家蠶微孢子蟲(chóng)分子生物學(xué)研究進(jìn)展

龔美霞，浦月霞，莫炳巧，冉艷萍，李楓燁

（廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣總站，南寧市530007）

微孢子蟲(chóng)（Microsporidia）是一類能形成孢子的專營(yíng)細(xì)胞寄生生物，寄主范圍廣泛，從無(wú)脊椎動(dòng)物到脊椎動(dòng)物，都能被其感染，曾經(jīng)被認(rèn)為是原生動(dòng)物，但現(xiàn)在被劃分為真菌界［1-2］。家蠶微孢子蟲(chóng)（Nosema bombycis，Nb）是引起家蠶微粒子病的病原，也是第一個(gè)被鑒定的微孢子蟲(chóng)。家蠶微孢子蟲(chóng)對(duì)家蠶的侵染潛伏期長(zhǎng)，傳播范圍廣，不僅能通過(guò)食下傳染，而且能寄生于蠶幼蟲(chóng)、蛹和蛾，并通過(guò)蠶卵傳染至下一代，給養(yǎng)蠶業(yè)造成的損失重大，嚴(yán)重影響蠶桑產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展。因此，家蠶微孢子蟲(chóng)被列為蠶種生產(chǎn)的唯一檢疫對(duì)象。研究者對(duì)家蠶微孢子蟲(chóng)的診斷技術(shù)［3］和家蠶微粒子病的防控技術(shù)［4-5］的研究較為充分，隨著家蠶微孢子蟲(chóng)全基因組序列測(cè)序的完成，家蠶微孢子蟲(chóng)的研究進(jìn)展迅速，尤其是家蠶微孢子蟲(chóng)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，使人們對(duì)家蠶微孢子蟲(chóng)侵染相關(guān)蛋白有了一定的了解。本文從家蠶微孢子蟲(chóng)的分子生物學(xué)檢測(cè)、基因序列分析、侵染相關(guān)基因等方面進(jìn)行論述，為家蠶微孢子蟲(chóng)分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為家蠶微孢子蟲(chóng)不同功能基因的挖掘提供科學(xué)依據(jù)，為進(jìn)一步闡明家蠶微孢子蟲(chóng)與宿主家蠶的侵染機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 家蠶微孢子蟲(chóng)分子生物學(xué)檢測(cè)方法研究進(jìn)展

1.1 核酸分子雜交檢測(cè)法

核酸分子雜交檢測(cè)法的基本原理是具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下（適宜的溫度及離子強(qiáng)度等）可按堿基互補(bǔ)原則形成雙鏈的高度特異性雜交。邱寶利等［6-7］用核酸雜交檢測(cè)技術(shù)，以1對(duì)Nb特異引物合成的地高辛（DIG）為探針，把帶毒蠶蛾和蠶卵從11種病原性微孢子蟲(chóng)中鑒定出來(lái)。韋亞?wèn)|等［8］采用原位雜交技術(shù)，在感染家蠶微孢子蟲(chóng)的單粒卵內(nèi)和幼蟲(chóng)中均檢測(cè)到家蠶微孢子蟲(chóng)，并且該方法還可以用于感染家蠶微孢子蟲(chóng)蠶卵和幼蟲(chóng)體的早期診斷。但利用核酸分子雜交檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)家蠶微孢子蟲(chóng)存在操作難度大、耗時(shí)和對(duì)儀器有一定要求等不足，一定程度上限制了該方法的研究與應(yīng)用。

