珊瑚羥基磷灰石負(fù)載含BMP-2納米緩釋微球體系促進(jìn)人間充質(zhì)干細(xì)胞骨形成的研究

于鵬 紀(jì)志華 賈丙申 周立義 付昆

海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)創(chuàng)傷外科，海南 海口 570102

骨移植手術(shù)中，自體骨是最有效的材料，但將其用于修復(fù)骨缺損或脊柱融合術(shù)中存在造成取骨供體部位創(chuàng)傷及骨量有限因素限制。自體或同種異體骨可常規(guī)應(yīng)用于促進(jìn)骨再生[1]，但供體骨來源同樣有限，且具有病原體感染和排異的潛在風(fēng)險(xiǎn)。人工骨的研究和使用解決了這個(gè)問題，而珊瑚羥基磷灰石(coralline hydroxyapatite，CHA)人工骨的研究是其中的熱點(diǎn)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有廣泛的骨形成潛能[2]，鑒于難以評估其在人體內(nèi)的成骨潛能，之前多采用的是免疫功能低下的動(dòng)物系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究[3]，例如小鼠等模型系統(tǒng)在此類實(shí)驗(yàn)中被廣泛使用，免疫缺陷小鼠的MSCs發(fā)育形成成熟的骨組織是一個(gè)長期的過程，其形成極有可能依賴于細(xì)胞生存環(huán)境的穩(wěn)定。相關(guān)研究表明[4]，通過培養(yǎng)使得MSCs形成異位骨組織，可以成功將其植入免疫缺陷小鼠體內(nèi)。然而僅僅在2周內(nèi)就基本被機(jī)體清除，無法得到長期的保留與發(fā)育。可據(jù)此推測，成骨細(xì)胞移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)后無法維持發(fā)育的原因是小鼠體內(nèi)環(huán)境不適宜該細(xì)胞生長發(fā)育，因?yàn)槿祟惓晒羌?xì)胞的發(fā)育需要特定生長因子，而小鼠缺乏，因而導(dǎo)致宿主巨噬細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞增生為特征的炎癥反應(yīng)，引起廣泛的異位骨吸收。本研究旨在通過CHA負(fù)載含BMP-2納米緩釋微球體系促進(jìn)MSCs分化成骨。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究使用的CHA的孔徑和表面結(jié)構(gòu)參考以往同類研究[5-6]，購自北京創(chuàng)意生物工程新材料有限公司。BMP-2購自上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司。聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA](50:50)購自北京沃海環(huán)球科技有限公司(阿波羅試劑)。甲醛、Triton X100、丙酮、甲醇、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、甲苯胺藍(lán)染色均購自上海生工公司。從自脊柱融合的髂骨移植術(shù)后患者抽取10 mL骨髓，采用無菌肝素抗凝的注射器盛裝，用以制備MSCs。患者對本研究均知情同意，并簽署骨髓捐贈(zèng)知情同意書，本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1MSCs分離與培養(yǎng)：每個(gè)骨髓樣品用PBS洗滌3次，保留沉淀與上清液5 mL，采用密度梯度離心，從1.073 g/mL的密度界面分離出目的細(xì)胞，將細(xì)胞重懸并接種于T-75燒瓶中，每瓶2×105個(gè)。培養(yǎng)液中含有20%胎牛血清(FBS)和抗生素的達(dá)爾伯克改良伊格爾的中低葡萄糖(DMEM-LG；Gibco，Grand Island，NY)，培養(yǎng)箱環(huán)境為37 ℃，5%CO2。連續(xù)培養(yǎng)7 d后更換培養(yǎng)基，加入青霉素(100 mL)和鏈霉素(100 mg/mL)。同時(shí)除去未貼壁細(xì)胞。MSCs作為對稱集落生長，用0.05%胰蛋白酶(鄭州奇雅化工產(chǎn)品有限公司)處理10～14 d后傳代并接種到新瓶內(nèi)。

