2018年春季蘭州市雞肉中磺胺類(lèi)藥物殘留的檢測(cè)與分析

楊建紅

（甘肅省靜寧縣畜牧獸醫(yī)局，甘肅 靜寧 743400）

磺胺類(lèi)藥物是具有對(duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的、人工合成的一類(lèi)藥物的總稱(chēng)，在降低動(dòng)物發(fā)病率和死亡率、促進(jìn)生長(zhǎng)和改善動(dòng)物產(chǎn)品品質(zhì)方面具有顯著作用[1]。磺胺類(lèi)藥物作為飼料添加劑，被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物飼養(yǎng)中[2]。但這類(lèi)藥物也具有較強(qiáng)的毒副作用，可引起機(jī)體過(guò)敏、中毒、導(dǎo)致耐藥性菌株的產(chǎn)生，還可引發(fā)造血系統(tǒng)障礙、溶血性貧血、粒細(xì)胞缺乏癥、再生障礙性貧血、血小板減少癥等疾病。為此，國(guó)內(nèi)外對(duì)其殘留均有限量要求[3]。

磺胺類(lèi)藥物主要通過(guò)動(dòng)物性食品進(jìn)入人體，非法使用違禁藥物、濫用抗菌藥和藥物添加劑、不遵守休藥期規(guī)定是導(dǎo)致動(dòng)物性食品中藥物殘留的主要原因，這些原因可導(dǎo)致藥物以原形或其代謝產(chǎn)物的形式蓄積在動(dòng)物的細(xì)胞、組織、器官或可食性產(chǎn)品中，造成殘留[4]。隨著人們生活水平的提高，無(wú)殘留、優(yōu)質(zhì)、安全、綠色食品日益受到消費(fèi)者的青睞，因而加強(qiáng)獸藥殘留的監(jiān)控和檢測(cè)工作具有重要意義[5]。為了加強(qiáng)蘭州市市售雞肉中磺胺類(lèi)藥物殘留的檢測(cè)、監(jiān)督，采用ELISA法進(jìn)行了磺胺類(lèi)藥物殘留的檢測(cè)，以確保市場(chǎng)上流通雞肉的安全性，保障消費(fèi)者權(quán)益。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 DNM-9602G型微孔板酶標(biāo)儀（北京普朗新技術(shù)有限公司），波長(zhǎng)450～630 nm；MTN-2800D型氮?dú)獯蹈裳b置（北京八方世紀(jì)科技有限公司）；SQ2119N型組織攪碎機(jī)；MH-2型微型振蕩器（海門(mén)市其林貝林儀器制造有限公司）；XW-80A型漩渦混合器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)）；3K15型高速冷凍離心機(jī)（北京博勱行儀器有限公司），轉(zhuǎn)速不低于4 000 r/min；AB135-S型梅特勒電子天平（上海精科實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)），感量為0.000 1 g和0.01 g；優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)（上海優(yōu)普實(shí)業(yè)有限公司）；10 ml玻璃試管，2 ml、50 ml聚苯乙烯離心管；微量移液器：?jiǎn)蔚?0～200 μl、100～1 000 μl，多道250 μl；移液槍,排槍?zhuān)粺?、量筒（所有玻璃儀器均由天津玻璃儀器廠(chǎng)制造，使用前經(jīng)過(guò)超純水反復(fù)洗滌）。

1.1.2 試劑 乙酸乙酯（分析純）、正己烷（分析純）、十二水合磷酸氫二鈉（分析純）、二水合磷酸二氫鈉（分析純）、去離子水。

1.1.3 ELISA試劑盒 本次研究所使用的試劑盒是北京勤邦生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的磺胺七合一快速檢測(cè)試劑盒，批號(hào)為E130413E20。試劑盒保存溫度為2～8℃，所含組分有：96孔酶標(biāo)板1板（包被有酶聯(lián)抗體）；標(biāo)準(zhǔn)液6瓶（1 ml/瓶）：0 μg/L、2 μg/L、4 μg/L、8 μg/L、16 μg/L、32 μg/L；高濃度標(biāo)準(zhǔn)品：1 mg/L（1 ml/瓶）；酶標(biāo)2抗12 ml；抗體工作液10 ml；底物液A液7 ml；底物液B液7 ml；終止液7 ml；20×濃縮洗滌液50 ml。