1.2 PCR檢測(cè)方法

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種在體外模擬自然DNA復(fù)制過(guò)程的特定DNA序列擴(kuò)增技術(shù)，在數(shù)小時(shí)內(nèi)可將靶DNA擴(kuò)增至百萬(wàn)倍。采用普通PCR法檢測(cè)家蠶微孢子蟲(chóng)時(shí)，以家蠶微孢子蟲(chóng)的16s-rDNA序列［9］、rRNA基因序列［10］、核糖體小亞單位RNA（SSU rRNA）基因序列［11-12］和基因組DNA序列［13］來(lái)設(shè)計(jì)特異性引物，均能檢出家蠶微孢子蟲(chóng)。蔡平鐘等［13］以家蠶微孢子蟲(chóng)基因組DNA序列設(shè)計(jì)的引物對(duì)NbDNA的檢測(cè)靈敏度達(dá)1 ng水平。劉吉平等［14］以Nb孢子SSU rRNA的保守區(qū)域設(shè)計(jì)的引物，對(duì)Nb純孢子DNA模板和模擬染毒Nb孢子的蠶蛾DNA模板的檢測(cè)敏感度分別達(dá)到3×104個(gè)/mL和3×105個(gè)/mL。HATAKEYAMA等［15］建立了一種可以檢測(cè)家蠶卵微孢子蟲(chóng)的多引物PCR法。為了進(jìn)一步提高PCR方法檢測(cè)家蠶微粒子病的靈敏性與準(zhǔn)確性，何永強(qiáng)等［16］比較了普通PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)家蠶微孢子蟲(chóng)的靈敏度，認(rèn)為利用TaqMan探針熒光定量PCR檢測(cè)方法和SYBR Green熒光定量PCR檢測(cè)方法檢測(cè)家蠶微孢子蟲(chóng)發(fā)芽液的靈敏度相近，均優(yōu)于普通PCR，并建立了家蠶微孢子蟲(chóng)TaqMan探針熒光定量PCR檢測(cè)方法及開(kāi)發(fā)了相應(yīng)的診斷試劑盒，該方法檢測(cè)家蠶微孢子蟲(chóng)的特異性高，敏感度達(dá)1×102個(gè)/mL［17］。也有研究基于SYBR Green熒光定量PCR建立柞蠶微孢子蟲(chóng)檢測(cè)方法［18］。扈鴻霞等［19］以微孢子蟲(chóng) SSU rRNA基因的保守序列為靶標(biāo)，建立了一種用于檢測(cè)蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)的套式PCR，檢測(cè)的微孢子蟲(chóng)數(shù)量達(dá)1.22×104個(gè)/mL，該方法具有靈敏、快捷、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。基于PCR的家蠶微孢子蟲(chóng)檢測(cè)雖然具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，但是要求的技術(shù)相對(duì)較高，單次檢驗(yàn)的數(shù)量少，現(xiàn)多用于實(shí)驗(yàn)室研究，暫時(shí)未適應(yīng)和滿足大生產(chǎn)的要求。

1.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)方法

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是日本學(xué)者近年來(lái)建立的一種新型核酸體外等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)［20］，其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件（63℃左右）保溫30～60 min，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。經(jīng)過(guò)多年的研究與技術(shù)提升，已廣泛應(yīng)用于病原微生物的檢測(cè)［10，21-22］。近年來(lái)，LAMP技術(shù)在家蠶微孢子蟲(chóng)檢測(cè)的研究也取得了很大的進(jìn)展。YAN等［23］把FTA cards和LAMP技術(shù)結(jié)合，對(duì)家蠶微孢子蟲(chóng)的最低檢測(cè)極限為10個(gè)孢子/mL，該方法用于感染家蠶微粒子病的早期診斷時(shí)間比常規(guī)的顯微鏡檢測(cè)提早24 h左右。劉吉平等［24］以多種家蠶病原微孢子蟲(chóng)16S rDNA的保守序列為特異性引物，建立了一種能夠有效檢測(cè)多種昆蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)LAMP檢測(cè)方法和可視化快速檢測(cè)試劑盒，能夠檢測(cè)到濃度為103個(gè)/mL的微孢子蟲(chóng)。為了快速有效地檢出蠶卵微粒子病，劉吉平［25-26］以家蠶微孢子蟲(chóng)孢子繁殖復(fù)制相關(guān)的EB1基因?yàn)榘谢颍⒘艘环N檢測(cè)蠶卵感染家蠶微粒子病的LAMP檢測(cè)方法，并且該方法對(duì)家蠶微孢子蟲(chóng)孢子DNA和EB1-pMDTM19-T質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)靈敏度分別為5.0×10-3ng/μL和1.0×102copies/μL，能檢測(cè)人工感染Nb家蠶單個(gè)母蛾產(chǎn)卵的1/8卵圈量或1粒蠶卵。XIE等［27］研究者把LMAP技術(shù)與電化學(xué)方法結(jié)合，通過(guò)追蹤LAMP擴(kuò)增中生成的Pi，實(shí)現(xiàn)了基于LAMP技術(shù)檢測(cè)家蠶微孢子蟲(chóng)的定性和定量研究，該檢測(cè)方法對(duì)目標(biāo)基因組DNA的定量檢測(cè)極限是1.7×10-5ng/μL，檢測(cè)的靈敏度大大高于單一LAMP技術(shù)的靈敏度。基于LAMP的診斷技術(shù)因其靈敏度高、肉眼可視和操作的可行性，研究者不僅開(kāi)發(fā)了商用試劑盒用于實(shí)驗(yàn)室的精確診斷研究，還有望開(kāi)發(fā)用于生產(chǎn)上的大批量診斷。

