酶處理蔗渣的國內(nèi)研究進展

陶 平，劉學(xué)文，余希文，余構(gòu)彬

(1廣東省生物工程研究所(廣州甘蔗糖業(yè)研究所) 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點實驗室，廣東廣州510316；2國家糖業(yè)質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，廣東廣州510316)

0 引言

甘蔗是我國最重要的糖料作物，甘蔗經(jīng)壓榨機壓榨提取蔗汁后，產(chǎn)生大量纖維性殘渣(蔗渣)，其中含有大量的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等?？捎糜谠旒垺⒃耘嗷|(zhì)、能源等領(lǐng)域[1]。我國制糖行業(yè)每年產(chǎn)生幾千萬噸蔗渣，由于蔗渣轉(zhuǎn)化和利用技術(shù)欠缺，除少量用于造紙外，大多數(shù)蔗渣被作為燃料直接燒掉，導(dǎo)致全生物量利用率較低，而且還污染環(huán)境[2-3]。因此，如何充分利用蔗渣，提升其附加值，從而提高甘蔗的全生物量利用率，具有十分重要的意義。

酶制劑作為生物催化劑，具有高效專一、經(jīng)濟、環(huán)保等特點。隨著生物工程技術(shù)的不斷發(fā)展，酶制劑被廣泛應(yīng)用于食品加工、農(nóng)產(chǎn)品加工等領(lǐng)域[4]。酶制劑在蔗渣處理中的應(yīng)用，既可減少多種化學(xué)試劑的使用，降低能耗和污染，又能提高甘蔗全生物量利用率和產(chǎn)品質(zhì)量，增加經(jīng)濟效益[2]。因此，酶制劑越來越受重視，具有良好的發(fā)展前景。

本文對漆酶、木聚糖酶及纖維素酶等在國內(nèi)蔗渣處理中的應(yīng)用研究進行簡要概述，希望推動酶制劑在我國蔗渣處理中獲得更廣泛的應(yīng)用。

1 漆酶(Laccase)

目前制糖工業(yè)副產(chǎn)物蔗渣主要用于造紙、燃料、復(fù)合材料及栽培基質(zhì)等領(lǐng)域，其中主要含有半纖維素和木質(zhì)素，含量分別為25%～30%和20%～25%。半纖維素主要由各種單糖(如木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖等)和 4-O-甲基葡萄糖醛酸以β-D-呋喃果糖苷鍵、葡萄糖苷鍵和酯鍵連接具有支鏈的復(fù)合聚糖，容易被分解利用[5-6]。木質(zhì)素是包括紫丁香基、愈創(chuàng)木酚基和對羥基苯的類苯基丙烷結(jié)構(gòu)單元通過C-C鍵和醚鍵聚合形成的無定形三維立體多酚網(wǎng)狀高分子化合物[7]。

漆酶是一種含銅多酚氧化酶，屬銅藍氧化酶。由多肽鏈、糖配基和銅離子活性中心組成。銅離子活性中心主要由1個Ⅰ型銅(T1)、1個Ⅱ型銅(T2)和1組自旋耦合的雙核Ⅲ型銅(T3)組成，對催化活性十分重要。催化時T1從底物中吸收電子轉(zhuǎn)移給T2和T3組成的三核簇，氧分子通過指向T3銅的通道進入漆酶獲得電子生成水，隨后從T2銅指向外部的通道離開。漆酶可以氧化降解木質(zhì)素和酚類物質(zhì)[8-9]。有研究證實漆酶能有效脫除蔗渣中的木質(zhì)素。其作用機理為：有氧存在條件下，能將木質(zhì)素中的酚羥基氧化為酚氧自由基，隨后酚氧自由基進一步發(fā)生氧化而斷裂，生成羰基木質(zhì)素或醌類物質(zhì)，導(dǎo)致木質(zhì)素大分子降解；或酚氧自由基縮合，形成大分子物質(zhì)。因此，通過控制酚氧自由基的去向，即可實現(xiàn)木質(zhì)素的降解或縮聚。漆酶酶解蔗渣木質(zhì)素主要產(chǎn)物為對羥基苯甲醛、香草醛、丁香醛、丁香酸、香草酸和乙酰丁香酮等，這些芳醛類物質(zhì)被廣泛用于香料、醫(yī)藥和農(nóng)藥領(lǐng)域，還可用作漆酶漂白的天然介體[10]。另一方面漆酶降解木質(zhì)素能夠破壞木質(zhì)素、纖維素及半纖維素形成的致密結(jié)構(gòu)，有利于提高蔗渣纖維素和半纖維素的利用率[11]。目前漆酶處理蔗渣主要應(yīng)用于生物質(zhì)的處理(半纖維素的提取等)和造紙方面(改善紙張性能等)。

