HSF1基因缺失通過上調(diào)microRNA-195a-3p加速壓力超負(fù)荷下心臟重構(gòu)*

王時(shí)俊，徐 磊，趙 剛，楊繼娥，馬雷雷，崔兆強(qiáng)，鄒云增，葛均波

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院， 上海市心血管病研究所， 上海 200032)

熱休克反應(yīng)(heat shock response)是普遍存在機(jī)體內(nèi)的一種分子應(yīng)激性防御反應(yīng)，一般通過激活細(xì)胞核內(nèi)熱休克轉(zhuǎn)錄因子1(heat shock transcriptional factor 1，HSF1)，繼而轉(zhuǎn)錄合成一組熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)，HSPs 具有分子伴侶功能，可參與細(xì)胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)的折疊、聚合、轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)傳遞等生理作用[1-2]。在我們既往的研究中發(fā)現(xiàn)，HSF1過表達(dá)可以顯著減少心肌細(xì)胞凋亡、纖維化和心肌肥厚，而小鼠HSF1基因缺失則會(huì)加重壓力超負(fù)荷下的心臟重構(gòu)[3]。同時(shí)，HSF1缺失導(dǎo)致的心肌重構(gòu)并不因HSP70和HSP27等熱休克蛋白過表達(dá)而發(fā)生逆轉(zhuǎn)，提示HSF1可能通過HSPs非依賴的調(diào)控機(jī)制，促進(jìn)心肌代謝，細(xì)胞存活和改善心臟重構(gòu)[4]。我們進(jìn)一步的研究證實(shí)，HSF1缺失主要導(dǎo)致了心臟的血管新生功能障礙，從而引起機(jī)械應(yīng)力下的心肌細(xì)胞缺血缺氧，加速了細(xì)胞肥大反應(yīng)[3, 5]。然而，HSF1缺失如何導(dǎo)致血管新生障礙，其背后的病理分子機(jī)制還不甚清楚。

因此，在本研究中我們擬通過HSF1調(diào)控的表觀遺傳學(xué)改變，篩查HSF1敲除前后的微小RNA(microRNA， miR)表達(dá)芯片譜差異，試圖找到在HSF1基因敲除小鼠的心肌組織中明顯上調(diào)的microRNA分子，并探究其與心臟血管新生功能障礙之間的聯(lián)系，闡明HSF1基因缺失加重壓力超負(fù)荷下心臟重構(gòu)的疾病分子機(jī)制，并明確可干預(yù)的分子靶點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)的HSF1基因敲除(knockout, KO;HSF1-/-)小鼠和C57BL/6背景野生型(wild-type, WT)對(duì)照小鼠，雄性，8～10周，20～25 g，飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)為：SYXK(滬)2016-0006。本實(shí)驗(yàn)所涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)操作和動(dòng)物護(hù)理均依據(jù)美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院發(fā)表的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用準(zhǔn)則(NIH指南發(fā)布：85-23號(hào)出版物，1996修訂)以及復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定。

2 主要方法

2.1小鼠壓力超負(fù)荷模型的構(gòu)建 通過主動(dòng)脈弓縮窄(transverse aortic constriction，TAC)方法實(shí)現(xiàn)小鼠心臟的壓力超負(fù)荷。選取8～10 周齡的雄性HSF1-/-小鼠(并以同齡C57BL/6野生型小鼠作對(duì)照)，腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg)和甲苯噻嗪(5 mg/kg)麻醉小鼠，行氣管插管，并接入呼吸機(jī)(使呼吸頻率保持在110 min-1，潮氣量0.4～0.5 mL)，小鼠左側(cè)胸部褪毛后取仰臥位固定于操作板，乙醇消毒后逐層分離皮膚和肌肉，沿胸骨上窩至左第2肋水平撐開5 mm并固定撐開位，分離胸腺暴露主動(dòng)脈弓，將升主動(dòng)脈開口上3 mm處血管與27號(hào)墊針一起結(jié)扎，30 s后拔出墊針，觀察到主動(dòng)脈近心端的波動(dòng)增強(qiáng)，逐層縫合并消毒。假手術(shù)只開胸不做主動(dòng)脈弓結(jié)扎。