2 家蠶微孢子蟲(chóng)基因序列鑒定的研究進(jìn)展

2.1 家蠶微孢子蟲(chóng)RNA序列的測(cè)序分析

2.1.1 家蠶微孢子蟲(chóng)的SSUrRNA的測(cè)序分析 微孢子蟲(chóng)類是唯一帶有原核生物型核糖體的真核生物［28］，其核糖體是包含50 S和30 S大小兩個(gè)亞基的70 S型核糖體，其中小亞基中的rRNA為16S rRNA，它被稱為小亞基核糖體RNA（small subunit ribosomal RNA，SSUrRNA）。研究者最先用脈沖場(chǎng)凝膠電泳中分離出一條rRNA條帶，并用Southern雜交方法證實(shí)了家蠶微孢子蟲(chóng)的SSU rRNA基因位于760 kb的一條染色體上［29］，隨后王見(jiàn)楊等［30］克隆獲得了SSUrRNA的全基因序列，全序列長(zhǎng)1 233 bp。

2.1.2 家蠶微孢子蟲(chóng)小RNAs的測(cè)序分析 小RNAs根據(jù)不同的生物合成機(jī)制，小RNAs可以分成3個(gè)不同 的類別：microRNAs（miRNAs），小干涉 RNA（siRNA）和 PIWI-interacting RNAs（piRNAs）［31］。許金山教授研究室于2013年完成了對(duì)家蠶微孢子蟲(chóng)小RNAs的全基因組鑒定與分析，擬在鑒定與轉(zhuǎn)座子相關(guān)的小RNAs和潛在的miRNAs［32］。家蠶微孢子蟲(chóng)小RNAs的長(zhǎng)度多數(shù)為24 nt和25 nt，其中大部分序列表現(xiàn)出5＇末端的尿嘧啶（U）偏好性。通過(guò)與家蠶微孢子蟲(chóng)數(shù)據(jù)庫(kù)配對(duì)，家蠶微孢子蟲(chóng)中有661 609個(gè)小RNAs，其中，75.93%小RNAs序列為基因組非編碼區(qū)序列，21.68%為基因組重復(fù)序列，蛋白編碼序列、tRNA和rDNA分別占1.73%、0.65%和0.01%。鑒定獲得了31個(gè)候選miRNAs，其中有19個(gè)miRNAs為Nosema屬的其他孢子蟲(chóng)所共有，暗示其在微孢子蟲(chóng)基因組進(jìn)化上具有保守性［32］。

2.2 家蠶微孢子蟲(chóng)基因組測(cè)序分析

基因組（genome）是指一個(gè)生物體DNA（某些病毒RNA）中所包含的所有遺傳信息，其中包括基因編碼區(qū)和非編碼區(qū)。早期的研究中，研究者利用脈沖場(chǎng)凝膠電泳從家蠶微孢子蟲(chóng)染色體DNA中獲得18個(gè)條帶，條帶大小在380～1 500 kbp之間，DNA總長(zhǎng)度約15.3 Mb［29］。2013年，西南大學(xué)周澤揚(yáng)研究團(tuán)隊(duì)完成了家蠶微孢子蟲(chóng)CQ1分離株的全基因組測(cè)序［33］。家蠶微孢子蟲(chóng)有18條染色體，由3 551個(gè)重疊群構(gòu)成1 605個(gè)scaffolds；基因組大小為15.7 Mb，共鑒定了4 458個(gè)基因，平均每個(gè)基因序列長(zhǎng)度為741 bp；基因組中含有942對(duì)重復(fù)序列，占基因組總長(zhǎng)45.2%，GC含量為30.7%。40%的基因具有注釋功能，157個(gè)基因預(yù)測(cè)有內(nèi)含子［33］。家蠶微孢子蟲(chóng)全基因組測(cè)序的完成，不僅為研究其基因功能和發(fā)掘新基因提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，大大加快微粒子病的診斷和防控研究，也將進(jìn)一步推動(dòng)微孢子蟲(chóng)分子生物學(xué)的深入研究。

