環(huán)狀RNA在實體腫瘤中的研究進(jìn)展*

姚立帥， 王慧芳， 鄭燕芳， 陳群清

南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院 1胸心外科， 3腫瘤中心(廣東廣州 510280)； 2廣東省人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 (廣東廣州 510080)

環(huán)狀RNA(circular RNAs,circRNA)因其呈環(huán)狀而得名，是一類種類繁多的非編碼RNA。它廣泛且穩(wěn)定地存在于生物界，是一種比線性mRNA含量更為豐富的轉(zhuǎn)錄本，能夠通過多種分子在細(xì)胞各個階段起調(diào)控作用，并與心血管系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病、腫瘤等多種危害人類健康的疾病相關(guān)。本文將對circRNA在實體腫瘤中的研究進(jìn)展作以下綜述。

1 circRNA的歷史及特點

1.1 circRNA的研究歷史 30多年前，Sanger等[1]首先通過電子顯微鏡在植物病毒中發(fā)現(xiàn)真核RNAs可以以環(huán)狀形式存在，隨后Kos等[2]在丁型肝炎病毒中同樣發(fā)現(xiàn)circRNA存在。接著研究者在人類的E-Twenty-Six-1基因(Ets-1)[3]和小鼠的Sry基因[4]中鑒定出內(nèi)源性circRNA是由既往已知信使核糖核酸(mRNA)加工合成的，尤其側(cè)翼序列中反向序列的存在是小鼠Sry基因循環(huán)的關(guān)鍵[5]，特別是在較長的外顯循環(huán)更為顯著[6]。來自反向剪接外顯子的大多數(shù)circRNA是穩(wěn)定的，并大多存在于細(xì)胞質(zhì)中[7]，這是由于它們對細(xì)胞線性RNA衰變機制存在抗性。然而，與線性RNA相比，circRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平較低[8]。生物信息學(xué)分析顯示，反向剪接的外顯子通常側(cè)接較長的內(nèi)含子，并且側(cè)翼內(nèi)含子中非自主的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(Alu元件)的存在被計算預(yù)測與人circRNA的形成高度相關(guān)[7]。在哺乳動物中，已經(jīng)鑒定了由蛋白質(zhì)編碼基因的外顯子產(chǎn)生的circRNA，并作為調(diào)節(jié)性“miRNA海綿”起作用[9]，其在心血管疾病、朊病毒、神經(jīng)退行性疾病以及腫瘤中也不斷被驗證發(fā)揮著巨大的作用。

1.2 circRNA主要特點 circRNA分子種類繁多，數(shù)目龐大，且分布廣泛，從真核、原核生物到病毒，從果蠅到人類，從細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核到人類分泌物都能發(fā)現(xiàn)大量circRNA，circRNA的表達(dá)在各物種之間高度保守[7-10]，但是在同一種族的各細(xì)胞之間卻具有特異性，同時細(xì)胞中的circRNA會隨著細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)生變化；細(xì)胞質(zhì)中的circRNA占大多數(shù)，并主要為外顯子來源，內(nèi)含子來源以及外顯子內(nèi)含子共同組成的circRNA主要存在于細(xì)胞核內(nèi)[8]；circRNA由于缺乏易被降解的poly尾端以及通過RNA折疊使其具有高穩(wěn)定性[7, 11]。正常情況下其半衰期一般超過48 h，但是由于存在對RNA內(nèi)切酶的抵抗使在血清中只有15 s，此外由于缺乏RNA套索特征結(jié)構(gòu)的2-5鏈?zhǔn)蛊鋵NA脫支酶也同樣具有抵抗力；circRNA比相關(guān)的線性mRNA更穩(wěn)定[7]。