研究發(fā)現(xiàn)，利用蔗渣提取半纖維素時，用漆酶進行預(yù)處理，蔗渣表面明顯分層，有片狀結(jié)構(gòu)生成，并有大量新的孔洞產(chǎn)生，總孔體積和比表面積顯著增加，提高酶對蔗渣的接觸面積。處理后蔗渣半纖維素的溶出效率及半纖維素得率明顯提高，半纖維素產(chǎn)率高達 89%，提取時間顯著降低。而且半纖維素分子量更高，相對分子質(zhì)量分布均勻，分散度更低，蔗渣半纖維素組成幾乎無差別，有利于半纖維素的高附加值利用[11-12]。黃吉振的課題研究結(jié)果顯示，提取蔗渣半纖維素時，漆酶處理蔗渣最適反應(yīng)條件為加酶量120 U/g，固液比1∶15，溫度50℃，pH=5.0，反應(yīng)時間 5 h[12]。漆酶在蔗渣造紙中也有較好效果，研究證實，漆酶改性蔗渣TMP可以提高紙漿可漂性；節(jié)約27%左右的能耗；改善紙品光學(xué)性能和返黃值，提高白度3.3%～7.59%(ISO亮度)，不透明度下降；明顯改善成品紙的抗張、撕裂強度及緊度。蔗渣造紙時漆酶處理蔗渣TMP的最宜條件為酶用量6 LAMU/g，溫度50℃，pH=5.0，0.05%介體ABTS，通氧處理1.5 h[13-15]。李兵云等發(fā)現(xiàn)利用漆酶/天然介體處理蔗渣漿，木素中游離羥基結(jié)構(gòu)無明顯的變化，處理時其中的 β-O-4結(jié)構(gòu)容易脫除，導(dǎo)致Ar-CH=CH結(jié)構(gòu)增加，木素側(cè)鏈Cα位羥基氧化，生成α-羰基。再經(jīng)H2O2漂白后白度增加6.4個ISO亮度[16]。

2 木聚糖酶(Xylanase)

木聚糖是自然界中含量最豐富的多糖之一，由高聚木糖主鏈構(gòu)成，是蔗渣半纖維素的主要成分[17-18]。低聚木糖(木寡糖)是一種由 2～10個木糖分子以 β-1,4-糖苷鍵結(jié)合成的低聚合度糖，主要由木二糖、木三糖和木四糖組成，具有多種生理功效，一般利用富含木聚糖的植物或農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品加工制備[19]。木聚糖酶是能夠降解半纖維素生成低聚糖和木糖的一類酶，它是半纖維素酶系統(tǒng)的重要組成部分，包括內(nèi)切-β-1,4-木聚糖酶、外切-β-1,4-木聚糖酶、β-木糖苷酶[20]。作用機理為內(nèi)切-β-1,4-木聚糖酶切割半纖維素的 β-1,4-木聚糖主鏈內(nèi)部的木糖苷鏈，主要酶解產(chǎn)物為低聚木糖；外切-β-1,4-木聚糖酶主要通過作用于木聚糖和低聚木糖的非還原端徹底降解木聚糖，產(chǎn)物為木糖；β-木糖苷酶水解低聚木糖末端，釋放木糖殘基[21]。木聚糖酶同樣被用于造紙工藝(紙漿生物漂白)，目前普遍認(rèn)為主要是通過酶改變紙漿結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及成分達到輔助漂白的效果，但其具體作用機理尚無定論。木聚糖酶處理蔗渣的產(chǎn)物低聚木糖具有對雙歧桿菌高選擇性增殖效果、防齲齒、促鈣吸收、降血壓、調(diào)節(jié)免疫等特殊生理功能，廣泛應(yīng)用于食品和飼料行業(yè)[22]。