2.3 家蠶微孢子蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析

轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）是指特定細(xì)胞群在某一功能狀態(tài)下所轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有RNA的總和，包括mRNA和非編碼RNA。轉(zhuǎn)錄組的研究可以通過(guò)基因芯片、cDNA文庫(kù)和新一代的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等技術(shù)來(lái)進(jìn)行。通過(guò)對(duì)家蠶微孢子蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析，可以獲得基因表達(dá)信息、基因序列和結(jié)構(gòu)信息。

2.3.1 家蠶微孢子蟲(chóng)EST序列的測(cè)定 構(gòu)建cDNA文庫(kù)并進(jìn)行表達(dá)序列表標(biāo)簽（expressed sequence tag，EST）測(cè)序，不僅可以獲得基因組中具有重要功能的基因，而且能夠反映出某個(gè)組織或個(gè)體在特定時(shí)期的基因表達(dá)豐度。李田等［34］對(duì)感染家蠶微孢子蟲(chóng)第10 d的家蠶幼蟲(chóng)構(gòu)建Nb和家蠶絲腺混合樣品的cDNA文庫(kù)并測(cè)序，共獲得EST序列5 026條，拼接后分別獲得的Nb和絲腺的單一EST為383和563條。在此時(shí)期，Nb的組蛋白、細(xì)胞分裂激酶等與孢子分裂增殖相關(guān)的基因和Nb SWP蛋白、極絲蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白等可能與Nb感染或寄生適應(yīng)相關(guān)的基因的表達(dá)水平都較高。

2.3.2 家蠶微孢子蟲(chóng)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 新一代高通量測(cè)序技術(shù)，能夠全面快速地獲得某一物種特定細(xì)胞、組織或器官在某一狀態(tài)下幾乎所有的轉(zhuǎn)錄本序列，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的獲得為加快基因功能和結(jié)構(gòu)的研究奠定了基礎(chǔ)。劉吉平課題組采用RNA-Seq測(cè)序技術(shù)對(duì)家蠶微孢子蟲(chóng)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，家蠶微孢子蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組的GC含量約為30%，共獲得2 903條基因序列，其中已被注釋的基因有1 414個(gè)，未被注釋的序列有1 489條，另外還有未能組裝成功的基因序列200條［35］。從預(yù)測(cè)的基因中選擇一些功能基因如孢壁蛋白（HSWP）基因、極絲蛋白（PTP）基因、熱激蛋白（HSP）基因等進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果與預(yù)測(cè)基因序列的一致性均達(dá)到98%以上，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析結(jié)果是可靠的［35-36］。LIU等［37］對(duì)家蠶微孢子蟲(chóng)休眠孢子（Nongerminated spore，NGS）和發(fā)芽孢子（Germinated spore，GS）進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序并分別獲得2 756和2 690個(gè)鑒定基因。差異表達(dá)分析共獲得66個(gè)顯著差異基因，其中顯著上調(diào)基因9個(gè)，包括蛋白磷酸酶PP2-A調(diào)節(jié)亞基；顯著下調(diào)基因57個(gè)，主要包括糖代謝相關(guān)基因、SWP及RBL等。KEGG分析結(jié)果顯示顯著差異基因主要富集在戊糖磷酸途徑和氨基糖核糖代謝途徑。

