白藜蘆醇對酒精誘導(dǎo)雄性大鼠骨量減少和骨強度降低的保護(hù)作用

吳興凈 陶周善 吳信舉 張俊宇 徐祝軍 徐宏光 王坤正

1.皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，安徽 蕪湖 2410002.皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院脊柱骨科，安徽 蕪湖 2410003.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨一科，陜西 西安 710004

飲酒是一個全球性問題。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的一份報告，在世界范圍內(nèi)15歲或15歲以上的飲酒者約有16.0%酗酒[1]。酒精攝入與多種有害作用有關(guān)，如肝損傷、認(rèn)知障礙和胚胎發(fā)育受損[2]。骨質(zhì)疏松癥是一種非常常見的骨骼代謝紊亂，與多種危險因素有關(guān)。其中之一是低骨量與慢性酒精濫用之間的密切關(guān)聯(lián)[3]。酒精濫用也是骨折愈合受損的一個危險因素，其會導(dǎo)致骨折延長修復(fù)，患有骨折的酗酒者與住院時間延長和發(fā)病率增加有關(guān)[4]。在酒精引起的骨質(zhì)疏松癥中發(fā)揮中心作用的一個因素是自由基的過度生成，這又引起氧化應(yīng)激反應(yīng)形成[5]。酒精引起的炎癥狀態(tài)也會導(dǎo)致細(xì)胞因子產(chǎn)生增加，這可能會在許多器官(包括骨骼)中誘發(fā)損傷[6]。已知從紅葡萄、花生和其他植物提取的天然多酚組分白藜蘆醇(RES)發(fā)揮許多有益的藥理作用，例如抗腫瘤、清除自由基、抗炎癥、心臟保護(hù)和血管保護(hù)作用[7]。臨床和實驗研究表明，RES通過減輕氧化應(yīng)激引起的損傷來防止骨質(zhì)流失。RES可誘導(dǎo)產(chǎn)生主要的細(xì)胞抗氧化酶，如GSH-PX、血紅素加氧酶和SOD，導(dǎo)致氧化應(yīng)激明顯減弱[8-9]。RES的骨保護(hù)作用主要歸因于其抗氧化活性。更重要的是，RES沒有毒性作用，因此RES可以安全地用于治療和/或預(yù)防骨質(zhì)疏松癥，即使長時間使用[10]。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生會使人虛弱并影響生活質(zhì)量。尋找替代療法來預(yù)防酒精引起的骨質(zhì)疏松癥，同時考慮到RES抗氧化特性。筆者假設(shè)RES對酒精引起的骨質(zhì)疏松癥具有保護(hù)作用，為了證明這一假設(shè)，本研究旨在確定RES對酒精引起的骨質(zhì)疏松大鼠骨量和骨強度的影響。

1 材料和方法

1.1 動物治療和標(biāo)本檢測

30只3月齡的SD雄性大鼠 (購自上海實驗動物中心)，體重220～250 g。動物喂食商品實驗室食物；所有大鼠在測試期間保持在恒定溫度(25 ℃)和濕度(50±20)%下，自由接近蒸餾水。將大鼠分成3組：對照組、模型組和治療組，每組10只。研究中使用100%無水乙醇(Sigma，USA)，然后將其制備成20%(體積/體積)乙醇/鹽水溶液。模型組和治療組大鼠按體重每100 g腹膜內(nèi)給予0.4 mL配置好的20%乙醇溶液，每周3次。這種暴露模型模仿人類暴飲暴食，所使用的劑量已被證明對骨骼產(chǎn)生影響[11]。本研究中使用的酒精劑量產(chǎn)生的血液酒精濃度接近300 mg/dL，這相當(dāng)于慢性酒精飲酒者常見的血液濃度[11]。治療組接受RES溶液(Sigma-Aldrich)按體重40 mg/kg治療，每日一次。治療為期12周，在治療期結(jié)束時，來自每個治療組的大鼠用乙醚麻醉并通過頸椎脫臼處死。通過心臟穿刺收集血液，并在4 ℃下以3 000 r/min的速度離心20 min，根據(jù)制造商的說明書(Elabscience Biotechnology Co.，Ltd.，Wuhan，China)，通過450 nm的比色分析測量堿性磷酸酶(alkaline phosphates，ALP) (E-EL-R0113c)和骨鈣素(osteocalcin，OC)(E-EL-R0243c)的血清水平，并收集左側(cè)股骨進(jìn)行分析。

