合成，F(xiàn)GFR1上游引物序列為5’-CGCGGATCCATGTGGAGCTGGAAGTGCCTCCTCT-3’，下游引物序列為5’-CCGCTCGAGTCAGCGGCGTTTGAGTCCGCCATT-3’；β-actin引物上游序列為5’-GGACCTGACTGACTACCTC-3’，下游序列為5’-TACTCCTGCTTGCTGAT-3’。反應體系為50 μL，反應條件為： 95 ℃ 3 min； 95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、68 ℃ 2 min， 35 個循環(huán)； 68 ℃ 10 min。結果采用2-ΔΔCt法進行計算。

2.4CCK-8法檢測細胞的活力 收集各組細胞，每孔加入10 μL CCK-8，37 ℃孵育2 h，酶標儀檢測570 nm的吸光度(A)值。

2.5流式細胞術檢測細胞的凋亡率 調整各組細胞濃度為1×109/L，每孔加入10 μL 膜聯(lián)蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)，室溫孵育15 min，離心，棄上清，加入5 μL 碘化丙啶(propidium iodide，PI)，4 ℃孵育15 min，流式細胞術檢測凋亡率。

2.6Transwell法檢測細胞侵襲和遷移 將-80 ℃冰箱中的Matrigel置于4 ℃冰箱中融化，與300 μL無血清培養(yǎng)基混合均勻，吸取100 μL加入Transwell上室，37 ℃孵育5 h。收集各組細胞，制成濃度為5×108/L的細胞懸浮液， 吸取100 μL細胞懸液接種至鋪有Matrigel的上室上孔，下室加入500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，37 ℃孵育24 h后；姬姆薩染色，200目鏡顯微鏡下拍照，取5個視野的平均值為細胞的侵襲數(shù)。在細胞的遷移實驗中，將細胞懸浮液接種至未鋪有Matrigel的上室上孔中，其余與侵襲實驗相同。

2.7Western blot法檢測PI3K、AKT和p-AKT的蛋白水平 收集各組細胞，調整為5×1010/L，加入100 μL現(xiàn)配PIPA裂解液，冰浴30 min，離心。收集上清，BCA法測定蛋白樣品濃度。吸取40 mg總蛋白與等體積2×上樣緩沖液混勻，沸水中變性10 min；在8% SDS-PAGE后轉移至PVDF膜中，5%的脫脂奶粉封閉1 h；根據(jù)抗體說明書將抗PI3K、AKT和p-AKT抗體均以 1∶1 000稀釋，4 ℃孵育過夜，TBST漂洗3次，加入 II 抗，37 ℃孵育2 h，TBST漂洗3次，避光，顯色，凝膠成像儀中拍照，Quantity One分析灰度值。

3 統(tǒng)計學分析

SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計處理。結果以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析，組間多重比較使用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 轉染后細胞中FGFR1的mRNA表達量

與對照組相比，siRNA-NC組細胞中FGFR1的mRNA水平的差異無統(tǒng)計學顯著性，si-FGFR1組細胞中FGFR1的mRNA水平顯著降低(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The expression of FGFR1 in the HemECs after transfection with siRNA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1轉染后細胞中FGFR1表達量的變化

2 敲減FGFR1基因表達對HemECs活力的影響

與對照組相比，siRNA-NC組HemECs細胞活力的差異無統(tǒng)計學顯著性，si-FGFR1組HemECs的細胞活力顯著降低(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The effect ofFGFR1 expression knock-down on the viability of HemECs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2敲減FGFR1基因表達對HemECs細胞活力的影響

3 敲減FGFR1基因表達對HemECs凋亡的影響

與對照組相比，siRNA-NC組HemECs的凋亡率無顯著差異，si-FGFR1組HemECs的凋亡率顯著增加(P<0.05)，見圖3。

4 敲減FGFR1基因表達對HemECs遷移能力的影響

與對照組相比，siRNA-NC組遷移的HemECs數(shù)量無顯著差異，si-FGFR1組遷移的HemECs數(shù)量顯著降低(P<0.05)，見圖4。

5 敲除FGFR1基因表達對HemECs細胞侵襲的影響

與對照組相比，siRNA-NC組侵襲HemECs數(shù)量無顯著差異，si-FGFR1組侵襲HemECs數(shù)量顯著降低(P<0.05),見圖5。

6 敲減FGFR1基因表達對PI3K、AKT和p-AKT蛋白水平的影響

與對照組相比，siRNA-NC組HemECs中PI3K、AKT和p-AKT蛋白水平的差異無統(tǒng)計學顯著性，si-FGFR1組HemECs細胞中的AKT蛋白無顯著變化，PI3K和p-AKT的蛋白水平顯著降低(P<0.05)，見圖6。

