脈絡(luò)膜新生血管基因工程小鼠模型研究

徐曉瑋，黎 彪，邵 毅

0引言

脈絡(luò)膜新生血管形成(choroidal neovascularization，CNV)是許多影響視力的眼部疾病的主要病理特征，同時(shí)還與視網(wǎng)膜新生血管形成及二者吻合具有密切關(guān)系。CNV動(dòng)物模型的發(fā)展有助于理解這些病癥的生物學(xué)特性，也可以用于測(cè)試新療法和發(fā)展新技術(shù)。雖然這些模型概括了CNV在人類中的許多臨床表現(xiàn)，但發(fā)展的時(shí)間、病程進(jìn)展、病變的大小和外觀在不同的模型中各不相同。通常有三種動(dòng)物模型CNV：激光誘導(dǎo)型、手術(shù)誘導(dǎo)模型和基因工程動(dòng)物。對(duì)于前兩者的研究已經(jīng)較為透徹，近年來(lái)隨著基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，研發(fā)出多種不同基因工程動(dòng)物模型。本綜述主要對(duì)幾種技術(shù)成熟、應(yīng)用最為廣泛的基因工程動(dòng)物模型CNV進(jìn)行介紹。

1 CNV發(fā)病機(jī)制

CNV存在于許多脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病[1]，例如年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)、糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)、病理性高度近視和早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity，ROP)等[2]。理解CNV的病理生物學(xué)對(duì)于開(kāi)發(fā)適合的動(dòng)物模型非常重要。CNV代表對(duì)特定刺激的非特異性反應(yīng)[3]。CNV的動(dòng)態(tài)過(guò)程(起始、維持和退化階段)與血管生成、炎癥的動(dòng)態(tài)過(guò)程和蛋白水解有關(guān)[4]。CNV的發(fā)展始于Bruch膜的破裂或缺陷，這可能繼發(fā)于創(chuàng)傷性損傷[5]、退行性病變[6]、組織牽引[7]和(或)炎癥[8]。CNV發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵包括巨噬細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮巨噬細(xì)胞，它們表達(dá)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)在該過(guò)程中起重要作用[9]。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelium, RPE)是脈絡(luò)膜新生血管形成過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用部位，它表達(dá)VEGF、單核細(xì)胞趨化蛋白(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)和白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8)，調(diào)節(jié)單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞募集[10]。VEGF是CNV中血管生成的主要引發(fā)劑[4]。由VEGF和血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor，PDGF)介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和包繞細(xì)胞外基質(zhì)的周細(xì)胞覆蓋對(duì)于CNV形成是必需的[11]。CNV中涉及幾種炎癥因子系統(tǒng)，包括補(bǔ)體系統(tǒng)、細(xì)胞因子和趨化因子[12]。纖維蛋白充當(dāng)CNV生長(zhǎng)的支架[13]，纖維蛋白由循環(huán)纖維蛋白原從組織因子(tissue factor，TF)轉(zhuǎn)化而來(lái)。TF細(xì)胞受體是促進(jìn)凝血酶和纖維蛋白兩者的絲氨酸蛋白酶的共活化劑。TF也參與炎癥、VEGF分泌和細(xì)胞黏附[14]過(guò)程，需要注意的是：脈絡(luò)膜新生血管可穿過(guò)Bruch膜破口，在視網(wǎng)膜下形成異常新生血管，且二者可以相互吻合[15]。

除了概括人類CNV的病理生物學(xué)之外，CNV的動(dòng)物模型最好能夠具備在一定時(shí)間內(nèi)有效且可重復(fù)，穩(wěn)定且可持續(xù)，表現(xiàn)出類似人類CNV的包括生長(zhǎng)模式在內(nèi)的病理學(xué)特點(diǎn)[3]，生產(chǎn)便宜并能夠在體內(nèi)使用包括熒光素血管造影術(shù)(fluorescein angiography，F(xiàn)FA)和光相干斷層掃描術(shù)(optical coherence tomography，OCT)的成像技術(shù)。以下主要介紹CNV基因工程小鼠模型，總結(jié)不同基因工程小鼠CNV模型的相關(guān)特征，并給出具體的例子，包括它們的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。這些模型可以通過(guò)引入細(xì)胞因子、年齡、飲食和其他因素進(jìn)行修改。

