2型糖尿病合并不同骨量患者外周血Runx2 mRNA表達與25(OH)D的關系

王信 羅麗婭 肖雪 王勇朋 陽琰 王哲 張旋 李琪 樊思桐 朱玉玉

遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院，貴州 遵義 563099

糖尿病(diabetes mellitus，DM)及其并發(fā)癥嚴重威脅人類的健康。多年來大多數研究一直從糖尿病與胰腺之間的關系入手，但其發(fā)病機制至今尚未完全明確，說明糖尿病發(fā)病不僅僅是胰腺問題。25羥維生素D[25 hydroxyvitamin D，25(OH)D]與糖尿病及其并發(fā)癥、骨代謝等均有關[1-3]。25(OH)D不僅可以改善骨代謝，對保護胰島β細胞功能、調節(jié)炎癥和免疫反應有一定的作用，短期補充25(OH)D能改善胰島β細胞功能[4-5]。25(OH)D對骨形成的影響包括間接作用和對成骨細胞的直接作用。一方面，25(OH)D通過促進腸道鈣吸收，提高血鈣的濃度，為骨礦化提供必需的原料，從而間接作用于骨形成。此外，成骨細胞表達維生素D受體，是25(OH)D作用的重要靶器官，體外細胞培養(yǎng)實驗也顯示維生素D可促進人成骨細胞分化、礦化[6]。Runx2是骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號的靶目標，是調節(jié)成骨細胞分化的重要因子，骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號轉導通路參與了成骨細胞的生理過程[7]。經典Wnt信號通路在成骨細胞(osteoblast，OB)的分化、增殖中發(fā)揮重要作用，對骨形成、代謝均起著重要的調控作用[8]。過表達的PPARγ可使Wnt信號通路失活，下調Runx2表達，促進脂肪形成，使得骨髓基質細胞向脂肪細胞分化，這是脂代謝紊亂與骨質疏松(osteoporosis，OP)這兩種疾病相互影響的重要生理基礎[9]。目前對于外周血中Runx2 mRNA表達在不同骨量狀態(tài)下糖尿病患者之間差異及其與25(OH)D的關系，目前國內外尚未見相關研究報道。因此，本研究擬通過檢測不同骨量狀態(tài)下2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者外周血中Runx2 mRNA的表達，初步探討外周血中Runx2 mRNA表達與25(OH)D的關系，可能為2型糖尿病、OP的早期聯合防治提供新的視點。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2016年7月至2017年6月就診于遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院內分泌科住院治療的初診T2DM患者150例，據骨密度測定結果分為： T2DM+骨量正常組(A組)50例[年齡(60.5±7.2)歲，男25例，女25例]；T2DM合并骨量減少組(B組)50例[年齡(59.4±6.7)歲，男24例，女26例]；T2DM合并骨質疏松組(C組)50例[年齡(61.0±6.1)歲，男26例，女24例]。選取遵義醫(yī)學院體檢中心年齡、性別相匹配的健康對照者(NC組)50例[年齡(59.9±7.1)歲，男25例，女25例]。取得所有受試者的知情同意并通過醫(yī)院倫理委員會批準。

納入標準：①絕經1年以上的女性及年齡≥60歲的男性；②2型糖尿病診斷均符合1999年WHO糖尿病診斷標準，且為新診斷的2型糖尿病患者；③骨質疏松診斷符合1994年WHO 制定的OP診斷標準，通過雙能X線骨密度儀測定確診；④18 kg/m2≤BMI≤25 kg/m2；⑤未接受過任何糖尿病降糖治療措施，包括飲食、運動療法；⑥肝腎功能正常，無其他嚴重器質性疾病及糖尿病急、慢性并發(fā)癥；⑦正常對照組無糖尿病及痛風家族史；⑧無吸煙史及長期大量飲酒史。排除標準：①1型糖尿病或其他特殊類型糖尿?。虎谟懈哐獕翰∈?、心腦血管疾病病史、骨折史、急慢性感染、惡性腫瘤病史，合并甲狀腺功能亢進、甲狀腺功能低下、甲狀旁腺疾病、代謝性骨病等內分泌疾??；③妊娠或哺乳期婦女或長期服用避孕藥的婦女；④近1個月內使用過影響糖、脂代謝及其他影響體內25(OH)D代謝的藥物。⑤近一個月內使用過影響骨代謝的藥物如降脂藥、類固醇、甲狀腺激素、糖皮質激素及降糖藥物(TZD、SGLT2I和胰島素)等。