1.3 circRNA形成機制 circRNA由特殊的前體mRNA經(jīng)各種可變剪接產(chǎn)生，主要包括3種：(1) 經(jīng)套索驅(qū)動環(huán)化和內(nèi)含子配對驅(qū)動環(huán)化形成的外顯子來源circRNA，前者由外顯子組成的剪接供體和剪接受體共價結(jié)合后切除內(nèi)含子而形成circRNA，后者由兩個內(nèi)含子通過堿基互補配對形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)后切除內(nèi)含子而形成 circRNA；(2)內(nèi)含子通過形成索套結(jié)構(gòu)后發(fā)生部分降解而產(chǎn)生的內(nèi)含子來源circRNA；(3)在剪接過程中外顯子發(fā)生環(huán)化并同時保留了內(nèi)含子的外顯子和內(nèi)含子共同組成的circRNA[8, 10, 12]。而產(chǎn)生circRNA的一種特殊的方式是通過“反向剪接”，其中剪接供體與上游剪接受體結(jié)合而不是正常剪接反應(yīng)中與下游受體結(jié)合。這導(dǎo)致外顯子跳過并產(chǎn)生含有被跳過的外顯子的circRNA。反向剪接發(fā)生頻率很低，但當(dāng)剪接供體和受體通過RNA二級結(jié)構(gòu)或蛋白結(jié)合在一起時可以促進(jìn)反向剪接[12]。

2 分子生物學(xué)功能

2.1 miRNA海綿 “miRNA海綿”機制是目前研究比較透徹的機制，該機制提出一些circRNA上具有特定miRNA的靶點位，可以特異性地結(jié)合miRNA，以提高相應(yīng)mRNA的胞內(nèi)濃度，調(diào)節(jié)細(xì)胞功能[9]，在腫瘤中常常表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的改變，目前研究比較多的是CiRS-7[13-14]，這是一種帶有大量miR-7結(jié)合位點的circRNA，主要和腦發(fā)育相關(guān)，并通過此途徑調(diào)節(jié)CDRlas，進(jìn)而影響神經(jīng)系統(tǒng)。在提出基因海綿機制之后，便出現(xiàn)了環(huán)狀miRNA海綿是否是普遍的現(xiàn)象這樣的問題，繼而引發(fā)探索性試驗，研究員通過預(yù)測，找到了睪丸特異性Sry RNA中有16個推測的miRNA靶位點，通過一系列敲低和過表達(dá)等試驗證明了環(huán)狀Sry RNA可以作為miR-138海綿的結(jié)論,繼而得到環(huán)狀miRNA海綿是一種比較普遍的功能[13]。

第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院肝膽外科研究所根據(jù)既往基因海綿機制，結(jié)合已知的外泌體作用特點(外泌體是一種具有脂質(zhì)雙分子結(jié)構(gòu)的納米級小泡[15-16]，由多種細(xì)胞主動分泌[17]，小泡內(nèi)含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、miRNAs、lncRNAs和circRNAs[18]，腫瘤細(xì)胞可以在發(fā)生發(fā)展過程中不斷釋放外泌體[19]，影響細(xì)胞通訊，并且調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)增殖和遷移[20]，外泌體廣泛分布于體液中，可被其他細(xì)胞所吸收[21-23])，敏銳察覺出血漿中外泌體中非編碼circRNA異常，極有可能和腫瘤有關(guān)，通過實驗進(jìn)一步證明了，胰腺癌細(xì)胞產(chǎn)生大量circ-IARS，并通過外泌體方式排出細(xì)胞，被內(nèi)皮細(xì)胞吸收，通過基因海綿的作用機制結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞的miR-122,抑制其表達(dá)，減輕其對靶基因小G蛋白超家族的亞家族成員RhoA的抑制，減少了ZO-1和肌動蛋白的表達(dá)，從而改變了內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，此過程影響了腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，極有可能成為胰腺癌早期診斷和預(yù)后檢測的重要指標(biāo)，此思路也指導(dǎo)我們要從更多路徑去考慮、探索基因海綿的作用機制[24]。