1.2.2制備BMP-2并載到CHA上的過程：采用水-油-水方式制備BMP-2緩釋微球的PLGA。將200 mg PLGA溶解在1 mL二氯甲烷中，混勻后加入1 mg BSA作為BMP-2的載體。配比為BSA1mg+rhBMP-2 20 g，去離子水200 μL。將整個(gè)混合物用超聲波發(fā)生器(Microson TM Ultrasonic Cell Disruptor，NY)在2 W的冰水浴中超聲處理1 min(靜止10 s，靜止10 s)以形成初級水油乳液，室溫下用1%聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol PVA)10 mL溶液以6 500 r/min的轉(zhuǎn)速均質(zhì)化30 s。將所得的乳液在攪拌下倒入1%PVA 90 mL溶液中3 h以蒸發(fā)有機(jī)溶劑。所得的PLGA微球體用蒸餾去離子水洗滌3次，并通過以2 000 r/min離心(Beckman Coulter，Allegrax12R，USA)進(jìn)行收集。將微球體凍干(Edwards Modulyo，Crawley，England)過夜，即為CHA-BMP-2-hMSCs成品冷凍保存待用。

將BMP-2包封的微球體懸浮在具有CHA的溶液中，渦旋混勻確保微球體能夠滲入CHA中的200 μm多孔通道。通過超聲處理將微球懸浮于0.02%吐溫80 ℃的水溶液中10 min。通過溶劑萃取法測定BMP-2在PLGA微球中的包封率，將rhBMP-2包封的微球體溶解在2 mL二氯甲烷中，后加入0.1 mol/L PBS 5 mL。使用IKA微型反應(yīng)器(MS2，IKA works Inc.，USA)以2 500 r/min轉(zhuǎn)速將混合物渦旋1 min，37 ℃溫育將BMP-2從有機(jī)相中萃取至水相，1 000 r/min振蕩2 h。低溫離心機(jī)以10 000 r/min離心之后測定上清液中的蛋白質(zhì)，平行測定3次。

1.2.3分組進(jìn)行皮下植入：在體外培養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周，將CHA-BMP-2-hMSCs與CHA -hMSCs移植物分別植入兩組小鼠的L4和L5橫向軟組織中。10周后處死小鼠，進(jìn)行骨礦物質(zhì)含量(bone mineral content，BMC)檢查。

1.2.4指標(biāo)檢測：(1)檢測堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性。10 d后，取小鼠血樣采用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行ALP活性測定。(2)免疫組織化學(xué)。將植入物取出后進(jìn)行切片晾干并固定在10%福爾馬林緩沖液、0.5%苯胺、pH 4.5醋酸緩沖液中染色，顯微鏡下觀察骨樣組織形成的面積。(3)Western bloting檢測。采用Western blot方式檢測小鼠血中Runx2蛋白與骨橋蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 檢測ALP活性

10 d后，取小鼠血樣采用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行ALP活性測定。非緩釋組小鼠的ALP活性為(1.67±0.42)nmol/min，顯著低于CHA-BMP-2-hMSCs 的(2.55±0.53)nmol/min(t=8.254，P<0.01)。

2.2 免疫組織化學(xué)

將植入物取出后進(jìn)行切片晾干并固定在10%福爾馬林緩沖液、0.5%苯胺、pH 4.5醋酸緩沖液中染色，顯微鏡下觀察骨樣組織形成的面積。結(jié)果可見非緩釋組小鼠的CHA支架表面未見骨樣組織形成。而在緩釋組小鼠的CHA支架上可見約20%的面積已被骨狀組織覆蓋。非緩釋組小鼠骨樣組織形成面積顯著低于緩釋組小鼠(P<0.05)。見圖1。

圖1 兩組免疫組織化學(xué)染色(顯微鏡下觀察骨樣組織形成的面積)Fig.1 Immunohistochemical staining (microscopic observation of the area of bone-like tissue formation)注：NB：新骨；OS：類骨質(zhì)；S：復(fù)合物

2.3 Western blot檢測

采用Western blot方式檢測小鼠血中Runx2蛋白與骨橋蛋白表達(dá)水平。結(jié)果可見非緩釋組小鼠的Runx2蛋白表達(dá)水平為(1.42±0.18)fold，顯著低于緩釋組的(2.36±0.21) fold(t=6.758，P<0.01)；骨橋蛋白表達(dá)水平為(1.78±0.26) fold，顯著低于緩釋組的(3.17±0.27)fold(t=9.724，P<0.01)；骨鈣素表達(dá)水平為(1.24±0.08)fold，顯著低于緩釋組的(1.75±0.12)fold(t=4.336，P<0.01)。