2 CNV基因工程小鼠模型及其特征

2.1 VEGF164RPE65轉(zhuǎn)基因小鼠雖然有幾種ARMD的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，但只有相對(duì)較少的模型自發(fā)形成CNV。很明顯，視網(wǎng)膜VEGF或RPE過(guò)度表達(dá)不足以在這些模型中引起CNV，并且受損的Bruch膜在CNV發(fā)展中具有關(guān)鍵作用。該模型的優(yōu)點(diǎn)是能夠通過(guò)比較對(duì)照和雜交育種實(shí)驗(yàn)來(lái)研究CNV的各種生物組分。缺點(diǎn)是CNV發(fā)展的時(shí)長(zhǎng)相對(duì)較長(zhǎng)，發(fā)生CNV眼睛的比例相對(duì)較小和CNV面積小。該模型支持CNV的最佳模型是引入Bruch膜物理破壞的概念[16]。Schwesinger等[17]描述了一種轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)由RPE65啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的VEGF。所有的小鼠都形成了組織學(xué)上鑒定的脈絡(luò)膜內(nèi)血管異常，未突破Bruch膜，被描述為脈絡(luò)膜新生血管樣改變(intrachoroidal neovascularization)，但最終未形成CNV。一些研究者認(rèn)為該模型中的脈絡(luò)膜血管異常代表發(fā)育(血管發(fā)生)改變，而不是新生血管形成。

2.2 Tet/VMD2/VEGF和Tet/VMD2/VEGF/Ang2多重轉(zhuǎn)基因小鼠在一組實(shí)驗(yàn)中，Oshima等[18]研究了雙重(Tet/VMD2/VEGF)和三重(Tet/VMD2/VEGF/Ang2)轉(zhuǎn)基因小鼠。RPE中VEGF表達(dá)增加的成年小鼠具有正常的視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜，并且不發(fā)生CNV。然而，視網(wǎng)膜下注射含有Ang2序列的腺病毒載體導(dǎo)致100%的Tet/VMD2/VEGF小鼠中產(chǎn)生組織學(xué)鑒定的CNV，而Tet/VMD2/VEGF/Ang2三重轉(zhuǎn)基因小鼠不自發(fā)產(chǎn)生CNV。研究人員使用免疫組化和熒光素葡聚糖灌注平臺(tái)來(lái)證明CNV的存在和大小。該模型提供了VEGF過(guò)度表達(dá)不足以發(fā)展CNV的重要信息；必須有Bruch膜水平的機(jī)械損傷和/或其他因素來(lái)誘導(dǎo)CNV。在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中外源性施用四環(huán)素或多西環(huán)素可抑制目的基因的表達(dá)從而影響CNV的發(fā)生。需要注意的一點(diǎn)是，應(yīng)該仔細(xì)評(píng)估多西環(huán)素下調(diào)CNV的動(dòng)物模型。

2.3 Ccr2/Ccl2缺陷小鼠由Ambati等[19]研發(fā)的ARMD的Ccr2/Ccl2缺陷小鼠模型已經(jīng)受到關(guān)注。在該模型中，Ccl2或Ccr2缺陷的轉(zhuǎn)基因小鼠不能將巨噬細(xì)胞募集到RPE和Bruch膜的區(qū)域，導(dǎo)致C5a和IgG的積累，二者均誘導(dǎo)VEGF產(chǎn)生。這些轉(zhuǎn)基因小鼠的組織學(xué)、免疫熒光和超微結(jié)構(gòu)(電鏡)檢查顯示，大約25%的小鼠產(chǎn)生了顯微鏡下可見(jiàn)的CNV。這些發(fā)現(xiàn)有助于理解CNV的病理生物學(xué)，特別是巨噬細(xì)胞募集。雖然CNV的面積非常小，但最近的研究表明CCR3在這些缺陷小鼠CNV內(nèi)皮細(xì)胞中特異性表達(dá)。CCR3靶向量子點(diǎn)的體內(nèi)成像定位了不能通過(guò)傳統(tǒng)FFA發(fā)現(xiàn)的CNV[20]。這是CNV動(dòng)物模型如何轉(zhuǎn)化為成像和治療人類CNV的一個(gè)很好的例子。