3 家蠶微孢子蟲(chóng)侵染相關(guān)基因的研究

3.1 極管蛋白（polar tube protein，PTP）的研究

極管是微孢子蟲(chóng)特有的侵染結(jié)構(gòu)。極管蛋白是組裝極管的重要成分，特異定位于微孢子蟲(chóng)極管上。研究微孢子蟲(chóng)極管的蛋白組成，對(duì)于掌握極管這一特殊侵染裝置的結(jié)構(gòu)及其在侵染宿主細(xì)胞過(guò)程中所起的作用方面有著非常重要的意義。家蠶微孢子蟲(chóng)中已鑒定的極管蛋白主要有3個(gè)，NbPTP1、NbPTP2和NbPTP3［38］。吳玉嬌等［39］在原核表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)重組NbPTP1蛋白并驗(yàn)證其能準(zhǔn)確定位于家蠶微孢子蟲(chóng)的極管上。研究發(fā)現(xiàn)家蠶微孢子蟲(chóng)的3種極管蛋白能相互作用，但微孢子蟲(chóng)極管發(fā)芽機(jī)制以及極管與宿主細(xì)胞間的互作關(guān)系尚不明確。此外，在蝗蟲(chóng)（Antonospora locustae）微孢子蟲(chóng)中，發(fā)現(xiàn)2個(gè)與AlPTP2相關(guān)的極管蛋白AlPTP2b和 AlPTP2c［40］，在其他微孢子蟲(chóng)中還鑒定出PTP4和PTP5［41-42］。

3.2 孢壁蛋白（spore wall protein，SWP）的研究

微孢子蟲(chóng)的孢壁是孢子最外層的結(jié)構(gòu)，是最先、最直接與宿主接觸的部位，其主要組成成分是孢壁蛋白。對(duì)孢壁蛋白進(jìn)行分離鑒定，研究其生物學(xué)功能，對(duì)于闡明微孢子蟲(chóng)侵染機(jī)制以及與宿主之間的關(guān)系非常重要。目前，已發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的家蠶微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白主要有SWP30、SWP32、SWP25、SWP26、SWP5、SWP11、SWP12和 SWP16、SWP7和 SWP9。SWP32和SWP25可能與家蠶微孢子蟲(chóng)發(fā)芽有關(guān)［43］，SWP25互作蛋白的篩選實(shí)驗(yàn)，認(rèn)為在家蠶微孢子蟲(chóng)入侵時(shí)起到作用并與孢壁蛋白SWP25具有互作作用的是家蠶硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶（BmTpx）和家蠶蛋白激酶C受體1（BmRACKA）［44］；SWP26肝素結(jié)合基序是家蠶微孢子蟲(chóng)對(duì)宿主細(xì)胞粘附作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域［45］，此外，SWP26與家蠶類海龜?shù)鞍祝˙ombyx moriturtle-like protein，BmTLP）之間存在相互作用［46］。NbSWP16蛋白可能與家蠶微孢子蟲(chóng)的孢壁蛋白NbSWP1、NbSWP3、NbSWP5及NbHSWP6之間存在相互作用［47］。SWP5可與家蠶微孢子極管蛋白PTP2和 PTP3相互作用［48］，SWP9與極管 NbPTP1和NbPTP2蛋白相互作用，并且通過(guò)盤(pán)繞極管附在孢子壁上而促進(jìn)發(fā)芽過(guò)程［49］。SWP12是一個(gè)含BAR（Bin/Amphiphysin/Rvs）結(jié)構(gòu)域的孢壁蛋白［50］，與NbSWP9通過(guò)家蠶微孢子蟲(chóng)孢內(nèi)壁幾丁質(zhì)結(jié)合而參與孢壁的形成和穩(wěn)定不同［51］，SWP12通過(guò)粘附在家蠶微孢子幾丁質(zhì)外殼上維持孢壁的穩(wěn)定性。此外，SWP5也參與維持孢壁的穩(wěn)定［48］。在所鑒定的孢壁蛋白中，SWP25、SWP26、SWP30為孢子內(nèi)壁蛋白［52］，SWP32和SWP5、SWP16為孢子外壁蛋白［53］，SWP7和SWP9在孢子的外壁和內(nèi)壁均有分布［54］，SWP5、SWP7、SWP9、SWP11、SWP26、SWP15、SWP16都在孢子粘附與感染過(guò)程中起到一定作用［55］。

