咯利普蘭對大鼠脊髓缺血再灌注損傷后神經(jīng)運動功能及氧自由基的影響▲

李鋒濤 程 斌 賀西京

(西安交通大學第二附屬醫(yī)院1 骨二科，2 骨三科，陜西省西安市 710004，電子郵箱：lft369@163.com)

脊髓缺血再灌注損傷(spinal cord ischemia-reperfusion injury，SCII)常見于脊髓長期受壓且有脊髓損傷癥狀的患者，多為在行手術減壓后出現(xiàn)原損傷平面以下更加嚴重的部分或全脊髓損傷。其損傷機制主要包括興奮性氨基酸毒性作用、血腦屏障通透性增加、氧自由基生成和脂質(zhì)過氧化反應引起的組織損傷、炎性浸潤、微血管內(nèi)血栓形成[1]、細胞凋亡等。研究表明，磷酸二酯酶4特異性抑制劑咯利普蘭可顯著增加腎臟、肺部及胃腸道缺血再灌注損傷組織內(nèi)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及過氧化氫酶含量、減少一氧化氮及丙二醛(malondialdehyde，MDA)的生成，減輕組織炎性反應及改善組織病理變化[2]。但咯利普蘭是否能夠抑制SCII后氧自由基的生成而保護神經(jīng)功能，目前鮮見研究報道。本實驗通過研究咯利普蘭對大鼠SCII后神經(jīng)運動功能及氧自由基的影響，探討其對SCII的改善作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑 SOD試劑盒及MDA試劑盒購自南京建成生物研究所(批號：20151202、20160117)，咯利普蘭購自美國Sigma公司，硫酸魚精蛋白購自北京悅康凱悅制藥有限公司(批號：H11020246)；CH21-3型照相顯微鏡購自日本Olympus公司，Keypoin型四導聯(lián)誘發(fā)電位肌電圖儀購自丹麥Dantec公司，752S型紫外可見分光光度計購自上海棱光技術有限公司。多功能生理檢測儀購自日本ColinBD509公司。

1.2 實驗動物及分組 清潔級成年健康雌性SD大鼠60只，(3.0±0.5)月齡，體重(223±18)g，購買于西安交通大學醫(yī)學院動物實驗中心(合格證號：陜醫(yī)動字D08005)。按隨機數(shù)字表法將大鼠分為假手術組(Sham組)、SCII組和咯利普蘭組，每組20只。

1.3 SCII建模方法 Sham組僅于大鼠胸主動脈置管，不阻斷血流，不采取任何干預措施；SCII組和咯利普蘭組同樣于胸主動脈置管，通過擴張球囊阻斷SD大鼠胸主動脈30 min，然后恢復血流，建立大鼠SCII模型。建模方法如下：使用3%苯巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉。保持大鼠體溫在37.1℃～37.5℃。暴露左側(cè)頸總動脈及尾動脈，與監(jiān)護儀連接后置入PE50導管，監(jiān)測近、遠端血壓(近端導管連接放血裝置)。暴露左側(cè)股動脈，置入2F Fogarty導管，置入深度為10.8～11.4 cm，使得球囊位于左鎖骨下動脈分支處。充盈球囊，阻斷胸主動脈，同時立即通過放血裝置開始放血，使近端平均動脈壓維持在45 mmHg左右。胸主動脈阻斷30 min后，放松球囊，恢復胸主動脈血流，將所放出的血液勻速回輸。術后皮下注射0.4 ml硫酸魚精蛋白(4 mg)。將大鼠放于25℃～30℃的保溫箱內(nèi)，蘇醒后放回飼養(yǎng)籠中。室溫控制在25℃左右，自由進食及飲水。人工膀胱按摩2次/d，清洗會陰部及腹部1次/d，經(jīng)常更換籠內(nèi)鋸末，保持籠內(nèi)干燥、清潔。術后腹腔注射青霉素20萬單位/次，2次/d。術后SCII組和咯利普蘭組各有3只大鼠因泌尿系感染死亡，均按相同條件給予補充。

1.4 給藥方法 將咯利普蘭溶于二甲基亞砜中，在建立SCII模型前30 min，給予咯利普蘭組大鼠腹腔注射咯利普蘭，10 mg/(kg·d)，分4次注射，此后每天按此劑量注射直至實驗結(jié)束，以維持血藥濃度。Sham組及SCII組注射相應體積的二甲基亞砜。