1.2 研究方法

1.2.1血漿25(OH)D及生化指標的檢測：研究對象試驗前禁食12 h，禁飲8 h，空腹抽靜脈血，測血脂、血糖、胰島素。電化學發(fā)光法(試劑盒購于Roche Diagnostics GmbH)測25(OH)D，高壓液相色譜法測定糖化血紅蛋白(hemoglobin A1c，HbA1c)(試劑為美國伯樂D-10配套試劑),Olympus(AU2700)全自動分析儀檢測總膽固醇(triglycerides，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(lipoprotein-cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(lipoprotein-cholesterol，LDL-C)，測定空腹胰島素(fasting plasma insulin，FINS)采用電化學發(fā)光法測定含量(試劑盒購于Roche Diagnostics GmbH)，測定空腹血漿葡萄糖(fasting plasma ghlcose，FPG)采用己糖激酶法，HbA1c水平采用高壓液相法測定。Real Time-PCR檢測Runx2 mRNA的表達。測血壓、身高、體重，計算體質量指數(body mass index，BMI)(kg/m2)、腰臀比(waist-to-hip ratio，WHR)，計算胰島素抵抗指數(HOMA-IR)=FPG×FINS/22.5。

1.2.2RNA的提取和cDNA的合成：對所有研究對象采集5 mL外周靜脈血，枸櫞酸鈉抗凝。采用淋巴細胞分離液從外周血中分離淋巴細胞，然后用Trizol法提取總RNA。紫外分光光度計檢測RNA在260 nm/280 nm波長處的吸光度值，A260/A280在1.9～2.1純度符合要求?？俶RNA 提取試劑盒及第一條鏈合成試劑盒由Promega公司提供；Real time PCR 熒光定量試劑盒由Promega公司提供。根據試劑盒說明進行操作。

1.2.3Real time PCR 熒光定量反應體系及過程：提取血漿中總RNA，以總RNA 1.5μg為逆轉錄反應模板進行逆轉錄總的反應體積是20 μL。Runx2引物正義：5′-GCTATTAAAGTGACAGTGGACGG-3′；反義：5′-GGCGATCAGAGAACAAACTAG-3′；β-acti引物正義：5′TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG 3′；反義：5′ TGCTGTCACCTTCACCGTTC 3′。反應條件：95 ℃預變性4 min，95 ℃變性30 s，55 ℃～73 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)28～30次，75 ℃終末延伸5 min。退火溫度和循環(huán)次數Runx2 55 ℃，30個循環(huán)；β-actin 58 ℃，28個循環(huán)。為了校正誤差，本研究利用管家基因β-actin 作為內參，以待測樣品目的基因的拷貝數平均值除以該樣品內參基因的拷貝數平均值，得到目的基因的相對含量。樣品中模板的拷貝數，可由SDS 軟件通過所得到的Ct 值從標準曲線上計算得到。

1.2.4設計合成引物：通過美國國立生物技術信息中心(NCBI)的Gene數據庫，查找人各目的基因的mRNA核苷酸序列及序列號，然后用Primer-BLAST比對引物特異性，由TaKaRa公司合成。各引物的序列見表1。

表1 各基因引物序列(熒光定量PCR測定) Table 1 Specific primers used for real-time PCR

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 一般臨床指標比較

與NC組比較，A、B、C組FBG、HbA1c、HOMA-IR、LDL-C水平均顯著升高，而HDL-C明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與A組比較，B、C組HbA1c、HOMA-IR均顯著升高(P<0.05)，而FBG、LDL-C、HDL-C組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；C組25(OH)D水平顯著低于NC組、A組及B組；B組低于NC組及A組；A組低于NC組，4組間25(OH)D水平呈現逐漸下降的趨勢，即 C組0.05)。見表2。

2.2 Real time PCR 檢測Runx2 mRNA 的表達

A組與NC組相比，外周血中Runx2 mRNA表達水平減低，差異具有統(tǒng)計學意義(t=21.256，P<0.05)；B組與NC組相比，外周血中Runx2 mRNA表達水平減低，差異具有統(tǒng)計學意義(t=23.522，P<0.05)；C組與NC組相比，外周血中Runx2 mRNA表達水平減低，差異具有統(tǒng)計學意義(t=23.522，P<0.05)；A組與B組相比，外周血中Runx2 mRNA表達水平升高，差異具有統(tǒng)計學意義(t=24.232，P<0.05)；A組與C組相比，外周血中Runx2 mRNA表達水平升高，差異具有統(tǒng)計學意義(t=24.232，P<0.05)；B組與C組相比，外周血中Runx2 mRNA表達水平升高，差異具有統(tǒng)計學意義(t=24.232，P<0.05)。見表3。

表2 4組間一般臨床資料及25(OH)D水平的比較 Table 2 Comparison of general characteristics and serum 25-OH vitamin D levels among the four groups

注：和NC組比較,*P<0.05；和A 組比較，#P<0.05；和B組比較，△P<0.05。

表3 各組中Runx2 mRNA的表達Table 3 The expression of Runx2 mRNA

注：和NC組比較，1P<0.05；和A組比較，2P<0.05；和B組比較，3P<0.05。

2.3 Pearson 相關分析結果

血漿中25(OH)D與性別、年齡、血壓、BMI、TC、HDL-C、LDL-C比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與Runx2 mRNA表達呈正相關(r=0.548，P<0.05)，與HbAlc、HOMA-IR、TG呈負相關(相關系數r分別為-0.315、-0.323、-0.348，P<0.05)。見表4。

