非肌型絲切蛋白基因表達水平與慢性粒細胞白血病患者預(yù)后的關(guān)系分析

王 靜，袁玉軍

(公安縣人民醫(yī)院檢驗科，湖北荊州 434300)

慢性粒細胞白血病(CML)系發(fā)生于造血干細胞的惡性克隆性疾病，BCR-ABL融合基因為其發(fā)病的關(guān)鍵啟動基因，其編碼P210蛋白活化可激活酪氨酸激酶活性，影響下游信號通路調(diào)控，干擾纖維狀肌動蛋白(F-actin)功能，降低細胞對基質(zhì)反應(yīng)性，影響細胞凋亡及黏附過程[1]。在大部分非肌細胞內(nèi)，F(xiàn)-actin均為動態(tài)結(jié)構(gòu)，其處于持續(xù)解聚過程以維持細胞形態(tài)，非肌型絲切蛋白(CFL1)則為肌動蛋白解聚因子的重要成員，系存在于真核生物體內(nèi)的一類肌動蛋白結(jié)合蛋白，其可通過與肌動蛋白發(fā)生解聚促進肌動蛋白纖維能循環(huán)應(yīng)用，確保肌動蛋白纖維快速聚合、解聚，影響細胞及其外基質(zhì)黏附，促進細胞運動、遷移、分裂及凋亡[2]。絲切蛋白其活性受到磷酸肌醇、肌球蛋白、去磷酸化等多因素影響，對細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、肌動蛋白骨架重組均存在一定程度的影響，可促進惡性腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移[3]。但目前CFL1在CML發(fā)病中的作用及對患者預(yù)后的影響，筆者查閱文獻發(fā)現(xiàn)尚未見報道?；诖?，為探討CFL1與CML預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)對本院收治的70例初發(fā)CML患者的臨床資料進行回顧性分析，報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 采用回顧性研究，收集2011年2月至2013年4月本院收治的70例初發(fā)CML患者的臨床資料作為CML組。納入標(biāo)準：均符合血液病診斷及療效標(biāo)準中CML相關(guān)診斷標(biāo)準[4]，且為初發(fā)患者，處于疾病緩解期；入院后均接受伊馬替尼治療；病例資料完善，有明確初診、治療后骨髓標(biāo)本，有明確CFL1監(jiān)測數(shù)據(jù)；臨床及隨訪資料完整。排除標(biāo)準：合并嚴重心、肝、腎、肺器質(zhì)性功能障礙者；合并嚴重精神疾病者；合并其他惡性腫瘤者；其他類型白血病者；臨床及隨訪資料不完整者。選擇同期來本院體檢的40例健康體檢者作為對照組。對照組均體檢健康者，入院后均留取外周血樣本，均無血液病家族史。CML組與對照組性別、年齡、體質(zhì)量等基線資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 CML患者與健康者一般資料比較

1.2材料、主要試劑與儀器 標(biāo)本：CML患者及健康者標(biāo)本均來源于醫(yī)院血液科及體檢中心。試劑：Trizol抽提試劑、逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA合成酶、緩沖液(美國天根公司)，淋巴細胞分離液(上海試劑二廠)，CFL1及內(nèi)參GAPDH引物設(shè)計及合成(上海生工生物工程公司)，SYBR green(大連Takara公司)。儀器：冰凍高速離心機(德國Heraeus公司)，臺式高速離心機(德國Eppendorf公司)，微量DNA定量儀(美國Thermo公司)，制冰機(美國Sigma公司)，熒光分析儀(美國Bio-Rad公司)，DNA擴增儀(美國PE公司)，紫外分光光度計(北京普析通用儀器公司)。

