濕加松無性系表型遺傳多樣性研究

郭文麗 李義良 趙奮成 鐵 軍 廖仿炎鐘歲英 林昌明 葉威方

(1.山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，臨汾 041004； 2.廣東省森林培育與保護利用重點實驗室，廣州 510520； 3.廣東省林業(yè)科學(xué)研究院，廣州 510520； 4.長治學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系，長治 046011； 5.廣東省臺山紅嶺種子園，臺山 529200)

濕加松(Pinuselliottii×P.caribaeaMorelet var.hondurensis)屬松科(Pinaceae)松屬(Pinus)，為裸子植物。濕加松是經(jīng)控制授粉后得到的雜交子代，其母本為濕地松(PinuselliottiiEngelmann)，父本為洪都拉斯加勒比松變種(PinuscaribaeaMorelet var.hondurensis)。濕加松不僅具有母本干型通直圓滿、分枝情況良好、抗風(fēng)抗病蟲害能力強、耐水漬、耐短期低溫等優(yōu)勢，還具有父本早期生長迅速、生長量大等優(yōu)勢[1]。從上世紀末開始，我國木材市場就出現(xiàn)了緊缺產(chǎn)脂力高和出材量大的松樹良種的現(xiàn)象，濕加松依靠獨有的優(yōu)勢已成為我國華南地區(qū)兼具有建材產(chǎn)脂和大徑材林培育潛力的重要樹種[2]。

目前，我國濕加松無性系有兩個來源：其一為引種自澳大利亞昆士蘭州的濕加松，其二是上世紀九十年代以來廣東省林業(yè)科學(xué)研究院與臺山紅嶺種子園等單位聯(lián)合培育的濕加松[3]。經(jīng)過二十多年的大量研究，同等立地條件下我國廣東省培育的部分濕加松優(yōu)良家系在材積生長方面上優(yōu)于澳大利亞F1代家系。

前人在研究不同植物表型性狀普遍采用了主成分分析和聚類分析的方法，例如豌豆[4]、茶樹[5～6]、谷子[7]、陸地棉[8]、甜高粱[9～10]、杜鵑紅山茶[11]等作物已經(jīng)進行了相關(guān)研究。本研究擬選取廣東省臺山市紅嶺種子園35個濕加松無性系作為試驗材料，測量其8個表型性狀，采用主成分分析和聚類分析相結(jié)合，綜合分析濕加松無性系表型遺傳多樣性，為更高效的選擇親本提供理論依據(jù)，進一步為良種選育奠定基礎(chǔ)。

1 試驗材料及方法

1.1 試驗材料、方法

濕加松無性系均來自廣東省臺山市紅嶺種子園，試驗于2017年8月25日～2017年9月14日在紅嶺種子園進行。該種子園營建于2000～2003年，總面積18.5 hm2，分為3個大區(qū)39個小區(qū)，建園無性系共51個，每個小區(qū)16個無性系，無性系配置采用了三位順序錯位排列法，株行距為5 m×5 m。建園無性系均選自早期營建的濕加松遺傳測定林，從測定林中選擇生長量大、干形通直、分枝良好、結(jié)實正常、樹體健康的優(yōu)良單株，采集其穗條帶回苗圃中嫁接、繁殖，由此組成建園材料。該地屬南亞熱帶海洋性氣候，年均溫21.8℃，年降水量1 940 mm；平均海拔30 m，土壤為花崗巖發(fā)育的酸性磚紅壤，pH值5.0～5.5，土層深厚。自然條件下適合濕加松生長發(fā)育、開花結(jié)實。本試驗選定35個無性系，包括10個來自澳洲全同胞家系(EHA)，2個來自澳洲半同胞家系F2(EHAF2)，23個來自臺山自配全同胞家系，每個無性系從種子園隨機選取3～6分株不等，共160分株。試驗材料詳細信息見表1。