2.2小鼠心臟超聲心動(dòng)圖檢查 TAC術(shù)后4周行小鼠心臟超聲檢查。小鼠左側(cè)胸部褪毛，麻醉后仰臥位固定在加熱恒溫的超聲檢查臺(tái)上，并接入呼吸機(jī)。采用30 MHz的高頻探頭(Vevo 770，VisualSo-nics)，將M型光標(biāo)的垂直線置于室間隔和左心室后壁乳頭肌水平，輸出M型超聲圖像記錄和心臟功能相關(guān)指標(biāo)。

2.3心肌組織免疫組化染色 TAC術(shù)后4周，小鼠麻醉處死后心臟取材，用4%多聚甲醛固定，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋后制成切片，切片行HE染色和抗CD31抗體染色(ABC法)[6]。HE染色切片進(jìn)一步用Leica圖像軟件計(jì)算細(xì)胞橫截面積(cross-sectional area, CSA)并作定量分析。

2.4心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞血管生成實(shí)驗(yàn) 取8～10周齡成年C57BL/6小鼠經(jīng)5%異氟醚麻醉后脫頸處死，分離左心室組織并剪切1 mm×1 mm×1 mm組織塊，滴加1 mL胎牛血清，均勻接種于培養(yǎng)皿(預(yù)先在皿底鋪鼠尾膠，超凈臺(tái)中風(fēng)干過夜)，組織塊間隔2 mm，37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱靜置4 h后，追加20%高糖DMEM(改良Eagle培養(yǎng)基)，再培養(yǎng)18～24 h后組織塊周圍有細(xì)胞爬出，即原代微血管內(nèi)皮細(xì)胞，利用抗CD31抗體染色鑒定內(nèi)皮細(xì)胞，48～72 h后大量細(xì)胞爬出，去除組織塊后繼續(xù)培養(yǎng)36 h后待細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿培養(yǎng)皿，用0.125%胰酶(含0.02%EDTA)消化細(xì)胞并傳代，進(jìn)行細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)[7]。

Matrigel(No.356234，BD Biosciences)鋪24孔板底，超凈臺(tái)中風(fēng)干過夜，第2天在板上接種微血管內(nèi)皮細(xì)胞，1%胎牛血清含高糖DMEM，37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育18 h后，在顯微鏡下觀察管腔樣結(jié)構(gòu)。計(jì)數(shù)5個(gè)隨機(jī)視野的管腔數(shù)量，并作統(tǒng)計(jì)分析。

2.5PRKAA2基因3’-UTR功能預(yù)測(cè)和評(píng)價(jià) 首先通過TargetScan6.2生物信息軟件預(yù)測(cè)miR-195a-3p的靶基因，結(jié)合血管新生信號(hào)通路進(jìn)行篩選；從NCBI數(shù)據(jù)庫獲取選定靶基因的小鼠編碼序列，結(jié)合軟件分析其3’-UTR區(qū)域與microRNA互補(bǔ)的序列片段，分別設(shè)計(jì)野生和突變(無義序列)3’-UTR核酸片段，通過亞克隆將2種3’-UTR連接到pMIR-REPORTTM系統(tǒng)，采用Luciferase報(bào)告系統(tǒng)對(duì)預(yù)測(cè)位點(diǎn)的實(shí)際結(jié)合能力進(jìn)行測(cè)定。具體步驟為：微血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)無血清預(yù)處理后接種于24孔板，通過siPORTTMXP-1轉(zhuǎn)染試劑(AM4507, Applied Biosystems)將上述構(gòu)建的pMIR-WT-3’-UTR和pMIR-Mut-3’-UTR載體(對(duì)照質(zhì)粒)分別轉(zhuǎn)染微血管內(nèi)皮細(xì)胞，轉(zhuǎn)染濃度為100 nmol/L;然后用miR-195a-3p模擬物(mimic)刺激細(xì)胞，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，采用雙螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)(Promega)檢測(cè)熒光強(qiáng)度。將各組的海腎螢光素酶與螢火蟲螢光素酶的相對(duì)比值(Rluc/Luc)與對(duì)照孔的Rluc/Luc(校正為1)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，判斷預(yù)測(cè)的3’-UTR是否為miR-195a-3p的結(jié)合位點(diǎn)。