Figure 3.The effect ofFGFR1 expression knock-down on the apoptosis of HemECs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3敲減FGFR1基因表達對HemECs凋亡的影響

Figure 4.The effect ofFGFR1 expression knock-down on the migration ability of HemECs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4敲減FGFR1基因表達對HemECs遷移能力的影響

Figure 5.The effect ofFGFR1 expression knock-down on the invasion of HemECs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖5敲減FGFR1基因表達對HemECs侵襲能力的影響

討 論

血管瘤是一種常見的嬰幼兒良性腫瘤，主要病理特征為局部雜亂無章的血管過度生成，異常的內皮細胞是其病變的主要原因。HemECs的增殖與凋亡間動態(tài)平衡的破壞是血管瘤增生期向消退期轉變的主要原因，而增殖與凋亡平衡的失去主要受血管內皮生長因子和抑制因子的調節(jié)。在多種血管生成抑制劑和促進劑中，堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是其中效率最高、特異性最強的促進血管生成因子之一，通過與受體FGFR1結合促進血管的形成，對血管的生成、內皮細胞的增殖、凋亡和侵襲過程至關重要[8-9]。FGFR1是成纖維細胞生長因子受體家族的成員之一，在血管瘤組織中的表達量上調[10]。研究表明，F(xiàn)GFR1在血管瘤增生期和退化期的表達量較正常對照組顯著異常，提示FGFR1參與血管瘤的形成過程，與血管瘤的增生和退化顯著相關[11]。

Figure 6.The effect ofFGFR1 expression knock-down on the protein levels of PI3K, AKT and p-AKT. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖6敲減FGFR1基因表達對PI3K、AKT和p-AKT蛋白水平的影響

血管瘤內皮細胞凋亡和轉移在血管瘤的增生和消退期發(fā)揮重要作用。研究表明，在血管瘤消退期，細胞的凋亡率顯著增加，其中1/3為內皮細胞凋亡[12]。在本實驗中，通過轉染靶向FGFR1的siRNA下調HemECs中FGFR1基因的表達，CCK-8法檢測細胞的活力，結果發(fā)現(xiàn)敲減FGFR1的表達顯著抑制HemECs的細胞活力，流式細胞術檢測細胞的凋亡率發(fā)現(xiàn)敲減FGFR1表達可顯著促進HemECs凋亡；Transwell法檢測HemECs的遷移和侵襲能力顯示，F(xiàn)GFR1表達量下顯著降低HemECs的遷移能力，侵襲實驗也表明si-FGFR1顯著抑制HemECs的侵襲能力，表明FGFR1可通過調控血管瘤內皮細胞的生物學特性，從而影響血管瘤的增生和消退。

PI3K/AKT信號通路在多種腫瘤組織中發(fā)揮作用，如胃癌[13]、乳腺癌[14]和肺癌[15]等。PI3K是一個由催化亞基和調節(jié)亞基組成的異源二聚體，其介導的信號轉導通路在人類腫瘤中常被異常激活，激活的PI3K可活化AKT依賴性的一系列信號通路，調節(jié)腫瘤細胞的生長、凋亡和遷移[16-19]。與其它腫瘤相同，血管瘤內也存在PI3K/AKT信號通路的異常激活。研究表明，異常激活的PI3K/AKT信號通路能顯著抑制無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的HemECs發(fā)生自發(fā)性凋亡[20]。在體外裸鼠移植瘤的實驗中顯示，PI3K/AKT信號通路可能調控裸鼠移植血管瘤的增生與消退；抑制或激活PI3K/AKT信號通路促進血管瘤體的消退及增生[21]。本研究通過Western blot檢測敲減FGFR1表達對HemECs中PI3K、AKT和p-AKT蛋白水平的影響，結果顯示siRNA-FGFR1對AKT蛋白水平無顯著影響，但可顯著下調PI3K和p-AKT蛋白的水平，提示下調FGFR1可能通過影響PI3K/AKT信號通路調節(jié)HemECs的生物學特性。

綜上所述，敲減FGFR1的表達可抑制嬰幼兒血管瘤內皮細胞的活力，誘導其凋亡，阻礙細胞遷移和侵襲。這些作用可能與下調PI3K/AKT信號通路有關，但該信號通路以及下游靶基因參與調控內皮細胞生物學特性的機制還需進一步明確。