1.1.4 溶液配制 鹽酸溶液：量取41.5 ml濃鹽酸加入到去離子水中定容至500 ml。氫氧化鈉溶液：稱(chēng)取20.0 g氫氧化鈉加500 ml去離子水溶解混勻。pH=6的磷酸鹽緩沖液：稱(chēng)取1.75 g十二水合磷酸氫化鈉、10.52 g二水合磷酸二氫鈉加500 ml去離子水溶解混勻。復(fù)溶工作液：用去離子水將2×濃縮復(fù)溶液按1∶1體積比進(jìn)行稀釋?zhuān)糜跇颖镜膹?fù)溶，復(fù)溶工作液在4℃環(huán)境下可保存一個(gè)月。洗滌工作液：用去離子水將20×濃縮洗滌液按1∶19體積比進(jìn)行稀釋?zhuān)糜诿笜?biāo)板的洗滌，洗滌工作液在4℃環(huán)境下可保存一個(gè)月。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 2018年2—4月從蘭州市肉菜市場(chǎng)及超市中隨機(jī)抽取40份雞肉作為檢測(cè)對(duì)象，并編號(hào)為1～40號(hào)，詳見(jiàn)表1。

1.2.2 樣品處理 用組織攪碎機(jī)均質(zhì)樣本；稱(chēng)取2.0±0.05 g均質(zhì)物，置于50 ml聚苯乙烯離心管中，加入4 ml pH為6的磷酸鹽緩沖液渦動(dòng)成糊狀，再加入6 ml乙酸乙酯，振蕩1 min后在室溫下（20～25℃），用高速離心機(jī)按3 000 r/min以上的速度離心5 min；取3 ml上清液至10 ml干凈玻璃試管中，用氮?dú)獯蹈裳b置的氮?dú)饬鞔蹈?；加? ml正己烷，用渦旋儀渦動(dòng)30 s，再加入1 ml復(fù)溶工作液渦動(dòng)10 s，然后在室溫下用離心機(jī)按3 000 r/min以上的速度離心5 min；除去上層正己烷相，取下層水相50 μl用于分析。

1.2.3 樣品測(cè)定 將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30 min以上，每種液體試劑使用之前均需搖勻；取出所需數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2～8℃溫度下；洗滌工作液在使用前也需回溫；編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔所在的位置；加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本、酶標(biāo)二抗和抗體工作液：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50 μl到對(duì)應(yīng)的微孔中，隨即加入酶標(biāo)二抗50 μl/孔，再加入抗體工作液50 μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置于25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30 min；洗板：小心揭開(kāi)蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液250 μl/孔洗滌，充分洗滌4～5次，每次間隔10 s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過(guò)的槍頭戳破）；顯色：加入底物液A液50 μl/孔，再加底物液B液50 μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置于25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15 min；測(cè)定：加入終止液50 μl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處（建議用雙波長(zhǎng)450/630 nm檢測(cè)，并在5 min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測(cè)定每孔OD值。

1.2.4 百分吸光率的計(jì)算 標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，公式如下：

表1 樣品采集情況

式中B為標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值，B0為0 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)、磺胺類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/kg）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中磺胺類(lèi)藥物的實(shí)際濃度。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 對(duì)兩組以上的數(shù)據(jù)差異顯著性分析用方差分析即“F檢驗(yàn)”，主要有組內(nèi)變異和組間變異。組內(nèi)偏差平方和（SSw）、組間偏差平方和（SSb）除以各自的自由度(組內(nèi)dfw=n-m，組間dfb=m-1，其中n為樣本總數(shù)，m為組數(shù))，得到其均方MSw和MSb。一種情況是處理沒(méi)有作用即MSb/MSw≈1；另一種情況是處理確實(shí)有作用，組間均方是由于誤差與不同處理共同導(dǎo)致的結(jié)果，MSb》MSw(遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于)。MSb/MSw比值構(gòu)成F分布，F(xiàn)值大于1有顯著差異，反之則沒(méi)有。