2.6RT-PCR和real-time PCR實(shí)驗(yàn) 將左心室心肌組織反復(fù)剪碎后，溶解于1 mL TRIzol(Invitrogen)溶液中并勻漿，然后加入200 μL氯仿，上下混勻30 s后室溫靜置10 min后11 000 r/min離心15 min，取上清加入500 μL的異丙醇，上下輕輕混勻數(shù)次，將樣本置于-20 ℃。30 min后9 000 r/min離心10 min，棄除上清后將EP管中沉淀置于60 ℃烘干箱2 min，加入20 μL 1×TE緩沖液溶解總RNA。然后，按照PrimeScriptTMRT試劑盒(TaKaRa)說明書進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，再按照SYBR? Premix Ex TaqTMII(TaKaRa)進(jìn)行real-time PCR或普通PCR擴(kuò)增,引物序列見表1。MicroRNA表達(dá)水平用2-ΔΔCt法計(jì)算；心肌肥厚標(biāo)志物心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide, ANP)和β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain, β-MHC)的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行半定量分析。

表1 PCR引物序列

2.7Western blot實(shí)驗(yàn) 選取左心室心肌組織，剪碎后勻漿并裂解于1 mL預(yù)制的RIPA蛋白裂解液中(含50 μL PMSF，蛋白酶抑制劑)。室溫靜置20 min后，采用12 000 r/min高速離心于4 ℃離心 15 min，取上清液每個(gè)蛋白樣本加入含溴酚藍(lán)的6×電泳緩沖液10 μL，95 ℃水浴3 min。取變性后的蛋白樣品30 μL上樣，在10% SDS-PAGE分離2 h，參考蛋白marker的電泳位置截取分離凝膠，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜(Millipore)。隨后，PVDF膜用5%牛血清白蛋白(BSA)封閉1 h，加入 I 抗(1∶2 000)4 ℃孵育過夜；用1×PBST洗滌PVDF膜3次后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的II 抗(1∶500)室溫孵育2 h；再用1×PBST洗滌PVDF膜3次后加入高敏ECL顯影液；2 min后在ChemiDocTM化學(xué)發(fā)光成像儀(Bio-Rad)曝光和定量分析免疫條帶。

2.8MicroRNA芯片篩查 采用華聯(lián)生物提供的microRNA表達(dá)芯片譜篩選HSF1基因缺失對(duì)小鼠心臟microRNA的影響。分別取HSF1-/-小鼠和野生型小鼠左心室組織，利用TRIzol提取總mRNA(如2.5所述)；通過microRNA表達(dá)譜芯片篩查，篩選條件為HSF1-/-較野生型對(duì)照表達(dá)閾值>2倍的microRNA分子。對(duì)篩選出的microRNA分子通過RT-qPCR方法，再次驗(yàn)證其在微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。利用SPSS 17.0軟件對(duì)不同組數(shù)據(jù)分別進(jìn)行平均值比較，兩組間采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，多組間采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，并用Tukey檢驗(yàn)校正。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HSF1基因缺失加重壓力超負(fù)荷下的左心室重構(gòu)