1.3方法 所有CML患者均接受伊馬替尼(瑞士 Novartis Pharma Schweiz AG生產(chǎn)，批號H20100263)口服治療，400 mg/d，治療期間均監(jiān)測細胞學(xué)、血液學(xué)等指標(biāo)的改善，并調(diào)整治療劑量。治療前CML患者均收集骨髓4 mL，淋巴細胞液分離骨髓單個核細胞，健康者入院后收集外周血4 mL，均經(jīng)淋巴細胞分離液分離單個核細胞，-80 ℃低溫保存，加入含20%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，制備染色體，檢查染色體核型。提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進行實時定量PCR反應(yīng)，CFL1引物序列，上游：GCG TAA GTC TTC AAC GCC AGA G，下游：TCG ACA GTC TGG CCC ACA TC；內(nèi)參GAPDH引物序列，上游：ATG GGG AAG GTG AAG GTC G；下游：GGG TCA TTG ATG GCA ACA ATA TC。PCR反應(yīng)體系共25 μL，包括2×SYBR@Premix EX TaqTMⅡ12.5 μL+內(nèi)參基因+上下游引物0.4 μmol+cDNA模板1 μL+焦碳酸二乙酯(DEPC)純化水。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)，觀察熒光信號及溶解曲線，PCR產(chǎn)物加入5∶16×緩沖液，加樣2%瓊脂糖凝膠，電泳，紫外分光光度儀下觀察條帶位置，進行PCR擴增，反應(yīng)結(jié)束后，任意選擇4～5個陽性模板進行標(biāo)準梯度點分析，決定系數(shù)(r2)>0.97，提示線性關(guān)系良好，確定定量標(biāo)準曲線，并獲取熒光定量反應(yīng)絕對值為目的基因表達水平。收集所有患者人口學(xué)資料、外周血白細胞計數(shù)、嗜酸性粒細胞計數(shù)、骨髓象、Ph染色及隨訪情況。

1.4隨訪情況 所有患者均隨訪至2017年4月，研究終點：總生存(OS)表示自確診CML至死亡；無事件生存(EFS)表示自確診CML后出現(xiàn)以下事件(喪失完全遺傳學(xué)反應(yīng)、停藥、疾病進展、任何原因所致死亡)為止；無進展生存(PFS)表示自確診CML至疾病加速、急變或其他原因所引起死亡為止。同一事件多次發(fā)生則以首次發(fā)生事件為準。

2 結(jié) 果

2.1CML患者與對照組CFL1表達比較 CML組CFL1表達水平明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 CML患者與對照組CFL1表達比較

2.2疾病轉(zhuǎn)歸情況 70例CML患者隨訪12～48個月，平均(37.5±1.3)個月，隨訪結(jié)束存活44例(62.86%)，死亡26例(37.14%)。死亡組的年齡≥50歲、白細胞計數(shù)≥50×109/L、血小板計數(shù)<100×109/L或>700×109/L、外周血原始細胞百分比≥3%、Ph染色體陰性、骨髓原始細胞百分比≥5%所占比例均高于存活組(P<0.05)，其CFL1表達水平低于存活組(P<0.05)，見表3。

表3 不同預(yù)后CML患者臨床資料比較

續(xù)表3 不同預(yù)后CML患者臨床資料比較

2.3CML患者預(yù)后Cox模型回歸分析 Cox回歸分析顯示,年齡≥50歲、白細胞計數(shù)≥50×109/L、血小板計數(shù)<100×109/L或>700×109/L、Ph染色體陰性、骨髓原始細胞百分比≥5%、低CFL1表達水平均不利于CML患者遠期生存，均為影響其預(yù)后的相關(guān)因素，其中Ph染色體陰性危險度最高，其次為白細胞計數(shù)≥50×109/L、低CFL1表達水平，見表4。