3.3 絲氨酸蛋白酶抑制因子（serine protease inhibitor，Serpin）的研究

絲氨酸蛋白酶抑制因子（Serpin）是一類數(shù)目最多、分布最廣、結(jié)構(gòu)相似的蛋白酶抑制物，在人類、植物、動(dòng)物、真菌、細(xì)菌、古生物和某些病毒中均存在。潘國(guó)慶課題組從家蠶微孢子蟲(chóng)基因組中鑒定出19個(gè)Serpin 基 因 ，并 對(duì) NbSPN6、NbSPN9、NbSPN13、NbSPN14、NbSPN19進(jìn)行了較為全面的研究。NbSPN6具有和孢壁幾丁質(zhì)層結(jié)合的活性，推測(cè)其可能具有抑制宿主蛋白酶的作用，或參與調(diào)控宿主的免疫進(jìn)程［56］。在對(duì)NbSPN19和NbSPN14互作靶蛋白的鑒定實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)到4個(gè)可能與家蠶微孢子蟲(chóng)Serpin蛋白有互作關(guān)系的家蠶蛋白質(zhì)，其中3個(gè)主要功能是參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白（SH3-domain結(jié)合蛋白、毒力相關(guān)三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶）在NbSPN19、NbSPN14的互作條帶中都出現(xiàn)，暗示NbSPNs可能參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)程［57］。家蠶微孢子蟲(chóng)NbSPN106氨基酸序列與其他物種Serpin的相似性較低，但仍具有典型的Serpin蛋白保守位點(diǎn)，并且NbSPN106可能參與調(diào)節(jié)宿主的免疫通路［58］。Nb感染家蠶后的基因芯片數(shù)據(jù)表明，Nb的Serpin可能通過(guò)抑制宿主家蠶血液黑化通路參與微孢子蟲(chóng)的侵染過(guò) 程［33，59］。家蠶微孢子蟲(chóng)NbSPN2、NbSPN3、NbSPN6、NbSPN10、NbSPN14和NbSPN19為分泌型serpin，可能被分泌到孢外參與孢子對(duì)宿主生理代謝及免疫系統(tǒng)的調(diào)控［60］。

3.4 類蓖麻毒素B鏈凝集素（Ricin-B-lectin，RBL）的研究

凝集素是一類能與細(xì)胞表面特殊糖蛋白或糖脂中寡糖結(jié)構(gòu)相結(jié)合的蛋白［61］，廣泛存在于動(dòng)植物、微生物等生物體中，具有細(xì)胞識(shí)別、有絲分裂、病毒毒力決定子等功能［62］，在生命活動(dòng)中起到重要作用。RBL是凝集素蛋白的一條分支，有研究指出，RBL蛋白具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［63］和增強(qiáng)免疫反應(yīng)的作用［64-65］。賈立麗［66］通過(guò)檢索家蠶微孢子蟲(chóng)全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋信息，得到19條RBL候選基因，序列分析發(fā)現(xiàn)家蠶微孢子蟲(chóng)ricin B-lecin基因以串聯(lián)重復(fù)的形式排列在染色體上，而且發(fā)生串聯(lián)重復(fù)RBL拷貝間氨基酸序列的差異較大，不僅暗示了RBL可能對(duì)微孢子蟲(chóng)的侵染增殖具有非常重要的作用，也表明這些RBL可能具有不同的功能［67］。齊曉冉［68］鑒定了NbRBL3基因，通過(guò)免疫印跡分析證明NbRBL3在侵染宿主的過(guò)程中被分泌孢外發(fā)揮功能，并且NbRBL3重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的高量表達(dá)能夠?qū)е录倚QBmE細(xì)胞的凝集，但這種凝集的生物學(xué)功能尚未明確。LIU等研究認(rèn)為推測(cè)NbRBL蛋白具有與糖類物質(zhì)結(jié)合的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，在孢子的侵染過(guò)程中，孢子萌發(fā)時(shí)釋放NbRBL，隨后NbRBL蛋白通過(guò)促進(jìn)孢子與BmN細(xì)胞粘附的方式幫助孢子的侵染行為［69］。