1.2 股骨Micro-CT檢測

將左側(cè)股骨固定在10%中性福爾馬林中48 h，然后將它們浸入70%乙醇中。采用Micro-CT(VivaCT 40；Scanco，Brüttisellen，Switzerland)以15 μm分辨率，管電壓70 kV和管電流114μA掃描股骨中遠(yuǎn)端骨微結(jié)構(gòu)。重建和3D定量分析使用Micro-CT系統(tǒng)(VivaCT 40；Scanco)提供的軟件進(jìn)行。在股骨中，皮質(zhì)骨體積(Ct.Vo)和皮質(zhì)厚度(Ct.Th)在中間骨干參考點的幫助下分析，其中感興趣區(qū)域(region of intereste，ROI)為1.0 mm。小梁骨區(qū)域參考點在生長板接合處，偏移2.0 mm為ROI。在定義的ROI中分析以下3D參數(shù)，包括相對于總體積的骨量(BV/TV，%)、小梁數(shù)量(Tb.N)、小梁厚度(Tb.Th)、小梁間距(Tb.Sp)、連接密度(Conn.D)、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(structural model index，SMI)和骨密度(bone mineral density，BMD)。

1.3 骨力學(xué)性能測試

根據(jù)先前的方法通過三點彎曲測試評估所有骨樣品的股骨強度。將每只大鼠的股骨在-80 ℃從存儲器中取出，并使用卡尺測量長度。使用小數(shù)點后4位數(shù)字標(biāo)尺確定骨的水合重量。標(biāo)本被放置在兩個支撐(12 mm)，并彎曲直到通過降低位于中間軸處的十字頭而斷裂。從載荷放置曲線獲得峰值載荷(N)和極限剛度(N/mm)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠骨密度的改變

治療12個月，3組大鼠股骨的骨密度如表1所示。給予酒精干預(yù)12周，模型組較對照組大鼠的骨密度顯著降低，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；使用RES治療的治療組其骨密度較對照組顯著升高，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這表明RES對酒精干預(yù)的雄性大鼠的骨密度有一定的保護(hù)作用。

表1 不同組別股骨的小梁微結(jié)構(gòu)和皮質(zhì)參數(shù)比較 Table 1 Comparison of trabecular microstructure and cortical parameters of femur in different groups

注：結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05(n=5/組)。

圖2 治療對大鼠股骨生物力學(xué)的影響(與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05)。A：峰值負(fù)荷；B：極限硬度Fig.2 Effects of treatment on femur biomechanics (Compared with the control group, *P<0.05; compared with the model group, #P<0.05). A: Peak load; B: Ultimate hardness

2.2 Micro-CT檢測結(jié)果

治療12周時大鼠的股骨遠(yuǎn)端的Mciro-CT掃描結(jié)果如圖1所示，微觀參數(shù)如表1所示。與對照組相比，模型組的股骨骨量和小梁厚度顯著降低(P<0.05)，且小梁間距增加(P<0.05)；而治療組上述指標(biāo)明顯優(yōu)于模型組，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。骨組織形態(tài)計量學(xué)參數(shù)顯示，RES對去卵巢大鼠股骨骨量有保護(hù)作用。

圖1 三組大鼠股骨干骺端三維重建結(jié)果Fig.1 Three-dimensional reconstruction of femoral metaphysis in the three groups of rats

2.3 生物力學(xué)性能

生物力學(xué)測試獲得的數(shù)據(jù)見圖2，對照組具有最高的極限載荷和峰值負(fù)荷；與模型組比較，治療組極限載荷和峰值負(fù)荷明顯增加，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 治療后大鼠血清ALP和OC的影響

治療后大鼠血清ALP和OC如圖3所示。與對照組比較，模型組和治療組的ALP和OC顯著增加(P<0.05)。治療組的ALP和OC較模型組明顯降低，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

圖3 治療對大鼠血清ALP和OC的影響(與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05)Fig.3 Effects of treatment on serum ALP and OC (Compared with the control group, *P<0.05; compared with the model group, #P<0.05)

