上皮間充質(zhì)轉化在后囊膜下混濁中的研究進展

于 童，王 靜,2，張勁松,2

0引言

上皮間充質(zhì)轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指上皮細胞通過某些特定的程序轉化為具有間質(zhì)表型細胞的生物學過程。其在胚胎發(fā)育、多種纖維化疾病以及癌癥轉移中均發(fā)揮了重要的作用。1982年Greenburg等[1]通過將晶狀體上皮細胞在膠原凝膠中培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，上皮細胞具有了間質(zhì)細胞的形態(tài)，由此提出了EMT的概念。后發(fā)性白內(nèi)障(posterior capsular opacification, PCO)是白內(nèi)障術后影響視覺質(zhì)量的主要原因之一，其發(fā)生率在兒童高達100%。與后發(fā)性白內(nèi)障形成有關的因素有許多，如手術術式的選擇、植入IOL的材料、晶狀體上皮細胞的生物活性等。后發(fā)性白內(nèi)障形成的原理主要是在白內(nèi)障術后，由術中造成的手術切口引起了炎性反應導致房水中各種炎性因子釋放，從而刺激囊膜下殘留的晶狀體上皮細胞，使其發(fā)生增殖、遷移、轉化等一系列生物學行為，最終導致后囊膜的混濁。YAG激光后囊切開術雖可有效地治療后發(fā)性白內(nèi)障，但其導致的多種并發(fā)癥例如眼內(nèi)炎、視網(wǎng)膜脫離、IOL偏位等仍一定程度地影響著患者的生活視覺質(zhì)量[2]。因此，探索后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)生機制從而預防后發(fā)性白內(nèi)障的產(chǎn)生并減少YAG激光后囊切開術的使用成為了研究熱點之一。

1 EMT所致PCO的相關信號通路

TGF-β/Smad通路是EMT的經(jīng)典通路。Smad2和Smad3在PCO的發(fā)生過程中共同發(fā)揮作用。其中Smad2介導EMT的發(fā)生并增加細胞的遷移能力，而Smad3主要參與誘導細胞凋亡和細胞外基質(zhì)的積聚[3]。 ERK1/2信號在TGF-β2誘導的HLECs的EMT中被激活，且獨立于TGF-β/Smad信號通路而存在，ERK1/2信號通路與經(jīng)典的TGF-β/Smad和Jagged/Notch信號通路交互作用，從而在LECs中介導EMT[4]。研究者通過mTOR抑制劑雷帕霉素處理LECs，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素可以顯著抑制LECs發(fā)生EMT[5]。通過采用特異性抑制靶點的shRNA獲得mTOR低表達的HLECs得到了相同的實驗結果：細胞增殖減慢、周期延長，與EMT進程相反，從而發(fā)現(xiàn)mTOR通路也是介導細胞發(fā)生EMT的重要通路之一[6-7]。此外，研究表明，在TGF-β誘導的EMT中，b-catenin/CBP依賴型信號通路參與調(diào)控fascin、MMP-9和a-SMA的表達[8]。Wnt3a、Wnts5a、5b、7b、8a、8b也參與誘導HLECs的EMT、遷移和增殖[9-10]。 TGF-β2還可通過PI3K/Akt信號通路誘導LECs上皮間質(zhì)轉化[11]。

2 EMT所致PCO的相關細胞因子

TGF-β2可以成功誘導LECs發(fā)生EMT，且TGF-β2處理的LECs可以作為EMT的細胞模型[12]。已有研究證實，細胞骨架蛋白中的Tpm家族在調(diào)節(jié)和穩(wěn)定肌動蛋白微絲(F-actin)中起作用，在EMT發(fā)生的肌動蛋白細胞骨架重構過程中，Tpm1/2表達上調(diào)。Kubo等[13]在對鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，TGF-β2引起的應力纖維的形成和αSMA的上調(diào)可以通過siRNA介導的Tpm1/2抑制逆轉，而TGF-β2誘發(fā)的Tpm1/2的表達和應力纖維的形成可被FGF2逆轉。此外，F(xiàn)GF2可通過活化絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)通路，使TGF-β處理的LECs受到干擾，隨后增強EMT。相反，MEK抑制劑(PD98059)減少了FGF2介導的Tpm1/2和αSMA下調(diào)。但在TGF-β和FGF聯(lián)合作用的刺激下，LECs遷移能力增強。TGF-β2和FGF2在EMT的差異調(diào)控中存在獨立和組合作用。研究表明,EGF可激活Myc。Myc的過表達通過增加HDAC3抑制miR-26b，進而誘導EZH2的表達，促進HLECs中EMT的進展[14]。此外，骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(BMP-7)可在大鼠晶狀體上皮細胞中抑制TGF-β2誘導的EMT[15]。

