角膜新生血管的顯影方法

許 多，何宇茜，王瑞卿，李富強(qiáng)，姚博遠(yuǎn)，張 妍

0引言

生理?xiàng)l件下，角膜是不含血管和淋巴的透明介質(zhì)，因此被免疫系統(tǒng)忽略而處于“免疫赦免”的狀態(tài)。但在病理?xiàng)l件下，角膜緣的血管向角膜內(nèi)延伸，角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV)因此形成。目前常見(jiàn)的方法，如激素治療[1]、細(xì)針透熱[2]、光動(dòng)力療法[3]等，只能在一定程度上抑制CNV的生長(zhǎng)，作用時(shí)間短，并伴有副作用，因此對(duì)CNV特異性抑制的治療方法還在不斷探索。CNV會(huì)引起視力下降、視物模糊，甚至失明[4]，在探索藥物療效的研究中，CNV的面積是衡量藥物或者治療方案效果好壞的重要參考，CNV高效清晰的顯影對(duì)研究也有重大價(jià)值。目前針對(duì)CNV的顯影方法有顯影劑造影、免疫組織化學(xué)法、光學(xué)相干斷層成像技術(shù)(optical coherence tomography，OCT)等。本文就CNV的顯影方法進(jìn)行綜述，分析每一種顯影方法的優(yōu)缺點(diǎn)，希望能對(duì)后續(xù)的研究起到一定的參考作用。

1顯影劑造影

用顯影劑對(duì)CNV造影可以實(shí)時(shí)快速地成像，具有操作簡(jiǎn)單、易于觀察等優(yōu)點(diǎn)。造影后的圖像使用熒光顯微鏡技術(shù)進(jìn)行觀察，但是熒光顯微鏡得到的圖像質(zhì)量不高，分辨率較低。隨著技術(shù)的發(fā)展，激光共聚焦技術(shù)[5]顯著地提高了分辨率，并且能對(duì)切片進(jìn)行三維成像。

1.1熒光素鈉熒光素鈉(fluorescein sodium)分子式為C20H12O5，分子量為332D。利用熒光素鈉對(duì)CNV造影是經(jīng)典方法之一[6]，將熒光素鈉注入靜脈，或者從左心室灌注，熒光素鈉隨著血液流入血管，使CNV清晰可見(jiàn)[7]。熒光素鈉被藍(lán)光激發(fā)時(shí)顯示出黃綠色光。由于它不參與機(jī)體代謝，因此該方法具有毒性低、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)在也用于檢查角膜是否破損。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，角膜完好的地方不著色而僅在損傷處染色，但有趣的是，在Bandamwar等[8]研究中發(fā)現(xiàn)，健康內(nèi)皮細(xì)胞也可以被著色，不過(guò)破損或者衰老的細(xì)胞顯示出更強(qiáng)烈的熒光[9]，即“中等強(qiáng)度背景下的超熒光”(hyper-fluorescence)。

1.2吲哚菁綠吲哚菁綠(indocyanine green)的化學(xué)式為C43H47N2NaO6S2，分子量為775D。同樣，吲哚菁綠也能與血漿白蛋白、球蛋白等物質(zhì)結(jié)合，但對(duì)血管的顯示更加精細(xì)，具有輪廓清晰、定位精確等優(yōu)點(diǎn)，目前已應(yīng)用于臨床，因?yàn)樗梢栽鰪?qiáng)眼內(nèi)結(jié)構(gòu)層次的對(duì)比度，從而使手術(shù)更加方便。在實(shí)際操作的時(shí)候，可以將吲哚菁綠和熒光素鈉混合進(jìn)行染色[2,10]。不過(guò)以上兩種染色方式均為侵入性檢查，需要在靜脈中注射造影劑才能顯影，也會(huì)在一定程度上損傷眼組織。有文獻(xiàn)報(bào)道，吲哚菁綠對(duì)視網(wǎng)膜有潛在的毒性，并且滲漏的造影劑也會(huì)降低顯影效果，影響最終結(jié)果的評(píng)估。

1.3伊文氏藍(lán)伊文氏藍(lán)(Evans blue)是一種偶氮染料[11]，分子量為960.8D，化學(xué)分子式為C34H24N6Na4O14S4，能不可逆地結(jié)合血漿白蛋白，形成復(fù)合物。而血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上有血漿白蛋白受體，其與血漿白蛋白親和力較強(qiáng)，因此可以通過(guò)灌注方法顯示血管形態(tài)。復(fù)合物在白光下呈藍(lán)色，在熒光顯微鏡綠光下呈鮮紅色，靈敏度很高，不易淬滅，易于長(zhǎng)期保存，但該方法不能復(fù)染[12]。