2.4 ApoE過(guò)表達(dá)小鼠Dithmar等[21]證實(shí)了高膽固醇血癥小鼠中Bruch膜和RPE區(qū)域中的ARMD樣改變。Malek等[22]對(duì)ApoE4過(guò)度表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠飼喂高脂肪膽固醇飲食，在65～127wk時(shí)除了觀察到玻璃疣樣和基底層狀樣沉積之外，還發(fā)展出CNV。并通過(guò)熒光素血管造影、組織學(xué)、免疫組織化學(xué)和電子顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)19%的雄性和18%的雌性小鼠發(fā)生CNV。該模型是研究ARMD樣病變中自發(fā)性CNV形成機(jī)制的重要模型。

2.5 Ccl2/Cx3cr1缺陷小鼠Chan等[23]研發(fā)了一種Ccl2/Cx3cr1缺陷雙敲除(deficient double knockout，DKE)轉(zhuǎn)基因小鼠，在RPE中N-亞視黃基-N-視黃基乙醇胺(N-retinylidene-N-retinylethanomalmine，A2E)水平升高，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋-29(endoplasmic reticulum protein-29，ERp29)水平降低。這些小鼠飼喂低ω-3多不飽和脂肪酸(omega-3 polyunsaturated fatty acids，PUFAs)飲食時(shí)，出現(xiàn)了眼底和組織學(xué)超微結(jié)構(gòu)可見(jiàn)的RPE變化和玻璃膜疣樣病變。該小鼠中的損傷在6wk內(nèi)發(fā)生，在轉(zhuǎn)基因小鼠中時(shí)間跨度短，因此成為轉(zhuǎn)基因小鼠自發(fā)性新生血管形成中具有潛在吸引力的模型。

2.6 SOD1-/-老化小鼠Imamura等[24]研究了Cu-Zn-超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD1)缺陷小鼠的視網(wǎng)膜、RPE、Bruch膜和脈絡(luò)膜區(qū)域的眼底、FA、組織學(xué)、超微結(jié)構(gòu)和免疫組織化學(xué)特征發(fā)現(xiàn)，這些SOD1-/-老化小鼠分別有8.3%和10%存在CNV的眼底和組織學(xué)證據(jù)。在老化SOD1-/-小鼠的RPE中檢測(cè)到氧化損傷DNA的標(biāo)志物8-羥基-2’-2-脫氧鳥(niǎo)苷(I-OHdG)，但在對(duì)照中未檢測(cè)到。相對(duì)于12月齡的小鼠而言，16月齡小鼠的視網(wǎng)膜血管與脈絡(luò)膜下新生血管相吻合。

2.7 Vldlr-/-定向突變小鼠該小鼠為針對(duì)極低密度脂蛋白受體基因(VldlrTm1Her)的靶向突變的純合子小鼠。3mo后小鼠在視網(wǎng)膜外叢狀層和脈絡(luò)膜吻合區(qū)域形成新的血管[25]。如后文提及的自發(fā)性16號(hào)染色體Bst突變小鼠一樣，這些特征似乎與視網(wǎng)膜血管瘤性增生病變(retinal angiomatous hyperplasia，RAP)相似。

2.8視紫紅質(zhì)啟動(dòng)子/VEGF過(guò)度表達(dá)小鼠Okamoto等[26]和Tobe等[27]研發(fā)了視紫紅質(zhì)啟動(dòng)子/VEGF融合基因轉(zhuǎn)基因小鼠。這些小鼠的后代與C57BL/6小鼠雜交發(fā)展成FFA可見(jiàn)的視網(wǎng)膜內(nèi)新生血管形成，延伸到視網(wǎng)膜下。該損傷與RAP相似，表明VEGF在視網(wǎng)膜中的過(guò)度表達(dá)足以引起視網(wǎng)膜內(nèi)和視網(wǎng)膜下新生血管生成。新生血管形成可能起源于動(dòng)物的脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜，從而導(dǎo)致脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜吻合。該小鼠模型可以用于評(píng)估新的CNV治療方法。