心臟組織HE染色后進(jìn)行CSA分析，結(jié)果顯示TAC術(shù)后4周野生型C57BL/6小鼠的心肌細(xì)胞平均CSA要顯著小于HSF1-/-小鼠(P<0.01)，見圖1A。心臟超聲結(jié)果提示，TAC導(dǎo)致野生型小鼠的左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)下降了17.7%(P<0.05)；HSF1-/-小鼠的LVEF比野生型小鼠又進(jìn)一步降低10.4%(P<0.05)，見圖1B；同時(shí)，左室舒張末內(nèi)徑(left ventricular end-dystolic diameter，LVEDD)的擴(kuò)增程度在HSF1-/-小鼠組也更為明顯(P<0.05)，見圖1C。心肌肥厚標(biāo)志物的檢測(cè)結(jié)果顯示，β-MHC和ANP在假手術(shù)組間的mRNA表達(dá)沒有差異，TAC致β-MHC和ANP的mRNA表達(dá)水平在HSF1-/-小鼠明顯高于野生型小鼠(P<0.05),見圖1D。同時(shí)，心臟組織的免疫組化染色顯示，壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)下野生組CD31表達(dá)要明顯高于HSF1敲除組，而在假手術(shù)情況下2種小鼠的心臟CD31表達(dá)均很低(圖1E)，提示壓力超負(fù)荷可以誘導(dǎo)心臟CD31表達(dá)增加，通過血管新生改善心肌肥厚，而HSF1缺失抑制了這種保護(hù)作用。

Figure 1.HSF1 deficiency promoted pressure overload-induced cardiac hypertrophy. A: HE staining of the myocardial tissues (scale bar=20 μm) and determination of the cross-sectional area (CSA) of cardiomyocytes; B: determination of left ventricular ejection factor (LVEF); C: determination of left ventricular end-diastolic diameter (LVEDD); D: the mRNA levels of β-myosin heavy chain (β-MHC) and atrial natriuretic peptide (ANP) detected by RT-PCR; E: immunohistochemical staining for CD31 in myocardium (scale bar=20 μm). Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsWT group.

圖1HSF1基因敲除促進(jìn)壓力超負(fù)荷下小鼠心肌肥厚

2 miR-195a-3p在HSF1敲除小鼠中表達(dá)顯著增高

通過microRNA表達(dá)譜芯片我們篩到12個(gè)在HSF1-/-小鼠心臟中表達(dá)顯著增高的microRNA,見圖2A。因?yàn)镠SF1參與血管新生信號(hào)通路激活，而血管新生障礙與心臟重構(gòu)密切相關(guān)，因此我們進(jìn)一步觀察這些上調(diào)的microRNA與心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-34a-5p、miR-195a-3p、miR-208b-3p、miR-378a-5p和miR-451a在體外貼塊培養(yǎng)的微血管內(nèi)皮細(xì)胞中有不同程度的表達(dá)升高，而其他microRNA表達(dá)無差異，其中miR-195a-3p的表達(dá)顯著增高(P<0.05)，見圖2B。

Figure 2.Screening for the microRNAs associated with angiogenesis-related signaling pathways which were upregulated in theHSF1 KO mice compared with the WT mice. A: the microRNAs up-regulated more than 2 folds inHSF1 KO mice were depicted by the heat map; B: the microRNAs highly expressed in microvascular endothelial cells were determined in the second-round screening using real-time PCR. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vsWT mice.

圖2在HSF1基因敲除小鼠模型中篩選與血管新生信號(hào)通路相關(guān)的microRNA

3 miR-195a-3p過表達(dá)抑制血管新生，促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

血管新生功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)誘導(dǎo)可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞快速生長(zhǎng)和成管；而預(yù)先用miR-195a-3p mimic刺激細(xì)胞， VEGF介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)受抑，同時(shí)細(xì)胞成管數(shù)目明顯減少(P<0.05),見圖3A，TUNEL染色統(tǒng)計(jì)顯示內(nèi)皮細(xì)胞凋亡數(shù)目較陰性對(duì)照miRNA-NC干預(yù)組有顯著增加(P<0.05),見圖3B。通過Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)p53蛋白水平在miR-195a-3p mimic預(yù)處理后，較對(duì)照組表達(dá)升高2.24倍(P<0.05)，較VEGF預(yù)處理組升高1.68倍(P<0.05)；miRNA-NC干預(yù)后，p53的表達(dá)水平與對(duì)照組和VEGF誘導(dǎo)組比較均沒有顯著差異，見圖3C。上述結(jié)果提示miR-195a-3p具有特異性抑制內(nèi)皮細(xì)胞成管和促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用。