2光學(xué)相干斷層成像技術(shù)

裂隙燈觀察CNV是一種常見(jiàn)的、十分簡(jiǎn)便的方法，能夠?qū)铙wCNV的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行初步觀察和粗略判斷，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建模期間可以經(jīng)常使用這種方法以觀察角膜的各個(gè)部位。但涉及精細(xì)觀察和準(zhǔn)確判斷時(shí)，不得不提到OCT[13]。角膜是無(wú)色透明介質(zhì)，利用相干光進(jìn)行檢測(cè)，光線容易進(jìn)入角膜。在眼科應(yīng)用該技術(shù)，可為我們提供有價(jià)值的信息。其最大的優(yōu)點(diǎn)在于能夠快速、非侵入式[14]地評(píng)估CNV，還可以獲得血流量、血管面積等重要數(shù)據(jù)。相比熒光素染色，這種無(wú)需使用造影劑的方法簡(jiǎn)單快捷、分辨率高、診斷精確，還能無(wú)創(chuàng)傷地追蹤觀察。OTC技術(shù)于1991年被提出[15]，對(duì)眼科診斷有著革命性的促進(jìn)作用，在未來(lái)有很大發(fā)展空間。

3墨汁灌注

大鼠在深麻醉狀況下，向左心室或主動(dòng)脈注入生理鹽水使得CNV褪色[16]，再注入明膠-印度墨汁-生理鹽水混合成的色膠灌注新生血管[17-18]，并用液氮迅速冷卻眼球或放入冰箱冷凍，分離角膜后在其周?chē)銮锌谑菇悄ぷ兤剑朔椒芊浅Ｖ庇^地顯示出血管輪廓，可用圖像分析軟件對(duì)血管的面積進(jìn)行測(cè)量，從而獲得精確的數(shù)據(jù)。從最開(kāi)始易于褪色的單純墨汁染色到現(xiàn)在加入明膠固定，該方法經(jīng)過(guò)多年改進(jìn)日趨完善，有價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)。但是其顯影效果受到灌注方法、溫度、壓強(qiáng)等因素影響，并且一些細(xì)小的血管可能沒(méi)有灌注完全，適用于批量處理死亡的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

4免疫組織化學(xué)染色

雖然HE染色方法在過(guò)去幾十年里得到了廣泛的應(yīng)用，能在一定程度上對(duì)CNV進(jìn)行基礎(chǔ)的觀察，但是難以滿足對(duì)研究的精細(xì)測(cè)量需求。而免疫組織化學(xué)染色具有高靈敏度、強(qiáng)特異性和準(zhǔn)確定位的優(yōu)勢(shì)，能對(duì)CNV情況進(jìn)行定性定量的觀察。目前，顯示血管內(nèi)皮細(xì)胞的抗體種類(lèi)繁多[19]，較為常用的主要抗體有CD31、CD34、Ⅷ因子等，然而它們并未完全顯示所有微血管，并且在不同文獻(xiàn)中報(bào)道的標(biāo)記范圍和標(biāo)記效應(yīng)存在差異[20-22]。

4.1血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)能夠刺激血管的增生，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生成，并在CNV內(nèi)皮細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)。已經(jīng)有研究表明[23-25]，VEGF在CNV中可以被免疫組織化學(xué)染色法檢查出來(lái)，可見(jiàn)血管的管腔樣結(jié)構(gòu)，陽(yáng)性組織中可見(jiàn)棕黃色顆粒，但部分炎性細(xì)胞也呈陽(yáng)性。

4.2 CD31微血管的標(biāo)記和血管密度的測(cè)量也可利用CD31進(jìn)行顯影[26]。CD31是血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子，它可以在新生成的以及正常組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，是常見(jiàn)的標(biāo)記物。血管內(nèi)皮出現(xiàn)棕色顆粒作為陽(yáng)性染色標(biāo)準(zhǔn)。與Ⅷ因子比較，其能更清楚地顯示微小的新生血管[27-28]。但是CD31特異性并不是很高，也會(huì)對(duì)組織中的基質(zhì)細(xì)胞等染色，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4.3 CD34CD34是由糖蛋白組成的抗原，在多種細(xì)胞表面均可表達(dá)，包括基質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。它不僅在微血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，而且在正常血管甚至大血管中表達(dá)。因此抗CD34染色能較為理想地顯示微小的、新生的、不成熟的血管和原先存在的大血管[29]。CD34是內(nèi)皮細(xì)胞分化的高度敏感性標(biāo)志物，抗CD34對(duì)新生內(nèi)皮染色較正常內(nèi)皮細(xì)胞更深。CD34具有背景染色清晰、輪廓明顯、對(duì)比度高等優(yōu)點(diǎn)，其被認(rèn)為是重復(fù)性最理想的內(nèi)皮標(biāo)記物[30]。