1.2 表型性狀調(diào)查

設(shè)計對35個濕加松無性系從生長性狀和形質(zhì)性狀兩個方面調(diào)查，生長性狀包括樹高、胸徑、材積；形質(zhì)性狀包括冠幅、分枝角、側(cè)枝直徑、輪枝距、皮厚。

樹高：用測高儀(VertexⅣ超聲波樹木測高儀)測量選定濕加松的樹高(單位：m)。

胸徑：用胸徑尺測量選定濕加松的胸徑(1.3 m處)(單位：cm)。

材積：利用樹高、胸徑計算選定濕加松的材積(單位：m3，單株材積：V)的計算公式[12]如下：

V=(f×π×H×D2)/40 000

(1)

式中，f為形數(shù)，取f=0.5，π為圓周率，H為樹高，D為胸徑。

冠幅：先測量選定材料的東西、南北向冠幅，再計算平均值(單位：m)。

表135個濕加松無性系材料名稱表

Table135clonesofP.elliottii×P.caribaeaMoreletvar.hondurensismaterialnametable

選3個有代表性的側(cè)枝，距地面3～5 m，分別測量分枝角、側(cè)枝直徑、輪枝距。

分枝角：測量選定的3個側(cè)枝的分枝角(單位：°)。

側(cè)枝直徑：用胸徑尺測量選定的3個側(cè)枝直徑，再計算平均值(單位：cm)。

輪枝距：分別測量選定的3個側(cè)枝之間距離，再計算平均值(單位：cm)。

皮厚：位于樹高1.3 m處測量選定材料的樹皮厚度(單位：cm)。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

本研究采用R軟件[13]對35個濕加松無性系的表型數(shù)據(jù)進行分析，使用summary()函數(shù)計算各表型性狀的最小值、最大值、平均值，使用stat.desc()函數(shù)計算了標準誤、方差、變異系數(shù)，以及進行了多樣性指數(shù)、表型相關(guān)性分析、主成分和聚類分析。

遺傳多樣性指數(shù)采用Shannon-Weaver多樣性指數(shù)(H)，其計算公式為：

H=-∑PilnPi

(2)

式中：H為任一組中某一性狀的多樣性程度；P為某一性狀第i個級別的種質(zhì)份數(shù)占總種質(zhì)材料的百分比；ln表示自然對數(shù)。

其中表型性狀的相關(guān)性分析是間接選擇的重要參數(shù)，記為rtt。計算公式如下：

(3)

式中：Covt1,t2類是兩性狀的協(xié)方差；Vt1、Vt2是兩性狀的遺傳方差。

主成分分析采用降維把多維空間多個相關(guān)變量簡化為少量幾個相互獨立的綜合指標，可以更好地反映出各指標間的綜合情況[14]。本研究使用psych程序包對35個濕加松無性系進行了主成分分析。

聚類分析采用了系統(tǒng)聚類法(層次聚類法)，利用函數(shù)hclust()對35個濕加松無性系進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 35個濕加松無性系的表型性狀差異

對35個濕加松無性系的8個表型性狀進行了描述性統(tǒng)計分析，分析結(jié)果見表2。

表2可知，濕加松樹高變幅8.60～17.00 m，平均值為13.37 m；胸徑變幅12.70～36.50 cm，平均值為24.85 cm；材積變幅0.07～0.71 m3，平均值為0.34 m3；冠幅變幅3.00～10.40 m，平均值為5.45 m；分枝角變幅43.33～90.00°，平均值為75.92°；側(cè)枝直徑變幅2.33～7.74 cm，平均值為4.44 cm；輪枝距變幅25.00～90.00 cm，平均值為51.31 cm；皮厚變幅0.20～1.30 cm，平均值為0.67 cm。