表4 CML患者預(yù)后Cox模型回歸分析

3 討 論

CML屬多能造血干細胞克隆增生性疾病，其臨床病理過程最初為慢性期，繼之轉(zhuǎn)變?yōu)榧铀倨?，最終急變，導(dǎo)致患者死亡[5]。CML患者常伴Ph染色體異常及BCR-ABL融合基因改變，兩者在其發(fā)病及進展過程中均有其重要作用，其中BCR-ABL其DH區(qū)域、SH3區(qū)域均可影響RhoA/LIM/cofilin等通路調(diào)節(jié)，影響肌動蛋白骨架重塑，對細胞黏附、遷移、增殖分化產(chǎn)生影響，促進CML發(fā)病及進展[6]。既往常通過檢測BCR-ABL轉(zhuǎn)錄水平來評定CML治療反應(yīng)性及預(yù)后。但研究發(fā)現(xiàn)，前期治療方案、年齡、白細胞計數(shù)等因素均可能對其預(yù)測效果產(chǎn)生影響[7-8]。BARRETT等[9]表示，白血病祖細胞與骨髓基質(zhì)纖維黏連蛋白黏附改變同樣是引起CML發(fā)病的重要機制。細胞周期調(diào)節(jié)紊亂、細胞黏附異常為CML另一特點，其黏附、運轉(zhuǎn)及遷移過程涉及肌動蛋白骨架應(yīng)力形成、整合素黏著斑信號通路、細胞外基質(zhì)信號調(diào)控等過程，而F-actin在上述信號通路調(diào)節(jié)中有重要作用，其可通過與整合素細胞內(nèi)部分相連共同參與細胞與細胞外基質(zhì)信號傳導(dǎo)過程。CFL1則為F-actin關(guān)鍵調(diào)控蛋白，定位于11q13染色體，系低相對分子質(zhì)量肌動蛋白解聚因子家族成員，可識別及剪切與單體肌動蛋白，調(diào)節(jié)其聚合、解聚，并可通過影響F-actin表達，調(diào)節(jié)黏著斑信號，影響細胞黏附、形態(tài)變化及維持。且動物實驗發(fā)現(xiàn)，CFL1可調(diào)控肌動蛋白表達，影響轉(zhuǎn)錄因子定位，誘導(dǎo)細胞凋亡及周期調(diào)控[10]。早期已被證實CFL1持續(xù)激活可增加結(jié)腸癌、前列腺癌細胞增殖、侵襲能力，系腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)節(jié)調(diào)控因子，可影響細胞運動，調(diào)動肌動蛋白骨架重組，誘導(dǎo)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移[11-12]。何雯等[13]研究發(fā)現(xiàn)，CFL1為轉(zhuǎn)化生長因子信號通路的下游分子，其可通過強化轉(zhuǎn)化生長因子作用增加腫瘤細胞侵襲性，促進腫瘤進展，導(dǎo)致其復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。

本研究發(fā)現(xiàn)，與健康者比較，CML患者CFL1表達水平明顯降低，CML患者其外周血單個核細胞成分主要為相對成熟中晚幼粒細胞，而健康者其外周血單個核細胞均為成熟細胞[14]，考慮到CML患者CFL1水平降低可能與其參與血液系統(tǒng)粒細胞分化有關(guān)。而進行預(yù)后相關(guān)因素分析發(fā)現(xiàn)，年齡、白細胞計數(shù)、血小板計數(shù)、Ph染色體、骨髓原始細胞百分比、CFL1表達水平均對CML患者生存預(yù)后產(chǎn)生影響，一般Ph染色體畸變常出現(xiàn)CML加速期或急變期，提示預(yù)后差，主要與染色體異?？赡芨淖僀ML患者白血病細胞生物學(xué)特性有關(guān)。且高齡患者其機體免疫抵抗力低下，各機能處于逐漸退化過程，預(yù)后通常較差。而骨髓原始細胞百分比增加則提示細胞形態(tài)發(fā)生異常改變、粒細胞系統(tǒng)核漿發(fā)育不平衡，增加CML病變風(fēng)險。白細胞及血小板計數(shù)則為CML患者疾病狀態(tài)的重要體現(xiàn)，持續(xù)血小板減少，白細胞計數(shù)上調(diào)，導(dǎo)致其聚集于骨髓內(nèi)，進一步影響CML患者骨髓正常造血功能，增加全身血液擴散程度，促進疾病進展，影響患者預(yù)后[15-16]。此外，低CFL1表達是影響患者預(yù)后的重要因素，其表達水平的變化與CML患者細胞分化程度及疾病狀態(tài)均有其關(guān)聯(lián)，表達上調(diào)，可影響F-actin聚集及解聚，調(diào)節(jié)整合素黏著斑信號通路，改變細胞間黏附反應(yīng)。而其表達下調(diào)，上述各因子作用減弱，F(xiàn)-actin解聚功能遭到抑制，暴露肌動蛋白家族激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及細胞骨架蛋白質(zhì)，導(dǎo)致骨髓間質(zhì)黏附作用增強，促進細胞活化，增加細胞移行速度，強化細胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力，促進膠質(zhì)母細胞腫瘤運動，促進疾病進展，影響其預(yù)后。

4 結(jié) 論

CML患者較健康者CFL1表達水平較低，且年齡、白細胞計數(shù)、血小板計數(shù)、Ph染色體、骨髓原始細胞百分比、CFL1表達均為影響CML患者預(yù)后的相關(guān)危險因素。