1.5 觀察指標 分別于SCII模型建立后6 h、12 h、24 h及48 h，每組各取5只大鼠進行神經(jīng)運動功能評分并檢測體感誘發(fā)電位，然后處死大鼠取脊髓組織檢測SOD及MDA。

1.5.1 大鼠后肢神經(jīng)運動功能評分：采用(Basso，Beattie and Bresnahan，BBB)[3]神經(jīng)運動功能評分方法對各組大鼠后肢神經(jīng)運動功能進行評分。參加評分者為熟悉評分標準而未參加本組實驗人員，共兩人進行評分，結(jié)果取其平均值。

1.5.2 體感誘發(fā)電位檢測：將插入大鼠后肢脛后神經(jīng)附近進行電脈沖刺激，雙根銀針電極間距1.0 cm，銀針直徑0.5 mm。刺激參數(shù)：強度4 mA，頻率3 Hz，波寬1.0 ms單方波，信號疊加500次。在顱骨頂部正中央矢狀線旁開1.5 mm處緊貼顱骨放置記錄電極，與另一側(cè)相同位置緊貼顱骨放置參考電極，保持電極位置良好。記錄電極安放于顱骨表面相對于后肢皮層感覺區(qū)，參考電極安放于皮下，靈敏度為5μV，濾波范圍10～3 000 Hz。

1.5.3 SOD及MDA的檢測方法：取大鼠腰尾部脊髓組織100 g，冰上操作，勻漿后按照試劑盒說明分別應用黃嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸法檢測各組大鼠脊髓組織中SOD、MDA含量。

1.6 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用(x±s)表示，組間比較采用方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠BBB評分比較 在各個時間點，Sham組、咯利普蘭組、SCII組BBB評分依次降低(均P<0.05)，見表1。

表1 建模后不同時點3組大鼠后肢BBB評分比較(x±s，分)

注：各個時間點，與Sham組比較，#P<0.05，與SCII組比較，▲P<0.05。

2.2 3組大鼠體感誘發(fā)電位檢測結(jié)果 在各個時間點，Sham組、咯利普蘭組、SCII組大鼠后肢體感誘發(fā)電位潛伏期依次延長，波幅依次減小(均P<0.05)，見表2～3。

表2 建模后不同時點3組大鼠后肢體感誘發(fā)電位潛伏期比較(x±s，ms)

注：各個時間點，與Sham組比較，#P<0.05，與SCII組比較，▲P<0.05。

表3 建模后不同時點3組大鼠后肢體感誘發(fā)電位波幅比較(x±s，μV)

注：各個時間點，與Sham組比較，#P<0.05，與SCII組比較，▲P<0.05。

2.3 3組大鼠脊髓組織SOD活力及MDA含量比較 在各個時間點，Sham組、咯利普蘭組、SCII組SOD活力依次降低(P<0.05)，而MDA含量依次升高(均P<0.05)，見表4～5。

表4 建模后不同時點3組大鼠脊髓組織SOD活力比較(x±s，U/mg prot)

注：各個時間點，與Sham組比較，#P<0.05，與SCII組比較，▲P<0.05。

表5 建模后不同時點3組大鼠脊髓組織MDA含量比較(x±s，U/mg prot)

注：各個時間點，與Sham組比較，#P<0.05，與SCII組比較，▲P<0.05。

3 討 論

生理條件下，脊髓組織正常代謝過程中會生成少量的反應性氧類物質(zhì)(reactive oxygen species，ROS)，可以被內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)(包括SOD、谷胱甘肽過氧化酶、過氧化氫酶)以及抗氧化維生素(如維生素E及抗壞血酸)所清除。在SCII過程中，有大量ROS生成，主要包括一氧化氮及超氧陰離子等，當ROS的生成量超過了SOD、過氧化氫酶等清除能力時，可導致細胞膜中磷脂的不飽和脂肪酸過氧化，從而引起細胞膜及細胞器的損害，并通過壞死及凋亡模式引起細胞死亡[4-5]。MDA是生物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應的終產(chǎn)物，可在體外影響線粒體呼吸鏈復合物及線粒體內(nèi)關鍵酶活性，且具有潛在的致癌性，其含量可反映體內(nèi)過氧化的程度。SOD分布于各種生物組織細胞內(nèi)，是機體內(nèi)清除自由基的最重要物質(zhì)，其通過歧化反應將超氧陰離子自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫，再由過氧化氫酶及過氧化物酶將之分解。SOD的活力可反映內(nèi)源性氧自由基清除能力的水平(在清除自由基的同時，SOD本身被消耗)，因此MDA的含量和SOD活力常常被用于檢測體內(nèi)氧化應激損害程度。研究發(fā)現(xiàn)，SOD活性、脂質(zhì)過氧化與腦缺血再灌注損傷有關[6-8]。