表4血漿中25(OH)D水平與臨床指標的相關性分析

Table4Correlation analysis of plasma 25(OH)D levels and clinical indicators

項目25(OH)Dr值P值HbAlC-0.3150.025HOMA-IR-0.3230.023TG-0.3480.041Runx2 mRNA0.5480.025

3 討論

糖尿病作為一種慢性全身性代謝性疾病，隨著經濟發(fā)展、生活方式的改變及人口老齡化，目前在全球呈爆發(fā)趨勢。2013年糖尿病患病人數達到3.82億，預計到2030年全球患糖尿病的人數將達到約4.4億[10]，其中，2型糖尿病占90%以上，因其高發(fā)病率、高致殘率而引起人們高度關注。我國至少有6 944萬人患有OP，2.1億人存在低骨量，估計每年用于治療OP引起中老年患者骨折的費用已高達104億人民幣，而到2020年將超過217億[11]。有研究顯示，血糖水平控制較差的 T2DM 患者因骨量減少而引起骨折的風險較血糖控制良好者及非 T2DM人群高47%～62%[12]。T2DM、骨質疏松癥，它們看似獨立的疾病，但它們往往并存于同一個體，使患者生活質量更趨下降，加重了家庭及社會經濟負擔。OP已成為我國第4位常見慢性疾病，T2DM人群中OP的發(fā)病率也明顯高于正常對照組[13]。T2DM合并OP是指患者體內代謝失衡、骨密度減低導致骨組織微結構破壞和骨脆性增加，從而使得骨折風險大大增加的一種全身性代謝性骨病[14]，給患者帶來極大的困苦。由此可見，T2DM、OP這兩種疾病均已成為世界上非常普遍的全身代謝性疾病。維生素D 缺乏者不僅容易患骨質疏松，更易患代謝綜合征及糖尿病[15]，糖尿病患者中普遍存在維生素D水平的缺乏[16]。Runx2是成骨細胞的特意轉錄因子，可通過結合成骨細胞特異性原件[17]。Runx2表達可以促進脂肪形成，使得骨髓基質細胞向脂肪細胞分化，導致OP，但是目前國內外未見T2DM合并不同骨量患者血漿中Runx2 mRNA表達與25(OH)D之間的關系的研究報道，因此，本研究擬從這一問題入手進行探索，可能對臨床早期聯合防治糖尿病、OP具有重要的意義。

研究發(fā)現，1,25(OH)2D3處理OB分化時，OB特異性轉錄因子Runx2、Osterix等表達增加，使OB分化增強，1,25(OH)2D3可能通過下調PPARγ、SFRP1(secreted frizzled-related proteins，SFRP 1)表達，上調Osterix的表達，繼而激活β-catenin信號通路，Wnt/β-catenin信號通路通過β-catenin/Tef-1介導的成骨性轉錄因子Runx2的活化促進骨的形成[18]，從而阻斷脂肪細胞分化，減少外周組織胰島素抵抗(insulin resistance，IR)，對OB的功能有積極保護作用[19]。生理劑量的1,25(OH)2D3可抑制OB增殖、促進OB分化，補充維生素D可以有效抑制肥胖，改善血脂代謝紊亂，抑制脂肪生成，減輕IR[20]。維生素D有降血脂作用，且25(OH)D與TG之間存在線性負相關[21]，維生素D與IR、體脂密切相關[22-23]。由此可推測，維生素D與糖尿病、OP發(fā)生發(fā)展密切相關。本研究結果示，與NC組比較，A、B、C組FBG、HbA1c、HOMA-IR、LDL-C水平均顯著升高，而HDL-C明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與A組比較，B、C組HbA1c、HOMA-IR均顯著升高(P<0.05)，而FBG、LDL-C、HDL-C組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；C組25(OH)D水平顯著低于NC組、A組及B組；B組低于NC組及A組；A組低于NC組，4組間25(OH)D水平呈現逐漸下降趨勢，即 C組

本研究結果提示，外周血中Runx2 mRNA表達及25(OH)D參與了糖尿病、OP的發(fā)生發(fā)展，可能機制是外周血中Runx2 mRNA表達減少，維生素復合物形成減少，血漿中25(OH)D減少，維生素D的生物學效應降低，從而引起糖、脂、骨代謝紊亂，導致糖尿病、OP的發(fā)生發(fā)展。反過來，糖尿病、OP的發(fā)生發(fā)展，促使血漿中25(OH)D水平進一步減低，這就形成了一個惡性循環(huán)。因此，積極補充維生素D可能會打破這一惡性循環(huán)，可能也會改善外周血中Runx2 mRNA的表達，對T2DM、OP的防治具有非常重要的作用，但其具體機制有待進一步研究探索。