4.4 CD105CD105相比于CD34和CD31，其更為穩(wěn)定，也有更高的特異性，但CD34和CD31對(duì)正常微血管系統(tǒng)染色效果較好[31]。CD105對(duì)成熟血管具有弱親和力，通常低表達(dá)或無(wú)表達(dá)，但在增殖的內(nèi)皮細(xì)胞中高度表達(dá)。因此，它被認(rèn)為是血管生成的可靠標(biāo)志物[32]。研究表明，CD105是染色新生血管的理想選擇，但不適用于正常的微血管反應(yīng)[33]。

4.5 Ⅷ因子Ⅷ因子是一種正常組織血管內(nèi)皮細(xì)胞中非常重要的凝血蛋白，參與體內(nèi)血液凝固，常用來(lái)標(biāo)記新生的血管內(nèi)皮[34-35]。Jason等研究中發(fā)現(xiàn)，CNV內(nèi)皮細(xì)胞能產(chǎn)生Ⅷ因子，并且染色效果良好[36-37]。

4.6 Weibel-Palade小體Weibel-Palade小體(Weibel-Palade body，WPB)是內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞器，對(duì)正常止血和炎癥反應(yīng)至關(guān)重要。它的主要成分蛋白是血管性血友病因子[38](Von Willebrand，vWF)，vWF是一種多聚體蛋白，能參與凝血，在內(nèi)皮細(xì)胞、血小板和巨核細(xì)胞中表達(dá)。

4.7 JG-12染色JG-12僅由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成，是一種小鼠抗大鼠氨肽酶P的單克隆抗體，能高效地檢測(cè)和定位血管內(nèi)皮[39-41]，從而特異性標(biāo)記CNV，毛細(xì)血管內(nèi)皮胞漿內(nèi)可見(jiàn)棕黃色顆粒。

4.8 Ki67Ki67是一種核內(nèi)蛋白質(zhì)，與細(xì)胞有絲分裂關(guān)系密切，在除G0期外的細(xì)胞周期所有階段均有表達(dá)，現(xiàn)在已經(jīng)成為一種被廣泛使用的增殖標(biāo)記，因此可以使用Ki67免疫組織化學(xué)來(lái)檢測(cè)CNV內(nèi)皮細(xì)胞增殖情況[42-43]，在陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞核中可見(jiàn)棕黃色顆粒。

4.9巢蛋白巢蛋白(nestin)定位于細(xì)胞質(zhì)，是一種中間絲蛋白，參與細(xì)胞骨架重構(gòu)[44-45]。組織成熟時(shí)，巢蛋白的表達(dá)被終止。因此巢蛋白能表達(dá)于新生的以及不成熟的小血管。對(duì)于CNV的顯影，因?yàn)榭钩驳鞍椎目贵w能特異性識(shí)別，所以使用巢蛋白抗體標(biāo)記也是不錯(cuò)的選擇。

5展望

CNV顯影的方法很多，其精細(xì)程度也不同。粗略觀察可以使用裂隙燈、HE染色等方法，而精細(xì)觀察可以選擇免疫熒光染色或者光學(xué)相干斷層掃描血管造影。相信隨著科技的發(fā)展，顯影方法也會(huì)不斷進(jìn)步，敏感性更好、特異性更高的標(biāo)志物也會(huì)不斷被發(fā)現(xiàn)，OCT的分辨率和穿透力也會(huì)得到進(jìn)一步的提升。目前還沒(méi)有能全面顯示所有CNV的特異性標(biāo)志物，本文所列舉的方法大多也同樣適用于其它新生血管。是否存在能夠特異性識(shí)別CNV的內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物，各種染色方法聯(lián)合應(yīng)用效果如何，怎樣才能讓CNV盡可能多地顯影，這些問(wèn)題值得進(jìn)一步的研究。