血清H2S水平與骨密度的相關性初步研究

郝彥明 王洪震 何大偉 方玲娜 張盼盼 陸榮柱 徐又佳 李翀*

1.昆山市第一人民醫(yī)院骨科，江蘇 昆山 2153002.昆山市第一人民醫(yī)院實驗檢驗中心，江蘇 昆山 2153003.昆山市第一人民醫(yī)院內分泌科，江蘇 昆山 2153004.蘇州大學附屬第二醫(yī)院骨科，江蘇 蘇州 215004

骨質疏松作為一種患病率、致殘率和致死率均非常高的慢性疾病，以骨量減少、骨脆性增加、骨折風險增高為特征，是中老年骨痛和骨折的主要原因。但目前治療骨量丟失的常見藥物有鈣劑、維生素D、降鈣素、雌激素、二膦酸鹽、選擇性的雌激素受體激動劑等，并且最新的Meta分析提示服用鈣劑和維生素D不能降低骨質疏松患者骨折風險[1]；長期使用二膦酸鹽可導致一些副作用，如：食管炎、特殊骨折、下頜壞死、房顫等，所以需要進一步研究安全有效的預防骨量減少和治療骨質疏松癥的新策略、新靶點。

硫化氫(H2S)被證實是繼CO、NO后存在于體內的第3種內源性氣體分子，有著廣泛的生物學效應，心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉等組織系統(tǒng)中均有廣泛的分布，參與許多生理和疾病的病理生理過程。近年來，不斷有研究發(fā)現(xiàn)H2S在骨代謝以及骨質疏松、骨關節(jié)炎等疾病中也有著重要的調控作用，可能成為治療骨質疏松癥的新靶點。本研究團隊針對血清H2S水平與骨質疏松的相關性做了初步研究，目的是研究體內血清H2S水平含量與骨質疏松指標的相關意義，探尋抗骨質疏松新的靶點和治療措施。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2015年10月至2017年10月，112例江蘇昆山地區(qū)體檢和門診就診人員資料，受檢骨密度和血常規(guī)(血清H2S檢測使用血常規(guī)檢查后血樣)的患者，其中男82例，女30例，年齡25～86歲，平均(51.40±10.60)歲。排除標準[2]：(1)多發(fā)骨折、開放性骨折、暴力性骨折(交通傷、墜落傷等)；(2)合并慢性肝腎疾病、代謝性疾病、腫瘤、血液系統(tǒng)疾??；(3)行卵巢切除術；(4)長期接受糖皮質激素、雌激素、降鈣素以及雙膦酸鹽等治療，患者均知情同意，且本研究獲得昆山市第一人民醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 檢測指標

1.2.1骨密度檢測。對昆山地區(qū)體檢和門診就診人員采用美國Lunar公司DPX-NP雙能X線骨密度儀檢測髖部和腰椎(L1～4)骨密度，自動生成T值；其中T≥-1.0為正常，T值位于-1.0～-2.5為骨量減低，T≤-2.5為骨質疏松癥[3]。

1.2.2血清相關指標測定。選取檢查骨密度患者的血常規(guī)血樣，血常規(guī)行急查后立即離心血清，保存于-80 ℃冰箱，以待統(tǒng)一檢測血清硫化氫濃度，采用德國TSZ人硫化氫ELISA試劑盒，目錄號：hg14903，試劑存儲在2 ℃～8 ℃，使用試劑盒檢測H2S水平，使用純化的抗體涂層微孔平板，制作固相抗體，樣品包括標準已知濃度和未知被移進包被微孔，孵育后加入生物素化抗IgG，結合鏈霉親和素洗后成為抗體-抗原-酶-抗體復合物完全，加入TMB底物TMB顯色溶液，溶液變成藍色，在HRP酶催化下，在酸的作用下最終變成黃色，這種有色產(chǎn)品的強度與樣品中H2S的濃度相關，測定光密度(OD)在450 nm的微孔板的讀數(shù)，通過標準計算H2S濃度曲線。計算結果平均定量，重復讀數(shù)控制，并減去平均零標準樣品的光密度。繪制標準曲線，通過繪制每個標準軸上的平均吸光度與濃度的曲線。X軸通過圖1上的點繪制最佳擬合曲線。

圖1 血清H2S濃度與股骨骨密度行Pearson相關性分析Fig.1 Pearson correlation analysis between serum H2S concentration and femoral bone mineral density

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件(IBM公司，美國)進行統(tǒng)計學分析。以血清H2S濃度為自變量，髖部和腰椎骨密度分別作為因變量，行Pearson相關性分析；行多元回歸分析以及偏相關分析。檢驗水準儀值取雙側0.05。