2.2 調(diào)節(jié)RNA結(jié)合蛋白 隨著研究的深入，相關(guān)試驗的數(shù)據(jù)有力地證明了circRNA是經(jīng)轉(zhuǎn)錄來的。circRNA通常由剪接體產(chǎn)生，剪接體進(jìn)一步涉及到circRNA的生產(chǎn)。因為環(huán)狀結(jié)構(gòu)非常依賴于包圍外顯子的規(guī)范的剪接位點，因此,側(cè)翼外顯子的線性剪接可以與circRNA相競爭。這些競爭效應(yīng)是非常強的，甚至可以將circRNA水平降低一個數(shù)量級。側(cè)翼內(nèi)含子序列是確定給定外顯子的環(huán)化效率的主要因素。與相似內(nèi)含子長度的對照基因相比，攜帶circRNA的基因的剪接效率較低。試驗數(shù)據(jù)表明線性拼接和circRNA生產(chǎn)可以相互調(diào)節(jié)并競爭剪接位點。事實上，大多數(shù)circRNA的主要影響的是對宿主mRNA的線性剪接。研究員的試驗數(shù)據(jù)也證明了RNA拼接蛋白(MBL)在circMbl生物合成中發(fā)揮直接作用，circMbl側(cè)翼的內(nèi)含子具有許多MBL結(jié)合位點，這對于依賴于MBL水平的外顯子的環(huán)化是必需的。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)過量時，其通過促進(jìn)circMbl產(chǎn)生而降低其自身mRNA的產(chǎn)生，然后circRNA可以綁定多余的MBL蛋白。剪接因子可以通過抑制或增強循環(huán)外顯子上游的基因內(nèi)區(qū)的剪接來實現(xiàn)circRNA生物發(fā)生和規(guī)范剪接之間的平衡[25]。

2.3 宿主基因轉(zhuǎn)錄率 研究員在相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)了一類與人類細(xì)胞中的RNA聚合酶Ⅱ相關(guān)聯(lián)的circRNA。在這些circRNA中，外顯子與保留在外顯子之間的內(nèi)含子環(huán)化;我們稱它們?yōu)橥怙@子-內(nèi)含子circRNA或EIciRNA(exon-intron circRNA)。EIciRNAs主要定位在細(xì)胞核中，與U1小核RNA (U1 snRNP)相互作用并促進(jìn)其親本基因的轉(zhuǎn)錄。研究結(jié)果揭示circRNA可以調(diào)節(jié)細(xì)胞核中的基因表達(dá)，其中EIciRNAs可以增強基因順式表達(dá)，并通過特定RNA-RNA相互作用達(dá)到目的。EIciRNAs可以通過U1 snRNA和EIciRNA之間的RNA-RNA相互作用產(chǎn)生復(fù)合物，然后EIciRNA-U1 snRNP復(fù)合物可以進(jìn)一步與Pol Ⅱ轉(zhuǎn)錄復(fù)合物啟動子相互作用，增強親本基因表達(dá)。一旦基因的轉(zhuǎn)錄開啟，EIciRNA從基因的生成將進(jìn)一步促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄，從而產(chǎn)生積極的反饋。U1 snRNA的常規(guī)功能是剪接，但額外的證據(jù)表明U1 snRNP具有其他作用，如刺激早期轉(zhuǎn)錄事件，防止過早的聚腺苷酸化和確定啟動子方向。ncRNA之間的特異性RNA-RNA相互作用，例如U1 snRNA和EIciRNA之間的相互作用是ncRNAs的功能機制的核心[26]。

2.4 翻譯 circRNA缺乏帽子結(jié)構(gòu)以及poly尾，兩個特征是線性mRNA有效翻譯所必須的[27]。帽子結(jié)構(gòu)被真核起始因子識別，使得其可以掃描帶有起始密碼子的mRNA。在既往文獻(xiàn)中提到，circRNA翻譯必須有核糖體的替代機制存在，即內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(IRES)元件，其直接結(jié)合起始因子或核糖體本身，這種方法被多種病毒使用以確保它們自己的翻譯以不依賴帽子結(jié)構(gòu)的方式發(fā)生， Sarnow實驗室在1995年的開創(chuàng)性工作表明，腦心肌炎病毒(EMCV)IRES可以在體外驅(qū)動人工circRNA的翻譯[27-28]。大量實驗提供了circRNA翻譯的證據(jù)：(1)circRNA與翻譯核糖體的特異性結(jié)合；(2)產(chǎn)生來自circRNA小基因的蛋白質(zhì)；(3)發(fā)現(xiàn)在circMbl中支持終止密碼子的RFP讀數(shù)；(4)存在能夠促進(jìn)幾個circRNA上的帽獨立翻譯的序列；(5)發(fā)現(xiàn)肽匹配circbl3，但沒有已知的線性同種型；(6)通過western印跡檢測推定的circMbl編碼的蛋白質(zhì);(7)測定生理因素可以調(diào)節(jié)這些蛋白質(zhì)的水平。并且在實驗中發(fā)現(xiàn)circRNA翻譯的一些特點：在熱休克條件下增加，提示了 circRNA編碼的蛋白質(zhì)可能在應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮作用。通過IRES的不依賴于帽子結(jié)構(gòu)的翻譯在癌癥中增加以促進(jìn)其應(yīng)激反應(yīng)，并在增殖、凋亡和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中起重要作用，因為circRNA只能通過帽獨立翻譯來完成翻譯過程，我們推測來自circRNA的翻譯可能在癌細(xì)胞中更普遍[29-30]。