4 miR-195a-3p通過抑制 AMPKα2的表達(dá)，減少血管新生

通過生物信息軟件TargetScan 6.2分析可能受miR-195a-3p調(diào)控的靶基因，篩選出預(yù)測(cè)綜合得分排序較高、且涉及血管新生信號(hào)通路的基因——PRKAA2，其編碼蛋白為AMPKα2。雙螢光素酶報(bào)告基因測(cè)定結(jié)果表明，位于AMPKα2基因序列的5736～5757區(qū)域發(fā)生無義突變后，miR-195 mimic抑制AMPKα2轉(zhuǎn)錄的效應(yīng)明顯增強(qiáng),見圖4A。我們進(jìn)一步用Western blot檢測(cè)miR-195 mimic對(duì)于心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的AMPKα2蛋白表達(dá)影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-195 mimic明顯抑制AMPKα2的表達(dá)，而miR-NC沒有抑制作用,見圖4B。同時(shí)，血管新生因子CD31和VEGF的蛋白表達(dá)水平也被miR-195 mimic顯著抑制，而miR-NC對(duì)于CD31和VEGF的抑制作用不明顯，見圖4C。這些結(jié)果提示miR-195a-3p可能通過抑制AMPKα2的表達(dá)，干預(yù)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管新生。

討 論

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)HSF1基因缺失導(dǎo)致血管再生障礙，加速了TAC誘導(dǎo)下的心肌肥厚向心衰發(fā)展。HSF1缺失的小鼠心臟microRNAs表達(dá)譜與野生型小鼠有明顯差別，其中miR-195a-3p在心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)明顯升高； miR-195a-3p通過3’-UTR靶向抑制AMPKα2，同時(shí)miR-195a-3p過表達(dá)也抑制了心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的CD31和VEGF的表達(dá)。以上這些發(fā)現(xiàn)提示miR-195a-3p靶向抑制AMPKα2可能是其抑制血管新生的機(jī)制；通過表觀遺傳學(xué)的修飾和調(diào)控，可能是預(yù)防和治療高血壓等壓力超負(fù)荷等應(yīng)激引起心臟重構(gòu)的重要措施。

Figure 3.miR-195a-3p suppressed the growth and tube formation of microvascular endothelial cells. The cells were stimulated by vascular endothelial growth factor (VEGF) alone, VEGF+miR-195 mimic or VEGF+negative control microRNA (miR-NC). A: the growth and tube formation of the cells were observed, and the numbers for capillary-like tubes were determined; B: the apoptosis of the cells was detected by TUNEL assay; C: the protein expression of p53 was detected by Western blot. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsVEGF group.

圖3miR-195a-3p促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抑制血管再生

我們課題組既往報(bào)道了HSF1基因缺失會(huì)加重壓力超負(fù)荷下引起的小鼠心肌肥厚和心力衰竭的體征出現(xiàn)[3]。在該研究中，我們主要發(fā)現(xiàn)HSF1過表達(dá)可以抑制壓力超負(fù)荷下心臟p53的增加，并促進(jìn)血管新生因子VEGF和Ang1的表達(dá)，而HSF1敲除小鼠會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的血管新生障礙。因此，我們推測(cè)HSF1基因敲除引起的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和血管新生不足可能是促使壓力超負(fù)荷下HSF1-/-小鼠嚴(yán)重缺血缺氧、心肌細(xì)胞肥大、加速心衰的主要原因。但是，HSF1缺失介導(dǎo)心臟血管新生障礙的病理分子機(jī)制仍不清楚。

