高溫環(huán)境對(duì)犬機(jī)體影響的分子機(jī)制研究進(jìn)展

李 強(qiáng)，熊 前，楊前勇，王春亮，余 盼，吳 衍

(公安部南昌警犬基地 江西省警犬良種繁育與行為科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330100)

熱應(yīng)激主要是指動(dòng)物機(jī)體為應(yīng)對(duì)在高溫環(huán)境下熱平衡被破壞，導(dǎo)致散熱受阻所引起的非特異性應(yīng)答反應(yīng)[1]，會(huì)嚴(yán)重影響新陳代謝，持續(xù)的熱應(yīng)激會(huì)對(duì)機(jī)體造產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷甚至死亡。犬全身幾乎無(wú)汗腺，不能通過汗液散熱，在我國(guó)南方夏季高溫高濕的環(huán)境極易產(chǎn)生熱應(yīng)激，從而對(duì)生理機(jī)能產(chǎn)生非常不利的影響，同時(shí)也極大制約了犬在夏季高溫高濕環(huán)境下的使用。為緩解高溫環(huán)境下犬產(chǎn)生的熱應(yīng)激，常采用通風(fēng)、補(bǔ)水等物理方法降溫或者服用緩解中暑藥物等[2]。然而，機(jī)體體溫調(diào)節(jié)以及維持生理代謝正常都是一個(gè)復(fù)雜的連續(xù)過程，因此有必要在分子水平來(lái)分析高溫環(huán)境對(duì)犬機(jī)體的作用機(jī)制和影響，為進(jìn)一步應(yīng)對(duì)高溫環(huán)境對(duì)犬的影響提供依據(jù)。

1 熱應(yīng)激對(duì)機(jī)體的影響

犬在溫度超過25℃的環(huán)境中就會(huì)出現(xiàn)熱應(yīng)激反應(yīng)，在溫度超過30℃以上的環(huán)境則會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的熱應(yīng)激綜合癥[3]，所以在南方夏季高溫高濕環(huán)境中熱應(yīng)激是最容易發(fā)生的應(yīng)激反應(yīng)。犬發(fā)生熱應(yīng)激反應(yīng)后，在熱休克因子(Heat shock factors，HSFs)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控下會(huì)合成或增加1類保護(hù)機(jī)體抵抗熱應(yīng)激損傷的蛋白——熱應(yīng)激蛋白(Heat stress proteins，HSPs)。HSPs存在于大部分生物中，在進(jìn)化上具有高度保守性，并且是一個(gè)蛋白質(zhì)家族，根據(jù)分子量大小和功能的不同，可分為許多種蛋白，如 HSP100、HSP90、HSP70、HSP60以及小分子HSP[4]。HSPs具有多種生物學(xué)特性和功能，在機(jī)體眾多生理反應(yīng)和信號(hào)通路中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，應(yīng)激狀態(tài)下機(jī)體內(nèi)的HSPs則會(huì)超表達(dá)，有助于機(jī)體抵抗熱應(yīng)激損傷，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)高溫的耐受性并盡快從熱應(yīng)激損傷中恢復(fù)[5]。

1.1 熱應(yīng)激與活性氧活性氧(Reactive oxygen species，ROS)伴隨著機(jī)體的新陳代謝而產(chǎn)生，是機(jī)體代謝的產(chǎn)物，ROS包括氧自由基和過氧化氫等，線粒體由于是生化反應(yīng)發(fā)生的主要場(chǎng)所而成為ROS的主要來(lái)源[6]。低劑量的ROS對(duì)機(jī)體是有益的，參與了細(xì)胞增殖分裂、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、蛋白激酶活化和免疫自噬等眾多生理過程[7]。在機(jī)體處于熱應(yīng)激時(shí)則會(huì)導(dǎo)致活性氧代謝平衡被打破，機(jī)體累積大量活性氧，而高劑量的ROS會(huì)引起機(jī)體氧化應(yīng)激，氧化損傷核酸，造成蛋白質(zhì)變性失活以及肽鏈斷裂，干擾氨基酸代謝，毒害細(xì)胞；ROS與細(xì)胞膜上的成分發(fā)生反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被損傷，通透性增加，細(xì)胞內(nèi)的酶大量進(jìn)入血液中，發(fā)生間質(zhì)水腫，繼而加重氧化損傷，引起細(xì)胞受損傷亡，造成器官正常功能損傷甚至衰竭[8]。在熱應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生后，機(jī)體同時(shí)迅速合成HSPs互相發(fā)揮協(xié)同作用，HSPs能夠通過調(diào)控氧自由基的代謝來(lái)降低機(jī)體氧自由基的濃度，幫助機(jī)體恢復(fù)活性氧的代謝平衡，也可以使得因熱應(yīng)激而失活的DNA聚合酶β恢復(fù)活力，堿基切除修復(fù)系統(tǒng)得以正常運(yùn)轉(zhuǎn)來(lái)修復(fù)DNA損傷；同時(shí)HSPs能抑制凋亡蛋白酶(Caspases)的活性，也可以通過干擾細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)保證細(xì)胞的存活，使得機(jī)體的生命活動(dòng)得以正常運(yùn)轉(zhuǎn)[9]。相關(guān)研究顯示，HSP27和HSP20在心肌細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)后能夠抑制在影響細(xì)胞存活中發(fā)揮重要作用的半胱天冬蛋白酶活性，此外HSP27能夠參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的穩(wěn)定，從而維持細(xì)胞基本形態(tài)，減少細(xì)胞的凋亡[10，11]。