2.5 復(fù)雜串?dāng)_功能 circRNA可以作為ceRNA，即miRNA海綿發(fā)揮作用，從而吸附相關(guān)的miRNA。一旦circRNA通過急性治療(例如，用siRNA，shRNA，ASO或LNA GapmeR)，其所連接的miRNA被釋放并游離以結(jié)合和抑制ceRNA。作為急性干預(yù)的最終結(jié)果，ceRNA被下調(diào)[31]。在不同的情況下，由于慢性治療或敲除，長期缺乏circRNA海綿導(dǎo)致其結(jié)合miRNA轉(zhuǎn)錄后機制出現(xiàn)不穩(wěn)定。因此，其他ceRNA靶向性下降并且表達(dá)增加[32]。

3 在疾病中的生物學(xué)作用

3.1 肝癌 在研究中發(fā)現(xiàn)Twist1可以通過circ-10720吸附miRNA介導(dǎo)的間接途徑調(diào)節(jié)波形蛋白的表達(dá)。敲低circ-10720之后減弱了Twist1對肝癌細(xì)胞波形蛋白表達(dá)的影響。在PDX和DEN誘導(dǎo)的TetOn-Twist小鼠HCC模型中，通過腫瘤內(nèi)或靜脈內(nèi)注射用si-circ-10720處理小鼠，結(jié)果顯示，沉默circ-10720阻斷了Twist1對波形蛋白表達(dá)和促進(jìn)HCC惡性和轉(zhuǎn)移的作用。這些結(jié)果證明了Twist1對波形蛋白的間接調(diào)控機制，并指出了circRNA在EMT中的重要作用。并通過病理分析HCC組織標(biāo)本證明了，circ-10720與不良預(yù)后和腫瘤進(jìn)展相關(guān)，circ-10720可能成為HCC的潛在生物標(biāo)志物[33]。

3.2 膠質(zhì)瘤 該研究通過膠質(zhì)瘤與配對的正常腦組織比較，發(fā)現(xiàn)了Notch信號通路在腫瘤組織中顯著上調(diào)。確定了circNFIX可能充當(dāng)了miR-34a-5p的海綿，miR-34a-5p是一種靶向NOTCH1的miRNA。circNFIX的下調(diào)和miR-34a-5p的上調(diào)均抑制細(xì)胞增殖和遷移。而且，在體內(nèi)證明si-circNFIX可以通過調(diào)控miR-34a-5p通過靶向Notch信號通路抑制膠質(zhì)瘤生長[34]。

3.3 乳腺癌

3.3.1 circ-Dnmt1與乳腺癌 最新研究發(fā)現(xiàn)circ-Dnmt1在人乳腺癌細(xì)胞中顯著高表達(dá)。circ-Dnmt1的表達(dá)不僅增加了細(xì)胞增殖和存活，但也刺激細(xì)胞自噬，抑制細(xì)胞衰老和增加腫瘤生長。這些效應(yīng)可以通過直接與p53和Auf1結(jié)合，并促進(jìn)它們的核轉(zhuǎn)位來調(diào)節(jié)。據(jù)我們所知，細(xì)胞質(zhì)p53抑制自噬，而核p53可以增強自噬，p53和Auf1的核轉(zhuǎn)位將誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和Dnmt1表達(dá)增加，并且抑制了p53轉(zhuǎn)錄。結(jié)果顯示，circ-Dnmt1的表達(dá)增加導(dǎo)致了p53轉(zhuǎn)錄的抑制，這是circ-Dnmt1在增強細(xì)胞自噬、減少細(xì)胞衰老和促進(jìn)細(xì)胞增殖、存活和腫瘤生長中的主要作用方式[35]。

