Gαi2C-末端肽段靶向超聲造影劑的制備及靶向性評(píng)價(jià)

蔣 華 穆玉明 王春梅 周賢惠 張 健

1.成都大學(xué)附屬醫(yī)院老年病科，四川成都 610081；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)中心心臟超聲診斷科，新疆烏魯木齊 830011；3.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟中心，新疆烏魯木齊 830011

靶向超聲造影劑是近年來超聲醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。超聲靶向微泡破壞（ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD）是一種非病毒載體的基因轉(zhuǎn)染方式，其具有操作簡單、安全快捷、靶器官高度特異性等優(yōu)勢，可用于心肌基因治療[1-3]。

研究表明[4]，迷走神經(jīng)張力異常與陣發(fā)性房顫的發(fā)生密切相關(guān)，阻斷迷走神經(jīng)可以降低房顫的發(fā)生率[5]。G 蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑通過調(diào)控自主神經(jīng)活性從而達(dá)到誘發(fā)和維持房顫發(fā)生的作用。Gαi2C-末端肽段（Gαi2C-terminal peptide，Gαi2ctp）可以干擾Gαiβγ 三聚體的解離，阻斷G 蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，降低自主神經(jīng)介導(dǎo)的房顫發(fā)生[6-7]。故本研究采用靜電吸附法將其連接到造影劑SonoVue 微泡表面，并量化尋找最佳攜帶劑量，利用UTMD 提高其到達(dá)心臟的效率，從而為Gαi2ctp 成功轉(zhuǎn)導(dǎo)至體內(nèi)發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

超聲微泡造影劑SonoVue（意大利BRACCO，15A022A）；熒光標(biāo)記的Gαi2ctp[5-羧基四甲基羅丹明（5-TAMRA）-Gαi2ctp，廣州特立生物科技有限公司特約合成]；流式細(xì)胞儀（美國，Beckman Cytometer GALLIOS）；漩渦混合器（廣州，IKAMS-3）；熒光倒置顯微鏡（德國，LEICA CTR6000）；彩色多普勒超聲診斷儀（美國，GE VIVID 7 DIMENSON）。

1.2 Gαi2ctp 靶向微泡的制備及分組

采用靜電吸附法制備靶向微泡，根據(jù)Aistrup 等[6]的研究結(jié)果，將5-TAMRA-Gαi2ctp 分為0.5、1.5、3 mg/L三組，生理鹽水溶解后與SonoVue 微泡混懸液混和，室溫下充分混勻，調(diào)整pH 值至4.5，漩渦混合器振蕩約1 min，室溫下孵育、靜置。采用浮選法[8]洗滌：將混懸液置于離心管中，加入等量的0.9%氯化鈉，轉(zhuǎn)速400 r/min、離心1 min、離心半徑1.5 mm（至微泡聚集在液相的頂部），棄去下清液，重復(fù)洗滌2 次。每組平行6 次。

1.3 Gαi2ctp 靶向微泡的鑒定

1.3.1 體外評(píng)價(jià) ①熒光顯微鏡下觀察Gαi2ctp 與微泡的結(jié)合情況，靶向微泡的形態(tài)及分布；②流式細(xì)胞儀評(píng)價(jià)靜置0.5、1、2 h Gαi2ctp 靶向微泡的攜帶率及洗滌前后Gαi2ctp 靶向微泡攜帶率。

1.3.2 體內(nèi)評(píng)價(jià) ①實(shí)驗(yàn)分組及房顫模型制備：成年健康雜種犬14 只，雌雄不拘，體重14～23 kg，平均（15.6±4.8）kg；年齡2～5 歲，平均（2.3±1.1）歲。依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表將其分為實(shí)驗(yàn)組（攜1.5 mg/L Gαi2ctp 靶向微泡）及對(duì)照組（SonoVue 空白微泡），每組7 只，參照Xue 等[9]的方法制備犬房顫模型。本實(shí)驗(yàn)通過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：A-20101020001）。

②利用UTMD 靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)Gαi2ctp：兩組犬分別由靜脈注入攜1.5 mg/L Gαi2ctp 靶向微泡和SonoVue空白微泡，應(yīng)用相同的超聲條件進(jìn)行輻照治療：采用Vivid 7 彩色多普勒超聲診斷儀，M3S 探頭，二次諧波造影模式，機(jī)械指數(shù)爆破前后分別為0.08、1.0，F(xiàn)LASH擊碎微泡，心電觸發(fā)在左心房定點(diǎn)爆破，每6 個(gè)心動(dòng)周期擊碎一次，直至心腔內(nèi)微泡完全消失。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，行犬左心房組織冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察犬左心房及肺靜脈熒光物質(zhì)表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較采用重復(fù)測量方差分析，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 微泡的外觀及熒光檢驗(yàn)

Gαi2ctp 靶向微泡熒光顯微鏡下可見外殼熒光染色均勻，呈環(huán)狀，微泡表面發(fā)出橙紅色熒光。見圖1。

圖1 Gαi2ctp 靶向微泡微熒光顯微鏡下圖（200×）

2.2 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

2.2.1 不同靜置時(shí)間Gαi2ctp 靶向微泡攜帶率比較三組時(shí)間、組間及交互作用比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。1.5 mg/L 組靜置0.5、1、2 h Gαi2ctp靶向微泡攜帶率高于3 mg/L 組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.01）；1.5 mg/L 組與0.5 mg/L 組靜置0.5、1、2 h Gαi2ctp 靶向微泡攜帶率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。3 mg/L 組不同時(shí)間Gαi2ctp 攜帶率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.330，P=0.030）。見表1。