酶解蔗渣制備低聚木糖的研究發(fā)現(xiàn)，堿處理后的蔗渣在酶量5 g/L，溫度40℃，pH=6的條件下酶解4 h，60.17 g/L物料可獲得31.13 g/L平均聚合度2.64的木聚糖。而且小試實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)6 kg蔗渣酶解后可產(chǎn)出9.942 L低聚木糖液(濃度29.62 g/L)[23]。趙力超等以草菇為表達載體，研究了重組多功能木聚糖酶酶解蔗渣生產(chǎn)低聚木糖，結(jié)果表明該木聚糖酶表現(xiàn)出很高的內(nèi)切-β-1,4-木聚糖活力，產(chǎn)物主要為木二糖和木三糖。該酶水解蔗渣生產(chǎn)低聚木糖的最適參數(shù)為酶量900 U/mL，底物110 g/L，酶解80 min。該參數(shù)下酶解率為 23.94%，產(chǎn)物低聚木糖的DP值達到3。而且底物利用率跟底物純度成正比，木聚糖純度為75%時，酶解率可達到50%[19]。何亮亮等分析了不同條件對低聚木糖得率的影響，由此得出木聚糖降解蔗渣木聚糖最優(yōu)酶解工藝參數(shù)，為酶量3.7%，溫度47℃，pH=5.3，酶解6 h。此條件下低聚木糖平均聚合度 2.28，而且得率較高，達到82.04%[24]。此外，研究發(fā)現(xiàn)木聚糖酶在蔗渣造紙的紙漿漂白工藝中也有較好效果。一般認(rèn)為，并非木聚糖酶直接參與了紙漿漂白，而是通過改變紙漿結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和成分，間接輔助漂白工藝。蔣磊的課題研究發(fā)現(xiàn)木聚糖酶Shearzyme 500L處理蔗渣漿的最佳處理參數(shù)為酶量3 FXU/g，溫度45℃，pH=5.0，酶解120 min。處理后漿料中纖維長度增加，細小纖維含量降低，纖維表面出現(xiàn)明顯裂痕，褶皺程度加深。纖維素含量增加了 4.13%，聚戊糖含量下降2.25%，白度增加5.7%(ISO亮度)[20]。付希堯利用另一種商業(yè)化木聚糖酶 Pulpzyme HC 2500處理蔗渣漿，發(fā)現(xiàn)該酶預(yù)處理蔗渣漿最佳反應(yīng)參數(shù)為酶量2.5 IU/g，漿濃6%，溫度55℃，pH=7.5，反應(yīng)時間1.5 h。處理后聚戊糖含量下降37.4%，纖維的長寬比增加，細小纖維含量下降，有助于提高紙張的物理強度。纖維表面變粗糙，產(chǎn)生較多孔洞，這與蔣磊的實驗結(jié)果基本一致[25]。

3 纖維素酶(Cellulase)

蔗渣中含有大量纖維素，含量約 42%～50%，因此如何利用蔗渣中纖維素成為蔗渣高值化利用的首要任務(wù)。纖維素是由 D-葡萄糖基以 β-1,4-葡萄糖苷鍵連接而成的鏈狀大分子，在氫鍵作用下，部分纖維素分子形成結(jié)晶或類結(jié)晶的微纖絲，導(dǎo)致纖維素較難分解利用[5-6]。

纖維素酶一般由多種水解酶組成，是一類能將纖維素水解成低聚糖或葡萄糖的酶。一般認(rèn)為纖維素酶可分為 3類：內(nèi)切葡聚糖苷酶(endo-1,4-βglucanase，EG 或 CMCase)；外切葡聚糖苷酶(exo-1,4-β-glucanase)；β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)[26]。關(guān)于纖維素酶是如何發(fā)揮作用的，目前存在幾種觀點，其中協(xié)同作用機制假說接受度較高，降解纖維素時，外切葡聚糖苷酶首先作用于結(jié)晶纖維素表面，破壞纖維素的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，隨后內(nèi)切葡聚糖苷酶發(fā)揮作用，催化生成寡糖和纖維二糖，最后β-葡萄糖苷酶進一步將中間產(chǎn)物降解為葡萄糖分子[27]。