咯利普蘭是磷酸二酯酶4特異性抑制劑，可通過抑制細胞內(nèi)磷酸二酯酶4，減少腺苷-3′，5′-環(huán)磷酸的水解，發(fā)揮多種生物學功能：(1)可在mRNA和蛋白水平下調(diào)T細胞和單核細胞分泌的前炎性細胞因子白細胞介素-13、白細胞介素-5、腫瘤壞死因子-α和干擾素-γ的表達，抑制炎性細胞的遷移活化，減輕炎癥反應；(2)降低血腦屏障的滲透性，減少有害因子穿過血腦屏障引起的組織損傷；(3)降低誘導型一氧化氮合酶mRNA的表達和減少一氧化氮等超氧化合物的生成，減少氧自由基的生成，從而減輕其對組織的破壞；(4)抑制促凋亡蛋白活化、激活B淋巴細胞瘤-2蛋白，減少細胞的凋亡；(5)促進新生軸突克服抑制性分子如神經(jīng)軸突生長抑制因子、髓鞘相關糖蛋白和少突膠質(zhì)細胞髓鞘糖蛋白的抑制而生長；(6)阻止Ca2+內(nèi)流，減少Ca2+介導的細胞壞死通路。研究表明，應用咯利普蘭治療大鼠急性腎盂腎炎，可顯著增加腎臟組織內(nèi)SOD及過氧化氫酶含量，同時減少NO及MDA的生成，從而減輕組織炎性反應及改善組織病理變化，這種抗炎抗氧化減少組織損傷的作用同樣存在于腎臟、肺臟及胃腸道缺血再灌注損傷時[9-11]。Sánchez等[12]應用咯利普蘭治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠，發(fā)現(xiàn)其可明顯抑制此類大鼠脊髓和淋巴結(jié)內(nèi)金屬蛋白酶-9基因的轉(zhuǎn)錄，減輕金屬蛋白酶-9引起的組織破壞，還可降低其淋巴細胞核轉(zhuǎn)錄因子-κB的表達水平，抑制炎性細胞因子的合成。Martinez等[13]報告咯利普蘭明顯降低自身免疫性腦脊髓炎大鼠體內(nèi)一氧化氮的生成，降低顱內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管內(nèi)皮通透性，阻止炎性細胞的浸潤，減輕組織水腫，起到保護神經(jīng)組織的作用。而咯利普蘭是否能夠減少SCII后脊髓組織內(nèi)ROS的生成，減輕脊髓損傷，改善脊髓功能鮮見報道。

本實驗結(jié)果顯示，在SCII后6～48h，與SCII組相比，咯利普蘭組大鼠后肢BBB評分增高(P<0.05)，神經(jīng)誘發(fā)電位潛伏期縮短、波幅增加(P<0.05)，提示咯利普蘭能夠改善SCII后大鼠后肢神經(jīng)運動功能和脊髓組織的神經(jīng)電生理功能。在SCII后，與Sham組比較，SCII組與咯利普蘭組脊髓組織的SOD活性均降低，MDA含量均升高，且SCII組SOD活力低于咯利普蘭組(P<0.05)，MDA含量高于咯利普蘭組(P<0.05)，這表明咯利普蘭可提高SCII后大鼠脊髓組織中SOD活性，從而對抗自由基的脂質(zhì)過氧化作用，減少MDA生成，從而起到保護神經(jīng)功能的作用。但咯利普蘭提高SOD活性，減少MDA生成的具體機制還需要進一步研究。

綜上所述，咯利普蘭可減少大鼠SCII后氧自由基的生成，從而保護神經(jīng)運動功能。