2.9自發(fā)性16號(hào)染色體Bst突變小鼠Smith等[28]已經(jīng)深入研究了自發(fā)性16號(hào)染色體Bst基因突變小鼠的眼部組織病理學(xué)。眼底檢查發(fā)現(xiàn)，該小鼠自發(fā)形成了視網(wǎng)膜損傷。自發(fā)性腹部斑點(diǎn)和尾巴(Bst)突變出現(xiàn)在C57BLKS近交系小鼠中。通過(guò)眼底檢查、FFA和組織學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)大約88%的小鼠發(fā)生組織學(xué)上確定的視網(wǎng)膜下新生血管。新生血管形成與RPE異常、視網(wǎng)膜錯(cuò)構(gòu)瘤樣病變以及Bruch膜缺陷引起的視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜新生血管吻合有關(guān)。盡管新生血管形成與年齡有關(guān)，但在這種小鼠中沒(méi)有玻璃疣樣或基底層類沉積樣損傷，因此相比于ARMD中的CNV，新生血管的形成更類似于RAP。

2.10 Cp-/-Heph-/Y敲除小鼠Hahn等[29]證明在轉(zhuǎn)基因小鼠中，鐵質(zhì)過(guò)氧化氫酶和輔助蛋白的破壞導(dǎo)致了鐵的過(guò)量。轉(zhuǎn)基因小鼠的血漿銅藍(lán)蛋白和膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白破壞導(dǎo)致鐵超載引起ARMD樣改變。這些小鼠產(chǎn)生RPE變化和光感受器變性。盡管脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜新生血管生成并不明顯，但小鼠在RPE水平發(fā)生明顯的病變，且100%的小鼠發(fā)生了組織學(xué)上確定的視網(wǎng)膜下新生血管。此外，這些小鼠不像ARMD那樣發(fā)展出玻璃疣狀或基底層狀(類)沉積樣病變。

3總結(jié)與展望

總之，成功的CNV動(dòng)物模型所需的三個(gè)特征：(1)VEGF引起的持續(xù)性血管生成；(2)炎性細(xì)胞因子組分；(3)Bruch膜受損[30]。迄今為止的研究模型表明，VEGF過(guò)度表達(dá)不足以引起CNV的發(fā)展；需要以機(jī)械或生物學(xué)方式造成Bruch膜的損傷以誘導(dǎo)CNV。Bruch膜在人CNV的形成中起中心作用。所有模型都需要Bruch膜受損、VEGF表達(dá)和炎性細(xì)胞因子等因素介導(dǎo)。這也強(qiáng)調(diào)了在CNV形成中起主要作用的因素取決于模型。一些模型具有由視網(wǎng)膜或RPE特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的VEGF過(guò)度表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物過(guò)度表達(dá)VEGF。還有模型強(qiáng)調(diào)了巨噬細(xì)胞募集作用的關(guān)鍵性。利用CNV動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)時(shí)，研究者應(yīng)該了解CNV形成中各種因素(如對(duì)Bruch膜的機(jī)械損傷、VEGF產(chǎn)生、炎性細(xì)胞因子介導(dǎo))的相對(duì)重要性。沒(méi)有絕對(duì)理想的CNV動(dòng)物模型，每種現(xiàn)有基因工程小鼠CNV模型都有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。選擇動(dòng)物模型時(shí)的注意事項(xiàng)與模型的用途有關(guān)。在決定使用哪種動(dòng)物模型的CNV時(shí)，給定的實(shí)驗(yàn)室的能力，包括預(yù)算、動(dòng)物培養(yǎng)設(shè)施和實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)都非常重要。