纖維素酶已被應(yīng)用于食品、造紙、紡織、畜牧、能源等領(lǐng)域。在國內(nèi)制糖工業(yè)中也有廣泛研究。早在1974年國內(nèi)就出現(xiàn)了纖維素酶酶解蔗渣的研究，該研究小組發(fā)現(xiàn)，蔗渣經(jīng)NaOH處理后，按比例加入產(chǎn)纖維素酶菌種，pH=5.0，50℃下酶解24～36 h，蔗渣纖維素轉(zhuǎn)化率可達 80%以上[28]。劉志佳等[29]的實驗結(jié)果表明，經(jīng)亞硫酸鹽預(yù)處理的蔗渣在加酶量7.5 FPU/g(以干蔗渣計)，50℃，反應(yīng)72 h的實驗條件下，纖維素水解效率最高能達到83.76%。鄭成等[30-31]研究蔗渣的酶法水解條件，并探討了酶解的動力學(xué)模型，發(fā)現(xiàn)該酶解反應(yīng)為非競爭性可逆產(chǎn)物抑制反應(yīng)。以經(jīng)2.0 MPa，120℃直接加熱膨化20 min的蔗渣為底物，用纖維酶粉進行水解，固液比5%(w/v)、酶濃度 1.28 g/L時，水解適宜條件為pH=4.2～4.9，50℃，反應(yīng)時間為48～52 h。此條件下，還原糖得率不受緩沖液種類和離子強度的影響。林金鶯等[32]研究蒸汽預(yù)處理蔗渣酶法水解工藝，結(jié)果表明蒸汽預(yù)處理(220℃，2220 kPa)能溶解大部分半纖維素，并增加對纖維素的水解作用。最經(jīng)濟水解條件為纖維素酶 2.5 FPU/mL，水不溶性底物15%(w/v)，反應(yīng)時間為48 h。弱堿性亞硫酸鹽預(yù)處理(亞硫酸鈉用量18%，溫度160℃，保溫時間60 min)后的蔗渣纖維素酶酶解最佳反應(yīng)條件：酶用量 30 U/g，液比 1∶20，溫度 50℃，pH=4.8，反應(yīng)時間72 h。其葡萄糖得率達50.9%，木糖得率23.0%[33]。微波預(yù)處理結(jié)合纖維素酶酶解蔗渣的研究結(jié)果顯示，微波預(yù)處理工藝(按1∶50固液比，280 W微波功率，用1% NaOH和1% H2SO4先后處理10 min、5 min)能有效破壞蔗渣的致密結(jié)構(gòu)，比較4種商品化纖維素酶酶解經(jīng)預(yù)處理蔗渣的情況，發(fā)現(xiàn)纖維素酶酶解效果最好的為日本Yacult R-10，其最佳反應(yīng)條件為加酶量 2 g/L，pH=5.5，溫度 50℃，反應(yīng)時間為12 h[34]。黃祥斌等研究不同纖維素酶酶解蔗渣的差異，發(fā)現(xiàn)最高水解率為 62.2%，最低水解率為43.1%。在纖維素酶制劑中加入半纖維素酶，能提高蔗渣水解率，最大增加31.0%[35]。佟新新[36]在其課題研究中，獲得了重組纖維素酶，研究其酶學(xué)性質(zhì)，并篩選酶解蔗渣效果最好的纖維素酶組合，同時確認(rèn)該酶組合最適酶解條件為 pH=5.0～6.0，溫度 55℃，反應(yīng)時間15～16 h。最新研究結(jié)果顯示，酶法制備甘蔗渣微晶纖維素時，最佳工藝條件為加酶量0.4%，pH=4.5，溫度48℃，該參數(shù)下微晶纖維素得率為 94.9%，而且粒度更小，均勻性更好[37]。蔗渣酶法水解液的膜分離實驗研究發(fā)現(xiàn)，聚醚砜膜(分割分子量=10000 u)對纖維素酶的截留率為 100%，膜回收的酶活性率只有 56%。發(fā)酵液的吸附和 pH值對過濾通量無明顯影響，過濾通量與液體流速只在2～4 m/min范圍內(nèi)表現(xiàn)為正相關(guān)關(guān)系，其他流速對通量沒有影響[38]。楊海燕等[39]通過研究基于酶回用的蔗渣酶解糖化工藝，發(fā)現(xiàn)酶解反應(yīng)后，有約 2/3的游離態(tài)酶存在，使用超濾法進行纖維素酶回收，回收酶解效率相當(dāng)于新酶的60.87%，再利用時只需補加30%的酶量。