2.2.2 洗滌前后Gαi2ctp 攜帶率比較 1.5 mg/L 組洗滌前后攜帶率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。3 mg/L 組和0.5 mg/L 組洗滌后Gαi2ctp 靶向微泡攜帶率低于攜帶前，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.01）。見表2、圖2。

表1 不同靜置時(shí)間Gαi2ctp 靶向微泡的攜帶率比較（%，，n=6）

表1 不同靜置時(shí)間Gαi2ctp 靶向微泡的攜帶率比較（%，，n=6）

注：與1.5 mg/L 組同期比較，aP ＜0.01。Gαi2ctp：Gαi2C-末端肽段

表2 洗滌前后Gαi2ctp 靶向微泡攜帶率比較（，n=6）

表2 洗滌前后Gαi2ctp 靶向微泡攜帶率比較（，n=6）

注：與本組洗滌前比較，aP ＜0.01。Gαi2ctp：Gαi2C-末端肽段

2.3 Gαi2ctp 微泡靶向性的體內(nèi)評(píng)價(jià)

熒光顯微鏡下觀察，實(shí)驗(yàn)組左心房及肺靜脈激發(fā)出橙紅色熒光，而對(duì)照組無熒光物質(zhì)聚集。見圖3。

3 討論

超聲分子成像是一種新型的非侵入性生物分子顯像技術(shù)，而靶向微泡造影劑的構(gòu)建是超聲分子成像的基礎(chǔ)[10]。微泡造影劑與特異性抗體或配體偶聯(lián)的結(jié)合方法多種多樣，每種方式各有優(yōu)劣[11-13]。本實(shí)驗(yàn)采用的靜電吸附法是利用脂質(zhì)微泡的化學(xué)雙極性（疏水端和親水端），通過自身離子鍵、物理吸附（范德華力）等方法將目標(biāo)配體Gαi2ctp 偶聯(lián)在微泡殼膜上，制成靶向微泡。造影劑SonoVue 含磷脂單層，性質(zhì)穩(wěn)定，安全性好。將羅丹明磺化的目的是通過親電取代反應(yīng)用磺酸基（-SO3H）取代其本身的氫離子，增加其水溶性和生物學(xué)活性。近幾年，不少國內(nèi)學(xué)者們嘗試用靜電吸附法制備靶向造影劑[14-16]。岳媛媛等[17]利用靜電吸附法將靶向微泡與大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞偶聯(lián)，制備出靶向微泡-干細(xì)胞復(fù)合體，進(jìn)一步拓寬了此方法在超聲醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。本研究結(jié)果顯示，靶向造影劑在熒光顯微鏡下激發(fā)出橙紅色熒光，1.5 mg/L 組Gαi2ctp 微泡造影劑攜帶率最高，洗滌前后攜帶率變化不大。

圖2 各組Gαi2ctp 靶向微泡造影劑攜帶率檢測結(jié)果

圖3 左心房及肺靜脈冰凍切片熒光顯微鏡結(jié)果圖（50×）

制備成功的Gαi2ctp 造影劑微泡能否成功到達(dá)靶組織，是驗(yàn)證其靶向性的關(guān)鍵。近年來，UTMD 成為超聲醫(yī)學(xué)領(lǐng)域一種新型的基因傳輸及靶向給藥方法，廣泛應(yīng)用于腫瘤、心血管疾病的基因治療等領(lǐng)域[18-21]。當(dāng)靶向微泡到達(dá)特定組織時(shí)，利用UTMD 產(chǎn)生的空化效應(yīng)、聲孔效應(yīng)、內(nèi)吞作用和聲輻射力等，提高細(xì)胞和毛細(xì)血管的通透性，從而增加基因轉(zhuǎn)染效率，是一種理想的基因載體系統(tǒng)[22-23]。Chen 等[24]應(yīng)用UTMD 將含胰高血糖素樣肽-1 基因PB 轉(zhuǎn)座子的質(zhì)粒微泡轉(zhuǎn)導(dǎo)至心肌病大鼠體內(nèi)，通過胰高血糖素樣肽-1 基因刺激心肌再生，治療阿霉素心肌病。遲婷婷等[25]應(yīng)用UTMD將成纖維細(xì)胞生長因子（aFGF）轉(zhuǎn)導(dǎo)至大鼠心肌組織，證實(shí)微泡靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)aFGF 可以改善糖尿病心肌病大鼠左心室心肌血流灌注。本研究試圖利用UTMD 將Gαi2ctp 定向輸送至犬左心房，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組犬左心房及肺靜脈可見明亮的橙紅色熒光表達(dá)，對(duì)照組未出現(xiàn)橙紅色熒光，提示Gαi2ctp 成功轉(zhuǎn)導(dǎo)至犬左心房及肺靜脈組織。

因此本研究認(rèn)為利用靜電吸附法可以成功制備Gαi2ctp 靶向微泡，其性質(zhì)穩(wěn)定，目的肽段攜帶率高，靶向性明確，方法簡便易行，從而為研究外源性Gαi2ctp的生物學(xué)效應(yīng)提供有力的支持。