1.2 熱應(yīng)激與mTOR和JNK相關(guān)報(bào)道顯示，熱應(yīng)激有可能影響生物機(jī)體雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)代謝通路，從而抑制蛋白質(zhì)的折疊修飾以及細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。mTOR作為雷帕霉素靶分子，對(duì)營(yíng)養(yǎng)分子信號(hào)敏感性高，參與調(diào)節(jié)mRNA的翻譯及蛋白質(zhì)的合成代謝，調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)增殖[9]。高溫環(huán)境下動(dòng)物食欲降低，采食量減少，導(dǎo)致機(jī)體能量供應(yīng)不足，激活了腺苷酸活化蛋白激酶(5-AMP activated protein kinase，AMPK)代謝通路，引起mTOR代謝通路發(fā)生一系列變化，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)合成代謝和細(xì)胞生長(zhǎng)增殖。此外，在機(jī)體能量不足時(shí)，HSPs能促使ATP分解為機(jī)體提供能量，AMPK也會(huì)抑制蛋白質(zhì)合成代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)增殖等消耗大量能量的生理代謝[12]。Gaballah M等[13]研究顯示，c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal Kinase，JNK)是一種容易被熱應(yīng)激激活的應(yīng)激蛋白激酶，能夠影響多種轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，對(duì)細(xì)胞生命活動(dòng)具有重大意義。有相關(guān)研究表明，熱應(yīng)激蛋白HSP72作為JNK的抑制劑，可以抑制JNK的磷酸化激活，調(diào)控參與JNK促凋亡的多種蛋白的表達(dá)，減少JNK誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[14]。研究發(fā)現(xiàn)，溫和熱處理機(jī)體后，機(jī)體在短時(shí)間內(nèi)會(huì)超表達(dá)HSP72，HSP72通過作用JNK信號(hào)通路來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)熱應(yīng)激的耐受性，緩解高溫環(huán)境下產(chǎn)生的熱應(yīng)激對(duì)機(jī)體造成的損害[15]。此外，據(jù)相關(guān)分子試驗(yàn)顯示，HSP72在作用細(xì)胞凋亡的初期即可抑制JNK的激活[13]。

1.3 熱應(yīng)激與機(jī)體免疫HSPs具有大分子抗原性，可參與機(jī)體的免疫反應(yīng)，同時(shí)HSPs也能夠作為抗原分子載體，參與加工、遞呈抗原給細(xì)胞，促進(jìn)免疫因子表達(dá)，活化樹突狀細(xì)胞，從而引起機(jī)體非特異性免疫[16]。相關(guān)研究表明，HSP70在外周血中可能參與了機(jī)體的免疫活動(dòng)，抑制TLR-4受體表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)濃度上升[17]。朱騫等[18]分析處于中度熱應(yīng)激狀態(tài)下犬的HSP70在外周單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)和血液中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)HSP70的表達(dá)趨勢(shì)為先升高后逐漸降低，說明HSP70在熱應(yīng)激初期上調(diào)表達(dá)有助于組織細(xì)胞發(fā)揮功能。此外，HSP70在人類白血病細(xì)胞中出現(xiàn)表達(dá)異常的情況，并且可能與白血病出現(xiàn)耐藥性有關(guān)，推測(cè)的原因可能是HSP70影響線粒體代謝調(diào)控細(xì)胞凋亡[19]。高表達(dá)的HSP70能夠作用在線粒體參與的凋亡途徑中對(duì)凋亡體發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的凋亡酶激活因子(Apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)，通過與 Apaf-1結(jié)合，阻止 Apaf-1參與凋亡小體的形成，從而促進(jìn)細(xì)胞存活[20]。細(xì)胞是機(jī)體新陳代謝發(fā)生的主要場(chǎng)所，處于一個(gè)不斷生長(zhǎng)增殖和更新?lián)Q代的過程中，所處不同的細(xì)胞周期階段對(duì)熱應(yīng)激的敏感性也不同。相關(guān)研究顯示，細(xì)胞在S期或者有絲分裂期時(shí)對(duì)熱應(yīng)激敏感性高，而在G1或者G2期時(shí)對(duì)熱應(yīng)激敏感性則相對(duì)低一些[21]。細(xì)胞在熱應(yīng)激初期時(shí)會(huì)超表達(dá)相關(guān)熱應(yīng)激蛋白來(lái)保護(hù)自身應(yīng)對(duì)熱應(yīng)激帶來(lái)的損傷，以維持自身正常的新陳代謝，但如果傷害性刺激無(wú)法解決，熱應(yīng)激持續(xù)存在，就會(huì)引起蛋白質(zhì)變性降解，導(dǎo)致細(xì)胞骨架蛋白被破壞，細(xì)胞膜通透性增加，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞分泌炎性因子，發(fā)生炎癥，甚至發(fā)生自身免疫反應(yīng)，損害機(jī)體組織器官，這一切均會(huì)影響機(jī)體生命活動(dòng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，導(dǎo)致動(dòng)物休克甚至死亡。