8個表型性狀變異范圍為12.31%～39.28%，均值為22.82%，其中生長性狀介于12.31～29.28%，均值為22.90%，形質(zhì)性狀介于13.34～47.25%，均值為26.86%。其變異系數(shù)由大到小依次為：材積>皮厚>側(cè)枝直徑>輪枝距>冠幅>胸徑> 分枝角>樹高。依據(jù)張巖等[15]可將變異系數(shù)分為三級，小(<25%)、中(25～50%)、大(>50%)。本研究只有小、中兩級。其中，材積的變異系數(shù)最大，呈現(xiàn)了豐富的變異性；樹高和分枝角的變異系數(shù)均小于15%，說明其遺傳穩(wěn)定性較好。

表235個濕加松無性系8個表型性狀的描述性統(tǒng)計及遺傳多樣性

Table2Descriptivestatisticsandgeneticdiversityofeightphenotypictraitsin35clonesofP.elliottii×P.caribaeaMoreletvar.hondurensis

性狀Characteristic性狀Characteristic最小值Min最大值Max平均值±標準誤Mean±SE方差Variance變異系數(shù)CV(%)多樣性指數(shù)H生長性狀Growth traits樹高Tree height(m)8.6017.0013.37±0.132.7112.311.61胸徑Breast diameter(cm)12.7036.5024.85±0.3418.0517.101.67材積Volume(m3)0.070.710.34±0.010.0239.281.80平均值A(chǔ)verage value22.901.69形質(zhì)性狀Shape character冠幅Crown width(m)3.0010.405.45±0.101.4121.831.83分枝角Branching angle(°)43.3390.0075.92±0.81102.5913.341.50側(cè)枝直徑Lateral branch diameter(cm)2.337.474.44±0.091.1924.571.80輪枝距Wheel pitch(cm)25.0090.0051.31±1.01156.7424.401.78皮厚Skin thickness(cm)0.201.300.67±0.020.0429.761.75平均值A(chǔ)verage value22.781.73總均值Total mean22.821.72

2.2 35個濕加松無性系表型性狀的遺傳多樣性

對供試無性系的8個性狀進行了遺傳多樣性分析(表2)。從表2可知，8個性狀多樣性指數(shù)變化范圍在1.50～1.83，均值為1.72，生長性狀介于1.61～1.80，均值為1.69，生長性狀介于1.50～1.94，均值為1.77。其遺傳多樣性指數(shù)由高到低依次為：冠幅>材積>側(cè)枝直徑>輪枝距>皮厚>胸徑>樹高>分枝角，表明了表型性狀的遺傳多樣性均較豐富。

2.3 35個濕加松無性系表型性狀的相關(guān)性分析

對8對不同表型性狀進行相關(guān)性分析(表3)。從表3可知，各性狀之間存在著不同程度的相關(guān)性，且大部分呈顯著或極顯著相關(guān)。其中呈極顯著正相關(guān)的有11對，依次為材積與皮厚(0.98)、冠幅與側(cè)枝直徑(0.94)、樹高與皮厚(0.92)、樹高與材積(0.89)、材積與側(cè)枝直徑(0.82)、樹高與胸徑(0.81)、材積與冠幅(0.72)、胸徑與側(cè)枝直徑(0.71)、胸徑與冠幅(0.69)、樹高與輪枝距(0.62)、樹高與側(cè)枝直徑(0.46)；呈顯著正相關(guān)的有5對，依次為輪枝距與皮厚(0.72)、胸徑與輪枝距(0.63)、側(cè)枝直徑與皮厚(0.55)、材積與輪枝距(0.51)、樹高與冠幅(0.36)。表明供試材料材積較高且皮較厚、冠幅與側(cè)枝直徑較大、樹體高大以及輪枝距較大；皮厚與材積、樹高呈極顯著相關(guān)，與輪枝距、側(cè)枝直徑呈顯著正相關(guān)，因此對供試材料的育種選擇中應(yīng)以材積為主要指標，其次為樹高。

表3 8個表型性狀之間的相關(guān)性分析

注：***，**和*為分別表示在0.001、0.01和0.05水平上存在顯著相關(guān)。

Note:***，** and * indicate significant correlations at the levels of 0.001，0.01 and 0.05,respectively.