作為老年人中主要存在的疾病之一，由于老年人口的增加，越來越多的人患有骨質(zhì)疏松癥和骨質(zhì)疏松性骨折[12]。骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為人口老齡化中的醫(yī)療保健問題，然而它尚未吸引足夠的研究注意力。由于社會文明和經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，生活水平的提高以及生活方式和習(xí)慣的改變，特別是隨著城市和地區(qū)老齡化程度的加劇，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率迅速上升，并成為老年人常見的疾病人口。近年的研究表明，酒精會導(dǎo)致成年人的骨質(zhì)破壞，進(jìn)一步明確酒精可以顯著降低脛骨的骨強度[13]。在健康的年輕女性中，飲酒與總股骨和股骨頸骨密度降低有關(guān)，男性骨密度也受到酒精干預(yù)的影響[14]。本研究中使用酒精誘導(dǎo)雄性大鼠骨損傷，12周的誘導(dǎo)結(jié)果顯示酒精可以顯著降低大鼠股骨骨強度、降低股骨骨密度和遠(yuǎn)端骨小梁的量。在本研究中，證實用中劑量白藜蘆醇治療顯著增加酒精誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松大鼠的BMD。本研究表明白藜蘆醇可以一定程度上保護(hù)酒精對骨骼的損害。

已經(jīng)注意到酒精導(dǎo)致的骨損傷與炎癥過程之間的關(guān)系，酒精會增加的細(xì)胞因子和活性氧的產(chǎn)生。產(chǎn)生氧的自由基是有氧代謝的副產(chǎn)物。這一過程主要發(fā)生在線粒體中，因為電子逃逸通過電子傳遞鏈，并產(chǎn)生高反應(yīng)性和短壽命的超氧化物。作為ROS最豐富的形式，H2O2通過線粒體膜自由擴(kuò)散到細(xì)胞質(zhì)中。氧化應(yīng)激是ROS升高的結(jié)果，ROS損害蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA，最終引發(fā)細(xì)胞死亡。在本研究中，使用酒精來誘導(dǎo)大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激。已知天然多酚組分RES是發(fā)揮許多有益的藥理作用，包括抗腫瘤、清除自由基和抗炎活性。臨床和實驗研究表明RES通過減輕氧化應(yīng)激的損傷來防止骨質(zhì)流失。此外，有研究表明在RES處理的去卵巢大鼠中OPG產(chǎn)生增加，而RANKL合成降低，因此阻止了破骨細(xì)胞的形成和分化[15]。更重要的是，RES沒有毒性作用，因此即使用于長期治療和/或預(yù)防骨質(zhì)疏松癥也是安全的[15]。本研究結(jié)果表明，通過改善氧化應(yīng)激狀態(tài)，RES可以抑制了破骨細(xì)胞活性(ALP和OC水平降低)，因此最終減弱了骨吸收并防止了體內(nèi)的骨質(zhì)流失，并且引起保護(hù)免受氧化損傷并且抑制骨質(zhì)疏松癥中的破骨細(xì)胞生成。

骨基質(zhì)包括有機(jī)物質(zhì)和無機(jī)物質(zhì)。有機(jī)質(zhì)主要包含膠原纖維(主要是I型和II型膠原纖維)和少量非晶基質(zhì)。無機(jī)物是指骨礦物質(zhì)，包括結(jié)晶羥基磷灰石和無定形膠體鈣磷。膠原纖維是構(gòu)成骨骼結(jié)構(gòu)并維持骨骼機(jī)械強度的基質(zhì)蛋白質(zhì)。因此，骨形成等同于骨礦化，指的是無定形磷酸鈣及其骨礦物質(zhì)定期沉積在骨有機(jī)質(zhì)間隙中的過程[16]。研究表明，雌激素促進(jìn)I型成骨細(xì)胞膠原蛋白，堿性磷酸酶和轉(zhuǎn)化生長因子的分泌，從而促進(jìn)骨形成[17]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，酒精誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥大鼠的血清ALP和OC水平明顯升高。同樣，已經(jīng)有研究表明白藜蘆醇通過抑制年輕大鼠中ALP水平的介導(dǎo)促進(jìn)骨生長[17]。本研究中RES治療后大鼠的血清ALP和OC水平明顯降低，這和去卵巢誘導(dǎo)大鼠骨質(zhì)疏松結(jié)果相似[17]。

這項研究采用了酒精誘導(dǎo)雄性大鼠骨質(zhì)疏松模型，顯示酒精對骨骼有不良影響。酒精可以顯著降低骨骼生物力學(xué)性能。RES可以顯著保護(hù)酒精誘導(dǎo)雄性大鼠骨強度和骨密度以及骨量。但是本研究也有其不足之處，首先大鼠的年齡較輕且大鼠數(shù)量很少，研究時間較短，后期加大研究時間和樣本量以及進(jìn)一步的機(jī)制研究顯得有必要。