4 其他酶類

一些研究發(fā)現(xiàn)在處理蔗渣方面，其他酶類也有一定效果。田世杰等利用木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶降解蔗渣中木質(zhì)素，發(fā)現(xiàn)能降解18.46%木質(zhì)素，從而提高纖維素酶水解率28.67%。同時確定酶解最適條件為溫度40℃，pH=4.0，反應(yīng)48 h[40]。楊慧敏在其課題研究中指出處理蔗渣時添加 0.5 mg/g的纖維素酶輔助酶AA9 (Auxiliary Activity 9)，蔗渣的酶解效率能提高 27.3%，而且還能節(jié)約至少17%纖維素酶用量[41]。有較多證據(jù)表明采用復(fù)合酶酶解蔗渣，能使蔗渣酶解糖化產(chǎn)物最大化水解。纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶共同作用，蔗渣的水解產(chǎn)物均為單糖[2]。丁勝華比較了復(fù)合多糖酶Viscozyme L、木聚糖酶和纖維素酶3種酶不同組合的水解效果，發(fā)現(xiàn)3種復(fù)合酶的水解效果比2種復(fù)合酶和單獨酶的更好[23]。濃度為80 g/L的蔗渣纖維素用 β-葡萄糖苷酶(濃度 30 CBU/L)配合纖維素酶(濃度 15 FPIU/g)處理 48 h，葡萄糖得率能達到81.58%，總糖得率 84.23%，纖維素酶解得率高達95.02%[42]。在利用蔗渣水解發(fā)酵丁二酸的研究中發(fā)現(xiàn)，底物濃度為75 g/L時，用纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶和果膠酶組成的復(fù)合酶制劑水解，產(chǎn)物中還原糖濃度為65.6 g/L，蔗渣總纖維素水解率高達90%[43]。張迪采用纖維素酶、果膠酶各2.0 g/L，木聚糖酶3.0 g/L，半纖維素酶5 g/L的復(fù)合酶組合酶解蔗渣，還原糖產(chǎn)量增加較為迅速，最終酶解液中總葡萄糖濃度為 5.99 g/L[44]。劉云云使用纖維素酶(20 FPU/g)和半纖維素酶Htec2 (1200 IU/g)處理濃度為25%(w/v)底物，反應(yīng)96 h后，葡萄糖和木糖分別達到155.73 g/L、63.16 g/L，總糖量為241.91 g/L，葡聚糖和木聚糖轉(zhuǎn)化率高達 98.58%和 94.87%[45]。說明復(fù)合酶組合能高效轉(zhuǎn)化蔗渣，也為酶解蔗渣指明了研究方向。

5 展望

我國現(xiàn)有糖廠 300家以上，每年產(chǎn)生蔗渣約2000萬 t。除少量用于造紙外，大多被直接燒掉或丟棄，利用率極低，不僅浪費資源，還導(dǎo)致環(huán)境污染問題。由于國家日益重視農(nóng)業(yè)加工副產(chǎn)品的利用，蔗渣的利用也得到了一定程度的發(fā)展，目前蔗渣在造紙、發(fā)電、飼料、栽培、燃料、生產(chǎn)酶制劑、板材、功能性食品等領(lǐng)域均有一定的應(yīng)用研究。蔗渣本身價格低廉、產(chǎn)地相對集中，收集簡單，具有極大的利用空間和潛力，但規(guī)模化利用生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品仍需理論和技術(shù)積累。

酶制劑具有特異性強、高效、操作簡單、環(huán)保等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于紡織工業(yè)、食品行業(yè)、醫(yī)藥、化妝品、飼料加工、材料等多個領(lǐng)域，在制糖工業(yè)澄清工藝中也有應(yīng)用。利用酶制劑處理蔗渣可以提高甘蔗的全生物量利用率，增加產(chǎn)品附加值，提高轉(zhuǎn)化率，增加經(jīng)濟效益，降低能耗和污染，具有非常重大的意義。由于蔗渣本身的半纖維素和木質(zhì)素形成牢固的結(jié)合層包裹著纖維素，尤其是木質(zhì)素的存在嚴(yán)重阻礙了酶制劑與纖維素的接觸，單一酶類直接酶解效率不高，一般需要多種酶協(xié)同水解才能提高水解率和產(chǎn)物得率，獲得較好效果。另一方面，蔗渣的纖維素對纖維素酶等有較強的吸附作用，導(dǎo)致酶解工藝中酶的消耗量過高，成本增加。因此要加大復(fù)合酶制劑和酶回收再利用技術(shù)的研制力度，從而使蔗渣利用真正達到高效低成本高效益。相信經(jīng)過廣大科研工作者及糖廠技術(shù)人員的共同努力，酶制劑的使用一定會使我國蔗渣的高值化利用取得長足進步。