表4濕加松無性系各類群表型性狀的特征

Table4TheaverageandcoefficientvariationamountofphenotypictraitsindifferentgermplasmgroupsofP.elliottii×P.caribaeaMoreletvar.hondurensis

性狀Traits資源數(shù)Number樹高Tree height(m)胸徑Breast diameter(cm)材積Volume(m3)冠幅Crown width(m)分枝角Branching angle(°)側(cè)枝直徑Lateral branch diameter(cm)輪枝距Wheel pitch(cm)皮厚Skin thickness(cm)均值Mean變異系數(shù)CV(%)均值Mean變異系數(shù)CV(%)均值Mean變異系數(shù)CV(%)均值Mean變異系數(shù)CV(%)均值Mean變異系數(shù)CV(%)均值Mean變異系數(shù)CV(%)均值Mean變異系數(shù)CV(%)均值Mean變異系數(shù)CV(%)種質(zhì)類群Germplasms groupsⅠ213.080.0424.090.050.320.114.730.0957.710.044.150.3346.690.050.690.41Ⅱ314.521.4526.811.280.423.115.820.6669.24138.894.540.0165.45500.790.005Ⅲ113.830.0226.471.280.380.0015.472.658034.723.510.0023412.50.670.005Ⅳ1313.1224.0610.580.320.0055.540.1573.512.54.424.9146.0912.50.640.02Ⅴ1213.720.7226.23320.380.025.660.00179.27868.064.852.4255.866.130.70.005Ⅵ412.811.2823.4280.650.270.054.851.8179.71312.53.80.6855.4100.620.005

圖1 35個濕加松無性系的系統(tǒng)聚類圖Fig.1 Hierarchical Cluster Map of 35 Clones of P.elliottii×P.caribaea Morelet var. hondurensis

2.4 聚類分析

采用R軟件對35個濕加松無性系進行了系統(tǒng)聚類分析(圖1)。在歐氏距離為12時，可將35個無性系分為6大類群，每個類群的份數(shù)、表型性狀的平均值以及變異系數(shù)(表4)。

第Ⅰ類：有2個無性系，均來源于澳洲全同胞家系，共8分株，占供試材料總數(shù)的5%。主要表現(xiàn)為冠幅較小，可為培育窄冠型良種提供種質(zhì)。冠幅和分枝角(<60°)的均值在六大類群里均最小，變異系數(shù)均較小。

第Ⅱ類：有3個無性系，1個來源于臺山全同胞家系、1個來源于澳洲全同胞家系、1個來源于澳洲半同胞家系F2，共13分株，占總材料的8.125%。主要表現(xiàn)為樹體高大，樹冠寬，粗皮且材積大。樹高、胸徑、材積、冠幅、輪枝距和皮厚的均值在六大類群里均最大，且材積的變異系數(shù)最大。綜合分析可知，該類群長勢最優(yōu)，可為培育速生良種提供種質(zhì)材料，有較高的用材經(jīng)濟價值。

第Ⅲ類：只有1個無性系，來源于臺山全同胞家系，該無性系長勢良好，但分枝角的均值最大(80°)，側(cè)枝直徑與輪枝距的均值最小，變異系數(shù)都較低，僅3分株，占總材料的1.875%。

第Ⅳ類：共13個無性系，分別有3個來源于澳洲全同胞家系、10個均來源于臺山全同胞家系，共64分株，占總材料的40%。其整體長勢較差，且樹高和側(cè)枝直徑的變異系數(shù)均最大，需進一步培育從中選取優(yōu)良品種。

第Ⅴ類：包括了12個無性系，有1個來源于澳洲半同胞家系F2、2個來源于澳洲全同胞家系、9個來源于臺山全同胞家系，共55分株，占總材料的34.375%。其側(cè)枝直徑的均值最大，分枝角及輪枝距的變異系數(shù)最大，說明選擇范圍較寬，整體上的長勢優(yōu)于第Ⅳ類，適合后期大量種植。