2 結果

昆山地區(qū)受檢人員測定的骨密度和血清H2S相關性分析，以血清H2S濃度為變量的自變量，髖部和腰椎骨密度分別作為因變量，行Pearson相關性分析，其中血清H2S濃度與腰椎骨密度相關分析得出相關系數(shù)r=-0.161，P>0.05，血清H2S濃度與腰椎骨密度無顯著相關性；但是血清H2S濃度與髖部股骨骨密度相關分析得出r=-0.376，P<0.05，血清H2S濃度與髖部股骨骨密度有顯著相關性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討論

本研究團隊是首次報道通過人體臨床研究血清H2S與骨密度的相關性。本研究團隊在該臨床研究中建立了血清H2S檢測方法，收集了江蘇昆山地區(qū)112例體檢人員，通過DPX-NP雙能X線測定骨密度，亞甲基藍法檢測血清H2S。通過分析發(fā)現(xiàn)血清H2S水平與髖部骨密度呈負相關(r=-0.376，P=0.001)，提示內源性H2S可能為骨密度的保護因素。

Vacek 等[4]通過切除大鼠的卵巢制作絕經(jīng)后骨質疏松模型，檢測大鼠體內內源性H2S水平，觀察外源性H2S供體硫氫化鈉對PMOP的影響。并從細胞自噬的角度探討H2S抗骨質疏松的可能機制，研究證明H2S參與了動物體內骨的代謝，H2S通過抑制氧化應激保護成骨細胞的功能。H2S還參與了其他多種生理與病理生理過程，具有廣泛的生物學效應，逐漸顯示出極大的治療性應用前景。如果進一步研究發(fā)現(xiàn)外源性H2S能夠抑制OP的發(fā)生，本研究將為骨質疏松的防治提供新的線索和策略。

H2S對非骨骼系統(tǒng)不同程度保護的作用已經(jīng)有大量研究證實，如保護心??；保護并預防缺血再灌注引起的損傷[5]。保護氧化應激引起的神經(jīng)元的損傷[6]，同樣，Xu等[7]通過細胞層面研究證明合適濃度H2S對骨系統(tǒng)也發(fā)揮正面效果，H2S可以通過抑制離體成骨細胞的氧化應激對骨質疏松起到保護作用，H2S能保護氧化應，應激誘導成骨細胞的損傷，保護成骨細胞的功能。

Dhonukshe-Rutten等[8]通過對破骨細胞研究認為，H2S可以通過H2S供體GYY4137促使破骨細胞分化的加速度，并且增加破骨細胞內水平的抗氧化劑谷胱甘肽，抑制破骨細胞生成RANKL刺激巨噬細胞，但該結論和機理還存在一定爭論，需要進一步研究。而本研究通過閱讀相關文獻給予簡單總結：引起的氧化應激還是抗氧化防御，取決于細胞的氧化還原狀態(tài)的細胞功能雙面效果，筆者推測[9]RANKL誘導的破骨細胞向哪方面分化是取決于前體細胞是受由產(chǎn)生H2S的CSE調節(jié)氧化還原狀態(tài)。

在動物模型方面，研究發(fā)現(xiàn)H2S可以治療雌激素缺乏引起的骨量丟失，調節(jié)H2S水平可以調控雌激素刺激的成骨細胞和骨形成一種新的機制，并且調控H2S水平是治療絕經(jīng)后骨質疏松的一種方法[10]。

對于H2S如何參與骨代謝，筆者總結認為，H2S通過OPG/RANKL通路而影響成骨細胞與破骨細胞的代謝。在成骨細胞方面，通過刺激破骨細胞成熟的過程中OPG/RANKL而發(fā)揮作用，RANKL與破骨細胞表面的RANK結合后激活NF-κB 和c-Fos、鈣調磷蛋白磷酸酶等促使破骨細胞成熟而促進骨吸收，但OPG競爭性抑制RANKL與破骨細胞膜上的RANK 結合，抑制破骨細胞前體的分化，誘導破骨細胞凋亡而抑制骨的吸收[11]。并且通過動物模型研究[12]證實，去卵巢骨質疏松大鼠股骨組織中OPG的表達明顯降低，相反，RANKL表達增加；外源性H2S供體NaHS(50、100 μmol/kg)上調大鼠股骨組織中OPG的表達，降低了RANKL的表達。

本研究團隊持續(xù)在進行H2S與骨代謝的進一步研究。血清H2S濃度與腰椎高密度相關分析有顯著相關性，但與腰椎骨密度相關分析無顯著相關性。筆者將進一步增加樣本量進行相關研究，并且調查分析其他種族人群如我國新疆維吾爾族地區(qū)喜歡飲食含硫食物，能夠為人體提供H2S，可能有緩解骨量減少的作用。通過觀察維吾爾族居民膳食有機硫攝入量對骨量的影響，明確H2S是否對人體骨量有保護作用。此外，CBS、CSE和MPST是人體內H2S代謝的關鍵酶，可調節(jié)內源性H2S水平，探討該3種酶的基因多態(tài)性與骨量的關系，可為骨質疏松癥的易感性的生物學標志物提供重要參考，同時為預防骨丟失提供新策略。