結締組織生長因子(CTGF)在LECs的表達主要位于細胞漿，其作為TGF-β2的下游分子，在TGF-β2誘導的HLECs的EMT過程中發(fā)揮重要的作用[16]。它通過激活ERK信號通路促進HLECs的增殖、遷移、EMT的特異性蛋白表達和ECM合成來促進PCO的發(fā)展。阻斷CTGF可在大鼠體內(nèi)有效抑制PCO[17]。此外，白介素-6(IL-6)可以促進HLECs中Fn、COL-1、TGF-β2、p-JAK2 p-STAT3的表達[18]。

3 EMT所致PCO發(fā)生的表觀遺傳學調(diào)控

3.1非編碼RNA與EMT所致PCO已有文獻報道，TGF-β2誘導的EMT中，有775個lncRNA和935個mRNA存在表達差異。其中有325個lncRNA上調(diào)，450個lncRNA下調(diào)。329個mRNA上調(diào)，606個mRNA下調(diào)[19]。在TGF-β2作用下，miR-26b的表達減少。且miR-26b可以通過直接沉默Smad4和COX-2來抑制LECs的增殖、遷移和EMT，從而抑制PCO的發(fā)生[20]。miR-181a則通過直接沉默c-Met、Slug和COX-2的方式抑制EMT[21]。而miR-486-5p和miR-204-5p分別通過下調(diào)Smad2和Smad4的表達對EMT起抑制作用[22-23]。lncRNA對EMT誘導的PCO的影響還有待研究。在對兔進行的研究中表明，核因子Kappa B(NF-κB)小干擾(si)RNA可以有效抑制細胞培養(yǎng)和囊袋模型的LECs的遷移和增殖。在家兔進行白內(nèi)障手術后，通過該治療手段也有效地減少了PCO的形成，且對眼部其他組織無毒性[24]。整合素連接激酶(ILK)也可以與NF-κB相互作用介導HELCs的EMT[25]。以snailsiRNA為靶點也可抑制TGF-β2誘發(fā)的EMT[26]。

3.2組蛋白去乙酰化與EMT所致PCO組蛋白去乙?；?HDAC)是一個大的酶家族，其主要功能是去除組蛋白N端賴氨酸殘基的乙?；偈谷旧|(zhì)變得致密，抑制基因轉錄，與細胞周期調(diào)控和增殖分化密切相關。研究發(fā)現(xiàn)第Ⅰ類和Ⅱ類HDAC在TGF-β2誘導的EMT中上調(diào)。HDAC抑制劑曲古抑菌素A(TSA)可通過細胞周期阻滯、PI3K/Akt、p38MAPK、ERK1/2通路失活以及對TGF-β/Smad2和Jagged/Notch信號通路的封鎖抑制細胞增殖[27]。HDAC抑制劑在豬的LECs中增強了組蛋白3和4的乙酰化作用。TSA和SAHA可阻止晶狀體外植體EMT的發(fā)生[28]。TSA通過表觀遺傳學調(diào)控降低組蛋白H4乙?；絹韼椭种艵MT[29]。因此，表觀遺傳修飾因子是白內(nèi)障術后PCO治療和預防的潛在靶點。

3.3其他

3.3.1缺氧誘導因子-1缺氧誘導因子-1(HIF-1)是一種具有轉錄活性的核蛋白，由HIF-1α和HIF-1β兩個亞單位組成。其中HIF-1α是TGF-β2誘發(fā)的LECs發(fā)生EMT過程的重要因子之一。在TGF-β2處理人晶狀體上皮細胞后HIF-1α和血管內(nèi)皮生長因子A(VEGF-A)水平升高，當用 HIF-1α轉化抑制劑KC7F2處理細胞時則顯著抑制了TGF-β2誘發(fā)的EMT，該過程伴隨ERK磷酸化的減少和Snail和Slug水平下調(diào)[30]。Notch1/Snail1/E-鈣黏蛋白通路在細胞缺氧的情況下也通過HIF-1α促進細胞EMT的發(fā)生[31]。研究發(fā)現(xiàn)維生素C可通過增加野生型HIF-1α的脯氨酸羥化、降低HIF-1α的活性，從而抑制HLECs的遷移、增殖和EMT轉錄因子TWIST的表達[32]。

3.3.2晚期糖基化終末產(chǎn)物晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGE)是蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或核酸等大分子在沒有酶參與的條件下，自發(fā)地與葡萄糖或其他還原單糖反應所生成穩(wěn)定的共價加成物。AGE促進TGF-β2誘導的EMT，且基膜(BM)中的AGE可能與年齡及糖尿病相關的纖維化關系密切。AGE與其受體的相互作用在TGF-β2介導的EMT中發(fā)揮著重要作用，阻止AGE受體(RAGE)可抑制EMT發(fā)生[33-34]。因此，AGE可作為預防PCO和其他年齡相關性纖維化的潛在方案。