1.2.7 判定標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-7-2008的規(guī)定，雞肉中磺胺類(lèi)藥物殘留限量≤100 μg/kg，超過(guò)此限量值則為不合格。

2 結(jié)果與分析

2.1 2月份雞肉中磺胺類(lèi)藥物的殘留量

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 第一批次試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)符合的量的偏差在0.4%范圍內(nèi)，平均偏差為0.167%。本次檢測(cè)存在的誤差極小，檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)表2）可用于判定樣品中磺胺類(lèi)藥物的實(shí)際殘留量，所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖1。

2.1.2 雞肉中磺胺藥的殘留量 2月份雞肉的檢測(cè)結(jié)果顯示，10份樣品中均含有磺胺藥殘留，檢出率為100%，其中檢出的最大殘留量為18.12 μg/kg，最小殘留量為0.783 μg/kg。3號(hào)疑似磺胺類(lèi)藥物殘留量較高，應(yīng)再次檢測(cè)以確定是否過(guò)高。其他的檢測(cè)濃度均在0.783μg/kg以下，在＜100 μg/kg的正常范圍內(nèi)，詳見(jiàn)表3。

表2 第一批次標(biāo)準(zhǔn)品中磺胺類(lèi)藥物的量

表3 2月份雞肉中磺胺類(lèi)藥物殘留的檢出量與百分吸光度值

圖1 第一次檢測(cè)磺胺類(lèi)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.2 3月份雞肉中磺胺類(lèi)藥物的殘留量

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 第二批次的試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該符合的量的偏差在0.5%內(nèi)，平均偏差為0.233%。說(shuō)明本次檢測(cè)存在的誤差較小，檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)表4）可以用于判定樣品中磺胺類(lèi)藥物的實(shí)際殘留量，所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖2。

圖2 第二次檢測(cè)磺胺類(lèi)藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.2.2 雞肉中磺胺類(lèi)藥物的殘留量 3月份的檢測(cè)結(jié)果如表5所示，其離散系數(shù)小于13，說(shuō)明該組試驗(yàn)重復(fù)性好。10份樣品中均含有磺胺類(lèi)藥物，檢出率為100%，其中最小殘留量＜0.500 μg/kg，最大殘留量為1.76 μg/kg，均符合農(nóng)業(yè)部對(duì)磺胺類(lèi)藥物殘留限量的規(guī)定。

表4 第二批次標(biāo)準(zhǔn)品中磺胺類(lèi)藥物的量

表5 3月份雞肉中磺胺類(lèi)藥物殘留情況

2.3 4月份雞肉中磺胺藥的殘留量

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 第三批次檢測(cè)的最大試驗(yàn)偏差為0.7%，說(shuō)明本次檢測(cè)的誤差在允許范圍內(nèi)，檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)表6）可以用于判定樣品中磺胺類(lèi)藥物的實(shí)際殘留量，所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖3。

2.3.2 雞肉中磺胺類(lèi)藥物的殘留量 4月份的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表7，20份樣品中有19份含有磺胺類(lèi)藥物殘留，檢出率為95%，磺胺類(lèi)藥物的最大殘留量為4.54 μg/kg，均在農(nóng)業(yè)部規(guī)定的磺胺類(lèi)藥物殘留限量?jī)?nèi)。

圖3 第三次檢測(cè)磺胺類(lèi)藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

表6 標(biāo)準(zhǔn)品中磺胺類(lèi)藥物的量

表7 4月份雞肉中磺胺類(lèi)藥物殘留情況

2.4 不同月份雞肉中磺胺藥殘留量比較分析

2018年2—4月份蘭州市市售雞肉中磺胺類(lèi)藥物檢出率從100%下降到95%，實(shí)際檢出最小值從2月份的0.783 μg/kg減小為4月份的0 μg/kg，檢出平均值從1.89 μg/kg減小為0.34 μg/kg（詳見(jiàn)表8、圖4）。