第Ⅵ類：包括4個無性系，2個來源于澳洲全同胞家系、2個來源于臺山全同胞家系，共17分株占總材料的10.625%。其樹高、材積與皮厚的均值最小，胸徑的變異系數(shù)最大，說明該類群長勢最差，但皮薄，胸徑選擇范圍較寬，可為培育薄皮型良種提供種質(zhì)。

2.5 主成分分析

本研究針對8個性狀采用R軟件的程序包psych進行了主成分分析(表5)。結(jié)果表明，前3個主成分的特征值均大于1，固選為主成分，3個主成分的累積貢獻率達86.00%，基本上可表現(xiàn)6個性狀的綜合變異情況。第1主成分貢獻率為39.36%，樹高、胸徑和皮厚的系數(shù)明顯高于其它性狀，說明了濕加松表型遺傳多樣性的重要變異因子為樹高、胸徑和皮厚三個表型性狀；第2主成分貢獻率為30.32%，冠幅、側(cè)枝直徑的特征向量值均較高，說明第2主成分是冠幅、側(cè)枝直徑的綜合反映；第3主成分貢獻率為16.33%，系數(shù)最大的是分枝角(0.92)，說明第3主成分主要反映了分枝角因子。

表535個濕加松無性系基于8個表型性狀的5個主成分的特征向量和貢獻率

Table5Eigenvectorandcontributionrateoffiveprincipalcomponentsbasedoneightphenotypictraitsin35clonesofP.elliottii×P.caribaeaMoreletvar.hondurensis

表型性狀Phenotypic traits主成分Principal componentRC1RC2RC3樹高Tree height0.790.19-0.11胸徑Breast diameter0.70.50.05材積Volume0.690.58-0.11冠幅Crown width0.130.850.12分枝角Branching angle-0.12-0.020.92側(cè)枝直徑Lateral branch diameter0.160.85-0.15輪枝距Wheel pitch0.63-0.010.42皮厚Skin thickness0.80.11-0.19特征值Characteristic value2.72.081.12方差貢獻率Variance contribution rate(%)39.3630.3216.33累積方差貢獻率Cumulative variance contribution rate(%)39.3669.6786.00

注：下劃線表示每個主成分較高的特征向量。

Note:Underline represents the higher eigenvector for each principal component.

3 討論

3.1 濕加松無性系的遺傳多樣性分析

遺傳多樣性作為種質(zhì)資源的重要評價因子，也是培育優(yōu)良品種的研究提供重要依據(jù)[16]。調(diào)查表型性狀的遺傳多樣性是衡量表型變異最直觀最簡易的途徑，但易受環(huán)境、個體差異或標記性狀較少等諸多外在因素影響。前人在表型性狀對松屬植物遺傳多樣性上的研究[17]較少，僅在賀蘭山杜松(Juniperusrigida)[18]、歐洲赤松(PinussylvestrisL.)[19]等少數(shù)松樹上有過相關(guān)報道，大多采用RFLP標記[20]、RAPD標記[21]、SSR標記[22～24]、ISSR[25]等分子標記法研究松樹遺傳變異規(guī)律。本文通過對35個濕加松無性系的8個表型性狀進行遺傳多樣性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8個表型性狀的平均遺傳多樣性指數(shù)較高，表明其有著較高的豐富度與均勻度，豐富了我國濕加松無性系的遺傳背景。另外，從計算結(jié)果可以看出大部分性狀的變異系數(shù)和遺傳多樣性基本統(tǒng)一，材積均較高，分枝角和樹高均較低，說明其離散程度相似。影響濕加松變異的有遺傳與非遺傳兩大因素，各占一半，但研究表明家系的不同對遺傳影響最強，其次是無性系的不同[26]，所以該研究的遺傳多樣性分析結(jié)果可能受到了不同來源的無性系影響。