3 討論

骨骼形成后需要成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的平衡來維持。成骨細(xì)胞的形成和破骨細(xì)胞引導(dǎo)的生理過程受多種生物學(xué)與力學(xué)因素的調(diào)節(jié)，由成骨細(xì)胞形成新骨，由破骨細(xì)胞破壞吸收舊骨并引導(dǎo)成骨細(xì)胞成骨。有研究顯示，自年輕患者與老年患者體內(nèi)分離的hMSCs克隆形成率無顯著差異[7]，年輕患者與老年患者的區(qū)別在于骨增殖能力和骨再生能力的不同。老年人骨形成和骨吸收不平衡，有利于骨吸收，導(dǎo)致骨丟失和骨質(zhì)疏松[8]?？赡艿脑?yàn)槔夏耆思に厮揭呀?jīng)發(fā)生改變，或局部產(chǎn)生了細(xì)胞因子[9-10]。CHA已被證明能夠支持MSCs在體外的增殖和分化，因此可被用作骨替代材料[11]，CHA結(jié)合BMP或膠原蛋白也成功地在體外實(shí)驗(yàn)中實(shí)現(xiàn)了骨再生。然而在早期研究顯示，將CHA 結(jié)合hMSCs后植入免疫缺陷小鼠，5周后沒有生長出任何骨組織[12]。這意味著成骨細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)過程中可能在某種程度上依賴于由支架化學(xué)成分與宿主組織之間相互作用建立的局部微環(huán)境。為了能夠長時(shí)間維持骨形成過程，可能需要骨形成信號的長時(shí)間作用。然而，這種骨是來源于供體細(xì)胞還是通過宿主細(xì)胞的骨誘導(dǎo)，尚未得到確定。

為了促進(jìn)以骨吸收為主的環(huán)境中的骨形成，可能需要持續(xù)供應(yīng)刺激合成代謝的生長因子以延長期望的骨形成過程。BMP-2已被廣泛用作體內(nèi)和體外骨形成的誘導(dǎo)劑和增強(qiáng)劑[13]，并已廣泛應(yīng)用于臨床[14-15]。且目前BMP的應(yīng)用劑量相對較高，如BMP7為3.5 mg單劑量，rhBMP-2單劑量為12 mg[16]。但無論劑量如何，應(yīng)用的哪種BMP，若要在長時(shí)間內(nèi)維持穩(wěn)定劑量都需要一個(gè)適宜的遞送系統(tǒng)，以便優(yōu)化骨愈合的長期過程[17]。這種系統(tǒng)不僅能夠提供適當(dāng)?shù)尼尫艜r(shí)間，還能提供釋放的載體，以保持與周圍組織之間的完整性。優(yōu)化的輸送系統(tǒng)能夠提高成骨潛能而盡可能減少BMP的總體用量，更為安全而經(jīng)濟(jì)[17-18]。

由于上述原因，本研究將hBMP-2包裹在用于控制釋放hBMP-2的微球中。將復(fù)合物植入免疫缺陷小鼠皮下，通過hBMP-2的緩釋作用，在植入10周后處死小鼠，可見在植入CHA-hBMP-2-hMSC后的小鼠CHA支架上觀察到骨組織的形成。血清學(xué)與Western blot也顯示植入CHA-hBMP-2-hMSC后的小鼠骨生成較植入CHA-hMSC后的小鼠更為活躍。

由此可見，通過優(yōu)化CHA-hBMP-2-hMSC組合，可以將CHA作為功能性生物材料進(jìn)行激活，有效彌補(bǔ)較大的骨缺損、老齡以及炎癥等之前被認(rèn)為缺乏適合長期骨組織形成環(huán)境的劣勢，通過CHA-hBMP-2-hMSC系統(tǒng)的緩釋作用解決問題。

綜上所述，將CHA作為支架結(jié)合MSCs，并配合BMP-2緩釋微球形成復(fù)合物進(jìn)行植入，通過上調(diào)骨鈣素、Runx2蛋白與骨橋蛋白表達(dá)水平，支持免疫缺陷小鼠骨形成的時(shí)間能夠長達(dá)10周。