在本研究中，我們從表觀遺傳學(xué)的角度分析，HSF1缺失引起的microRNA表達(dá)譜差異造成血管新生障礙的可能性。芯片數(shù)據(jù)提示，HSF1缺失的C57小鼠心臟microRNAs的表達(dá)譜不同于正常對(duì)照小鼠，并且有12個(gè)microRNA分子顯著上調(diào)；通過在心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞中進(jìn)一步驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)miR-195a-3p是HSF1缺失后在細(xì)胞中上調(diào)最明顯的分子。miR-195上調(diào)可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，其機(jī)制是:DNA倍增是促使腫瘤細(xì)胞由G1期快速向S期過渡的關(guān)鍵，而miR-195可以靶向抑制這一細(xì)胞時(shí)期的多個(gè)編碼基因如CCND1、CDK6和EGF2等，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[8]。因此，我們認(rèn)為在心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的miR-195a-3p表達(dá)增高，可能也是通過調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞中的一些周期基因，造成內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡并影響到內(nèi)皮血管再生功能。通過TargetScan軟件分析，我們確實(shí)找到這些細(xì)胞周期基因可能是miR-195靶點(diǎn)的證據(jù)，但是我們找到一個(gè)更為關(guān)鍵的靶基因PRKAA2——AMPKα2的編碼基因。雙螢光素酶報(bào)告基因測(cè)定結(jié)果證實(shí)miR-195a-3p可以作用于PRKAA2基因的3’-UTR區(qū)域。由于AMPKα2在心臟血管新生代謝中發(fā)揮非常重要的作用[9-14]，例如，AMPKα2缺失可以抑制下游UCP2、VEGF等蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂和血管新生障礙[9-10]；而AMPKα2激活則可以磷酸化eNOS并促進(jìn)VEGF依賴的血管再生和血管舒張[11-12]。此外，AMPKα2激活還可以逆轉(zhuǎn)老化微血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管新生功能。在AMPKα2敲除小鼠中，壓力超負(fù)荷可以加重左室肥厚和心功能紊亂[13]。因此，我們推測(cè)miR-195可能不僅僅參與抑制細(xì)胞周期基因，更重要是直接抑制心臟血管新生通路上的關(guān)鍵基因，從而加速了壓力超負(fù)荷下血管新生障礙和心臟重構(gòu)。

Figure 4.miR-195a-3p inhibited AMPKα2 and angiogenesis-related genes. A: sequence alignment of mouse miR-195a-3p with 3’-UTR of AMPKα2 and the result of dual-luciferase reporter assay; B: the protein level of AMPKα2 was detected by Western blot; C: the expression and quantitative analysis of CD31 and VEGF were performed by Western blot. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4miR-195a-3p通過作用于AMPKα2抑制血管新生相關(guān)信號(hào)通路

在本研究中，我們證實(shí)了miR-195a-3p過表達(dá)不僅有效抑制了心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞中AMPKα2的表達(dá)，同時(shí)也抑制了血管新生相關(guān)基因CD31和VEGF的表達(dá)，提示miR-195a-3p對(duì)AMPKα2的靶向抑制可能與心臟血管再生功能紊亂有一定關(guān)系。值得注意的是，在本研究中miR-195a-3p的升高與HSF1的缺失有密切關(guān)系。荷蘭學(xué)者van Rooij等[15]在一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，miR-195心肌特異性高表達(dá)小鼠會(huì)出現(xiàn)快速心衰表現(xiàn)，在繁育該品系的小鼠出生第2周后即出現(xiàn)死亡；進(jìn)一步的深入研究確證，在心臟發(fā)育過程中如果miR-195表達(dá)異常增高，可能導(dǎo)致先天性心臟病，包括室上間隔缺損和嚴(yán)重的心室發(fā)育不全等癥狀。而miR-195異常增高引起的這些心臟病理特征，在HSF1敲除小鼠也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象[3, 16]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示 HSF1和miR-195存在“cross-talk”或者信號(hào)通路的上下游關(guān)系，而在壓力超負(fù)荷下，HSF1的表達(dá)可以有效抑制機(jī)械應(yīng)力下心臟miR-195a-3p的增加，從而逆轉(zhuǎn)miR-195a-3p對(duì)AMPKα2的抑制，并可能因此激活下游CD31和VEGF等血管新生相關(guān)因子，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的血管新生能力，改善壓力超負(fù)荷下的心肌重構(gòu)。

綜上所述，本研究通過構(gòu)建小鼠壓力超負(fù)荷模型，揭示了HSF1基因的缺失可導(dǎo)致心臟miR-195a-3p的表達(dá)異常升高，從而抑制下游AMPKα2的表達(dá)，阻滯代償性的血管新生，最終加速了壓力超負(fù)荷下心臟重構(gòu)和心力衰竭的發(fā)生。