3.3.3基質(zhì)金屬蛋白酶基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)是前囊下白內(nèi)障(ASC)形成的上游信號。明膠酶和特異性的MMP-9在TGF-β誘導的ASC形成中起重要作用[35]。MMP抑制劑GM6001、MMP-2/9抑制劑Ⅰ和Ⅱ均可有效抑制體外培養(yǎng)的LECs的移行，而且對細胞無明顯的毒性作用，細胞仍可保持生長活性。其中MMP-2/9抑制劑Ⅱ的抑制作用最強[36]。蛋白酶體抑制劑MG132能強有效地抑制HLECs增殖、移行和分化，且蛋白酶體抑制不通過TGF-β2、FGF2和HGF, 而在一定程度上由p21和p27蛋白所介導[37-38]。此外，研究表明蛋白酶體抑制通過下調(diào)MMP-2和MMP-9的活性減少了LECs的遷移，同時也降低了其他可能導致PCO的影響因素[39]。

3.3.4其他已有文獻報道，醛醣還原酶、玻璃體結合蛋白和纖連蛋白參與促進PCO的發(fā)生發(fā)展[40-42]。Dickkopf-1(Dkk1)通過抑制Wnt/b-catenin信號通路抑制wnt3a誘導的EMT和LECs的遷移[43]。TN64通過Wnt和FAK信號通路抑制EMT[44]。此外，基質(zhì)細胞相互作用的調(diào)節(jié)因子SPARC[45]、環(huán)氧合酶-2(COX-2)[46]、aV 整合素[47]也與LECs的EMT有關。高濃度的葡萄糖可以誘導HLECs上調(diào)KLF6基因的表達，并伴隨下游一系列與EMT密切相關基因TGFBl、TGFBRl、COLIAl、HSP47轉錄表達的上調(diào)[48]。某些物理因素如電場暴露也可能是白內(nèi)障術后LECs發(fā)生EMT的重要影響因素。其部分可能通過激活整合素β1-FAK信號通路而發(fā)揮作用[49]。通過crispr-cas9系統(tǒng)對小鼠進行Tpm2雜合敲除的研究中發(fā)現(xiàn)，PCO過程中Tpm2表達升高[50]。且在鼠和人的LECs中，Tpm1a和Tpm2b蛋白促進了EMT[51]。此外，抑制Bit1的表達可抑制LECs的增殖、遷移和EMT的發(fā)生[52]。而Smac基因可抑制HLECs的增生并促進細胞的凋亡[53]。沉默EDIL3可通過Smad和非Smad通路抑制LECs的增殖、遷移和EMT，因此EDIL3也是潛在的預防PCO的靶點[54]。

4 EMT所致PCO的預防

在疏水性丙烯酸酯(Acrysof SA60AT) IOL、硅凝膠(Crystalens) IOL、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)IOL這三種常用材料的IOL中，疏水性丙烯酸酯的囊膜生物相容性最佳[55]。通過體外實驗將細胞黏附分子(RGD肽)接種到傳統(tǒng)的親水丙烯材料上發(fā)現(xiàn)這種表面功能化的IOL提高了LECs的附著力，且在形態(tài)學及表達EMT生物標志物方面與疏水IOL材料相類似[56]。Amoozgar等[57]以磺胺嘧啶為原料，通過ATR-FTIR、XPS、TOF-SIMS等方法對PDMS晶狀體進行表面改性，發(fā)現(xiàn)磺胺嘧啶修飾的表面產(chǎn)生的EMT特異性標志物的水平降低。首次證明了抗生素具有MMP抑制作用。這兩種方法均為預防術后PCO提供了新的思路。 氯化鋰(LiCl)是LECs表型的有效穩(wěn)定劑，可有效阻止α-SMA的積聚并維持細胞極性[58]。穿心蓮內(nèi)酯可通過調(diào)節(jié)EMT標志物和抑制LECs的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路來維持LECs的特性[59]。此外，燈盞花素[60]和Src-家族酪氨酸激酶(SFK)抑制劑PP1[61]也能夠抑制PCO。

5 小結

目前，EMT在PCO中的研究大多數(shù)集中于細胞及動物實驗，且機制錯綜復雜,有待進一步的探究。明確EMT發(fā)生發(fā)展過程的具體分子機制，對靶向治療和預防PCO至關重要,也從新的角度為預防PCO提供了思路。