2 熱應(yīng)激相關(guān)基因

熱應(yīng)激是影響犬及其他動(dòng)物最常見的應(yīng)激因素之一，是一個(gè)受到多種基因調(diào)控的復(fù)雜生理過程，目前已有多個(gè)候選基因被發(fā)現(xiàn)與熱應(yīng)激相關(guān)。羅威等[22]利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在比格犬和中華田園犬的腎和垂體2個(gè)組織應(yīng)激前后中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)共有的差異基因神經(jīng)肽B(Neuropeptide B，NPB)和蛋白脂蛋白1(Proteolipid protein 1，PLP1)，這2個(gè)差異基因可能是影響比格犬和中華田園犬應(yīng)激耐受性的重要候選基因；此外，通過基因本體論(Gene Ontology，GO)富集分析發(fā)現(xiàn)腺苷受體A1(ADORA1)、代謝型谷氨酸受體1(Metabotropic Glutamate Receptor 1，GRM1)以及核受體NR4A1(Nuclear receptor subfamily 4，group A，member 1，NR4A1)等可能是影響犬品種應(yīng)激耐受性差異的關(guān)鍵基因。朱騫等[18]發(fā)現(xiàn)處于熱應(yīng)激狀態(tài)下犬HSP70在PBMC和血液中差異表達(dá)，表明HSP70在犬應(yīng)對(duì)熱應(yīng)激生理過程中可能發(fā)揮重要作用。在其他動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)多個(gè)可能與熱應(yīng)激相關(guān)的候選基因，可以為尋找犬熱應(yīng)激候選基因提供參考。曾濤等[23]研究北京鴨和番鴨肝臟熱應(yīng)激前后基因表達(dá)譜也發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激組中HSP70表達(dá)上調(diào)。宋曉燕等[24]利用全基因組表達(dá)譜芯片檢測(cè)雞大腦、肝臟和腿肌3個(gè)組織中熱應(yīng)激前后差異表達(dá)的基因，發(fā)現(xiàn)HSP25和HSPH1在3個(gè)組織中表達(dá)上調(diào)，Bcl-2相關(guān)抗凋亡基因3(Bcl-2 associated athanogene 3，BAG3)在3個(gè)組織中顯著差異表達(dá)。姚毅等[25]在雞腦、肝和腿肌3個(gè)組織中通過利用蛋白互作網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)了1個(gè)熱應(yīng)激相關(guān)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，即熱應(yīng)激蛋白HSPH1，蛋白折疊相關(guān)基因FK506結(jié)合蛋白(FK506-binding proteins 5，F(xiàn)KBP5)和細(xì)胞死亡蛋白BAG3。

3 小結(jié)與展望

熱應(yīng)激是犬最常發(fā)生的一種應(yīng)激反應(yīng)，會(huì)影響犬的生理機(jī)能，尤其是對(duì)處于南方夏季的工作犬而言，極大地干擾了工作犬的正常使用。在分子水平研究熱應(yīng)激對(duì)犬的影響可以加深對(duì)犬熱應(yīng)激的理解，為采取更有效的應(yīng)對(duì)措施提供理論依據(jù)。目前，國(guó)內(nèi)外在熱應(yīng)激對(duì)犬影響的分子機(jī)制上的研究還不夠深入，熱應(yīng)激相關(guān)候選基因研究還不足，主要研究集中在犬機(jī)體處于熱應(yīng)激下生理生化的指標(biāo)變化，熱應(yīng)激對(duì)犬細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和凋亡的影響以及犬機(jī)體產(chǎn)生熱應(yīng)激蛋白來(lái)應(yīng)對(duì)熱應(yīng)激對(duì)自身的影響，但對(duì)于熱應(yīng)激如何影響犬的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，這將是今后研究犬熱應(yīng)激的一個(gè)重點(diǎn)。此外，犬熱應(yīng)激候選基因互作以及涉及的信號(hào)通路研究也是未來(lái)的研究方向。