統(tǒng)計(jì)分析可知2—4月份的檢測(cè)變異系數(shù)分別為0.169、0.664、0.733，試驗(yàn)誤差很小。組間方差為0.017、組內(nèi)方差為0.21，F(xiàn)值為1.496大于1，說(shuō)明3組試驗(yàn)間有顯著差異。3次試驗(yàn)均存在誤差，但均有研究意義。

圖4 2—4月份雞肉中磺胺類(lèi)藥物的殘留情況

2.5 不同采樣地點(diǎn)雞肉中磺胺類(lèi)藥物殘留量比較分析

檢測(cè)結(jié)果顯示，2018年2—4月份從超市抽取的雞肉樣品磺胺類(lèi)藥物殘留量的檢出率為100%，實(shí)際檢出最小值為0 μg/kg、最大值為1.66 μg/kg、平均值為0.419 μg/kg；從市場(chǎng)抽取的雞肉樣品磺胺類(lèi)藥物殘留量的檢出率為95%，實(shí)際檢出最小值為0.641 μg/kg、最大值為18.12 μg/kg、平均值為1.369 μg/kg（詳見(jiàn)表9、圖5）。

經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析可知，市場(chǎng)和超市的檢測(cè)變異系數(shù)分別為0.328、0.195，試驗(yàn)誤差很小。市場(chǎng)檢驗(yàn)的方差為0.274，超市檢驗(yàn)的方差為0.133，F(xiàn)值為2.06大于1，說(shuō)明市場(chǎng)檢驗(yàn)與超市檢驗(yàn)間有顯著差異。試驗(yàn)存在誤差，但具有研究意義。

圖5 市場(chǎng)與超市中雞肉檢測(cè)結(jié)果比較

表8 不同月份雞肉中磺胺類(lèi)藥物殘留情況

表9 不同采樣地點(diǎn)雞肉中磺胺類(lèi)藥物殘留情況

3 討論

ELISA檢測(cè)法既可測(cè)抗原，也可測(cè)抗體；既可進(jìn)行定性測(cè)定，又可進(jìn)行定量測(cè)定。具有快速、靈敏、操作簡(jiǎn)單、特異性好、經(jīng)濟(jì)、無(wú)污染、不需大型儀器設(shè)備、技術(shù)要求低等優(yōu)點(diǎn)，適合大批樣品的篩選檢測(cè)，在實(shí)際應(yīng)用中可更方便地檢測(cè)雞肉中磺胺類(lèi)藥物的殘留是否超標(biāo)[6]。

為了保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，檢測(cè)前需將所有試劑和所需板條的溫度回升至室溫（20～25℃），否則會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)品的OD值偏低[7]。溫度太低會(huì)減弱甚至抑制抗體抗原反應(yīng)，導(dǎo)致在正常試驗(yàn)時(shí)間內(nèi)反應(yīng)還不完全便被加入停止液終止反應(yīng)，使得最終結(jié)果不正確。洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。試劑盒應(yīng)儲(chǔ)存在2～8℃溫度下，不能冷凍。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無(wú)色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，應(yīng)避免直接暴露于光下。在所有恒溫孵育過(guò)程中，應(yīng)用蓋板膜蓋住微孔板，避免光線(xiàn)照射。

試驗(yàn)結(jié)果表明：所有樣品中磺胺類(lèi)藥物的殘留量范圍為0～18.13 μg/kg，均符合農(nóng)業(yè)部規(guī)定的磺胺類(lèi)藥物的殘留限量，合格率為100%。說(shuō)明蘭州市銷(xiāo)售的雞肉中磺胺類(lèi)藥物未超標(biāo)，消費(fèi)者可以放心食用。