3.3.2 circ-Ccnb1與乳腺癌 據(jù)以往研究我們得知了突變型p53不能結(jié)合H2AX。Bclaf1是一種H2AX依賴性的腫瘤抑制因子，最新研究發(fā)現(xiàn)在p53突變細(xì)胞中，circ-Ccnb1與H2AX和Bclaf1形成復(fù)合物，可以促進(jìn)癌細(xì)胞死亡。這個過程只發(fā)生在p53突變細(xì)胞中，因為在野生型p53細(xì)胞中，野生型p53具有更強的結(jié)合H2AX的能力，從而使Bclaf1與Bcl2結(jié)合，Bclaf1與Bcl2的結(jié)合將促進(jìn)細(xì)胞增殖。這種結(jié)合在突變型p53存在時被破壞，其中Bclaf1可以與H2AX和circ-Ccnb1相互作用，誘導(dǎo)p53突變型癌細(xì)胞死亡[34]。

研究結(jié)果證實了circ-Ccnb1對p53野生型細(xì)胞沒有影響，因為它實際上可以增強p53野生型細(xì)胞的增殖和存活。正是基于這一點，這種潛在的藥劑將大大降低對使用這種方法進(jìn)行癌癥治療的患者的周圍基質(zhì)組織和健康細(xì)胞的影響，將是一種效果顯著但是不良反應(yīng)極小的良藥。

3.4 膀胱癌 相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)circ-ITCH在BCa組織和細(xì)胞系中均下調(diào)。BCa患者的circ-ITCH表達(dá)水平低，生存期會出現(xiàn)相應(yīng)縮短。體外/內(nèi)的實驗同樣證明，circ-ITCH可以抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。并最終證明了circ-ITCH通過海綿化miR-17和miR-224，上調(diào)了miR-17和miR-224靶基因p21和PTEN的表達(dá)，從而抑制BCa的侵襲性[36]。

3.5 肺癌新型液體活檢生物標(biāo)志物 血漿F-circEA的檢測是一種監(jiān)測EML4-ALK易位患者的特異性較高且比較方便的方法，可以指導(dǎo)EML4-ALK靶向的NSCLC治療，F(xiàn)-circEA、EML4-ALK線性轉(zhuǎn)錄物和融合蛋白不同，其可以促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲，從而有助于腫瘤發(fā)展。這些結(jié)果增加了EML4-ALK融合基因?qū)δ[瘤發(fā)生的調(diào)節(jié)。值得注意的是，F(xiàn)-circEA特異性存在于EML4-ALK陽性NSCLC患者的血漿中的證據(jù)表明F-circEA可以是一種新型“液體活檢”生物標(biāo)志物，用于監(jiān)測NSCLC中的EML4-ALK融合基因[37]。

4 展望

針對circRNA的研究越來越多，從最初的無效的基因剪接到存在復(fù)雜的生理過程，circRNA發(fā)揮不可替代的調(diào)節(jié)功能。circRNA成為眾多疾病潛在診斷和治療靶點，從最初的基因海綿(從心腦血管疾病幾乎擴展到全身各種疾病)、結(jié)合蛋白、影響基因轉(zhuǎn)錄到發(fā)現(xiàn)可以翻譯、通過外泌體影響正常細(xì)胞等。盡管我們通過疾病發(fā)現(xiàn)某些基因的異常表達(dá)，但是其在正常細(xì)胞中是如何發(fā)揮作用的我們還不得而知。因此，我們能否通過血液中的circRNA表達(dá)差異發(fā)現(xiàn)疾病，通過藥物控制血液中的circRNA達(dá)到控制疾病和治療疾病的目的，又能否通過局部治療改變局部circRNA的濃度以達(dá)到改變疾病進(jìn)程的目的，這些都是我們的研究目標(biāo)。同時我們也必須要認(rèn)清現(xiàn)實，我們所探究的circRNA還只是冰山一角，隨著科技和研究手段的發(fā)展和進(jìn)步，必定有更加重要的功能被發(fā)現(xiàn)，在疾病的預(yù)防、診斷和治療中發(fā)揮更大的作用。