3.5 家蠶微孢子蟲(chóng)類枯草桿菌蛋白酶（subtilisinlike protease，SLP）的研究

家蠶微孢子蟲(chóng)類枯草桿菌蛋白酶超家族是第二大的絲氨酸蛋白質(zhì)家族，在原核生物、真核生物、以及病毒中廣泛存在。家蠶微孢子蟲(chóng)有4個(gè)類枯草芽孢桿菌基因，Nbslp1、Nbslp2-1，slp2-2［70］和Nbslp2［71］。黨曉群［71］認(rèn)為NbSLP1在孢子的發(fā)芽過(guò)程發(fā)揮重要作用，并且通過(guò)對(duì)NbSLP1互作蛋白的分析實(shí)驗(yàn)，推測(cè)NbSLP1可能還具有水解ATP產(chǎn)生能量和抑制家蠶免疫通路的功能。NbSLP2可能在家蠶微孢子蟲(chóng)感染家蠶早期發(fā)揮重要作用，并且可能在侵染過(guò)程中，與NbSLP1共同參與極絲彈出過(guò)程［71］。馬強(qiáng)等［72］在感染家蠶微孢子蟲(chóng)72 h后檢測(cè)到Nbslp2的轉(zhuǎn)錄活性，推測(cè)其可能在Nb感染家蠶早期發(fā)揮作用。

4 研究展望

家蠶微粒子病是具有毀滅性的疫病，是感染家蠶最主要的傳染性疾病之一，而家蠶微孢子蟲(chóng)是家蠶微粒子病的病原。因家蠶微孢子蟲(chóng)對(duì)蠶業(yè)生產(chǎn)造成的重大損失，所以一直以來(lái)都是研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。分子生物學(xué)技術(shù)憑借其特異、靈敏等優(yōu)勢(shì)，成為家蠶微孢子蟲(chóng)檢測(cè)技術(shù)研究的重點(diǎn)。家蠶微孢子蟲(chóng)在序列分析方面的研究，為家蠶微孢子蟲(chóng)的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)提供了序列基礎(chǔ)，提高了家蠶微孢子蟲(chóng)孢子分子生物學(xué)檢測(cè)的特異性。但是核酸分子雜交檢測(cè)技術(shù)和PCR檢測(cè)技術(shù)，存在操作難度大、耗時(shí)、對(duì)儀器的要求高等限制性，未能適應(yīng)與滿足大生產(chǎn)需求，從而限制了這兩種檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展。LAMP技術(shù)操作簡(jiǎn)單、實(shí)用性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，促使研究者開(kāi)發(fā)出了可有效檢測(cè)家蠶微孢子蟲(chóng)的LAMP試劑盒，有望開(kāi)發(fā)此技術(shù)用于生產(chǎn)上的大量檢測(cè)，促進(jìn)家蠶微孢子蟲(chóng)分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)上升到一個(gè)新的臺(tái)階。

家蠶微孢子蟲(chóng)全基因組測(cè)序完成后，研究者利用相關(guān)數(shù)據(jù)對(duì)家蠶微孢子蟲(chóng)開(kāi)展大量的侵染相關(guān)分子基礎(chǔ)研究，鑒定相關(guān)蛋白的功能，并取得了一定的研究成果。然而，由于微孢子蟲(chóng)突變株構(gòu)建所依賴的微孢子蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)目前還未取得全面突破，相關(guān)基因在微孢子蟲(chóng)侵染過(guò)程中所行使的功能還需深入的研究［67］，家蠶微孢子蟲(chóng)侵染和垂直傳播機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。

盡管家蠶微孢子蟲(chóng)在分子水平上的研究取得了很大的進(jìn)展，但推進(jìn)和完善LAMP診斷技術(shù)，加快分子診斷技術(shù)用于蠶種生產(chǎn)上檢測(cè)的進(jìn)程、發(fā)掘新的家蠶微孢子蟲(chóng)功能基因、加深對(duì)家蠶微孢子蟲(chóng)功能基因組學(xué)的研究并闡明家蠶微孢子蟲(chóng)侵染和垂直傳播機(jī)制，仍是今后研究的方向和熱點(diǎn)。更進(jìn)一步，家蠶微孢子蟲(chóng)作為鱗翅目昆蟲(chóng)的病原之一，積極擴(kuò)展微孢子蟲(chóng)在鱗翅目害蟲(chóng)的生物防治領(lǐng)域的應(yīng)用也必將越來(lái)越受到關(guān)注［67］。