3.2 濕加松無性系的相關(guān)性分析

通過相關(guān)性分析，9對表型性狀之間存在著較高的相關(guān)性，其中有11對極顯著正相關(guān)，5對顯著正相關(guān)。研究表明樹體越高，皮較厚，胸徑、材積、側(cè)枝直徑、輪枝距也較大，這與梁德洋等[27]對紅松無性系的研究結(jié)果相似，樹高、胸徑與材積之間均呈極顯著正相關(guān)。李義良等[12]研究表明濕地松、加勒比松的樹高、胸徑、材積、皮厚及冠幅兩兩間均呈極顯著正相關(guān)，本研究中除胸徑與材積、胸徑與皮厚及冠幅與皮厚均呈不顯著相關(guān)其它性狀也呈顯著正相關(guān)。綜上所述，在選育濕加松時應(yīng)優(yōu)先參考材積為第一指標，同時應(yīng)參考樹高、皮厚、胸徑、冠幅及側(cè)枝直徑等綜合指標，為今后的選育工作給予理論指導(dǎo)。本研究中參試無性系數(shù)量不同可能對試驗結(jié)果產(chǎn)生一定的誤差，后期應(yīng)增加材料的數(shù)量，另外應(yīng)增加產(chǎn)脂力、木材密度、種子量等性狀的收集，進一步分析更具說服力[28]。此外，用R軟件進行相關(guān)性分析要比IBM SPSS Statisticsr類似軟件更為直觀，其中極顯著相關(guān)分成0～0.001和0.001～0.01兩個級別，更有利于最優(yōu)指標的提取。

3.3 濕加松無性系的聚類分析

利用濕加松無性系的8個表型性狀相關(guān)數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)聚類分析，將表型差異較小的分為一個類群，把35個無性系分為6大類群。第Ⅰ類為選育窄冠型優(yōu)良基因的材料；第Ⅱ類為后期選育速生良種的材料，木材經(jīng)濟價值較高；第Ⅲ類雖長勢良好，但分枝角較大，應(yīng)縮短生長周期；第Ⅳ類長勢均較差，需進一步具體分析再選育良種；第Ⅴ類長勢優(yōu)，為后期選優(yōu)的主要良種材料；第Ⅵ類為選育薄皮型良種的材料。通過對各類群的具體分析，部分來源相同的聚在一類，如來源于澳洲全同胞家系的EHA12與EHA08-2、EHA11與EHA14分別聚為一類，來源于臺山全同胞家系的父本為H01與H03、H05與H06的大多聚在一類，說明它們在表型上的變異較小。大部分來源相同的種質(zhì)聚在不同類群，說明無性系在表型上存在了較大的差異，與無性系的來源沒有必然的聯(lián)系，這與萬述偉等[4]和王麗俠等[29]的研究結(jié)果相同。在育種時可依據(jù)表型性狀的聚類結(jié)果，同時結(jié)合分子標記法，去合理分配種質(zhì)，可有效避免近交，減少控制授粉的工作，大大縮短育種周期，提高濕加松無性系的改良效率。

3.4 濕加松無性系的主成分分析

本研究對濕加松的8個表型性狀進行主成分分析，提取了3個主成分，反映了6個性狀的大部分信息，累積貢獻率高達86.00%，與相關(guān)性分析結(jié)果相似。第1主成分主要代表了樹高、胸徑和皮厚三個生長性狀的綜合情況，體現(xiàn)出濕加松在樹高、胸徑、皮厚三方面明顯的雜種優(yōu)勢，這與李義良等[30]對濕加松雜種優(yōu)勢的研究結(jié)果相似。此外，第2主成分主要反映了冠幅、側(cè)枝直徑的綜合情況；第3主成分主要反映了分枝角的情況，所以這些性狀也可評價濕加松的優(yōu)劣。

綜上所述，對不同來源濕加松無性系的表型性狀進行分析，初步了解了濕加松種質(zhì)的表型遺傳多樣性情況，為今后種質(zhì)利用及良種選育奠定了理論基礎(chǔ)。