循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測在肺癌中的應(yīng)用

毛 莉，李金密，任曉東，陳 敏 綜述，黃 慶 審校

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院/野戰(zhàn)外科研究所檢驗科，重慶 400042)

肺癌在全世界的發(fā)病率和病死率居高不下，近年來更是一躍成為中國最常見的死亡原因[1]。由于缺乏理想的早期診斷方法，且肺癌患者在發(fā)病早期的臨床癥狀不明顯，導(dǎo)致肺癌確診時已發(fā)病至中晚期，使患者錯過了最佳的治療時期。因此，肺癌的早期診斷是降低肺癌患者病死率的關(guān)鍵。近年來，隨著循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)檢測技術(shù)的發(fā)展，特別是CellSearch系統(tǒng)在臨床實踐中的廣泛應(yīng)用，CTCs檢測將成為對腫瘤早期診斷、治療及預(yù)后評估的新型工具。本文綜述近年來CTCs檢測診斷技術(shù)的進展及其在肺癌診斷中的應(yīng)用，并對其檢測技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)進行探討。

1 CTCs檢測技術(shù)的進展

1869年，ASHWORTH[2]在腫瘤患者的血液中檢測到CTCs，并且發(fā)現(xiàn)在腫瘤發(fā)生早期即有CTCs通過血液循環(huán)發(fā)生全身擴散的現(xiàn)象，這一發(fā)現(xiàn)開啟了國內(nèi)外多個國家醫(yī)學(xué)專家的研究熱潮。CTCs進入血液循環(huán)后通過遷移、黏附、相互聚集形成微小癌栓,并在一定條件下發(fā)展為轉(zhuǎn)移灶，CTCs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移擴散中均扮演著重要角色[3]。

1.1CTCs的富集 CTCs在外周血中的濃度極低,出現(xiàn)的概率約為每109個血細(xì)胞中出現(xiàn)1個CTCs[4],所以，CTCs檢測的關(guān)鍵在于能否在復(fù)雜環(huán)境中準(zhǔn)確、高速有效地富集CTCs。根據(jù)檢測原理，CTCs的富集方法可分為特異性富集方法和非特異性富集方法。特異性富集方法基于CTCs細(xì)胞表面的標(biāo)志物如細(xì)胞角蛋白(CK)等進行富集，包括免疫磁性分離法(IMS)、芯片富集法、納米粒富集法等。其中 IMS是目前用于富集CTCs最常見的方法，它的原理是在外部磁場中，相應(yīng)的抗原抗體復(fù)合物附著在磁珠上并保留在磁場中,而沒有這種表面抗原的其他細(xì)胞由于不能與連接著磁珠的特異性單克隆抗體結(jié)合而不具有磁性,不在磁場中停留,從而使腫瘤細(xì)胞得以分離[5-6]。非特異性富集方法是根據(jù)CTCs自身的物理特性，如大小、密度等進行富集，包括密度梯度離心法、細(xì)胞大小富集法等。密度梯度離心法是目前實驗室常用的一種基于形態(tài)學(xué)特點富集腫瘤細(xì)胞的方法,該方法設(shè)備要求低，操作簡便，但該方法血液需求量大，靈敏度低，重復(fù)性較差。

1.2CTCs的檢測 根據(jù)檢測原理，富集CTCs檢測方法可分2大類:細(xì)胞計數(shù)法和核酸檢測法。前者主要包括各種免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(ICC)、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)等，后者主要包括PCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR等技術(shù)。

1.2.1ICC ICC指以顯色劑標(biāo)記的特異性抗體與CTCs特異性結(jié)合后，通過顯色劑顯色反應(yīng)對相應(yīng)抗原進行定位、定性和定量測定的技術(shù)。ICC檢測能夠?qū)?xì)胞大小和形態(tài)進行分析，但靈敏度低，只能從(1～10)×105個正常細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)1個腫瘤細(xì)胞[7]，這無疑限制了其在臨床上的應(yīng)用。

1.2.2FCM 該方法集激光、電子物理、光電測量、計算機、細(xì)胞熒光化學(xué)及單克隆抗體技術(shù)為一體，能夠?qū)?xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進行檢測的方法。近年來有一種微創(chuàng)體內(nèi)檢測技術(shù)，通過將熒光標(biāo)記的單克隆抗體注射入體內(nèi)，通過放置于血管的激光檢測流過的CTCs,極大地彌補了檢測靈敏度的不足。

1.2.3PCR 該方法主要通過檢測癌基因、抑癌基因的突變或染色體質(zhì)量產(chǎn)生的異常DNA來檢測腫瘤患者外周血中的CTCs。

1.2.4逆轉(zhuǎn)錄PCR 該方法是在PCR的基礎(chǔ)上擴增由腫瘤特異性mRNA序列逆轉(zhuǎn)錄的DNA片段,由于這些特異性的mRNA通常不表達(dá)于正常外周血細(xì)胞，因此，在某些基因改變后，可以基于組織或腫瘤特異性mRNA的表達(dá)或某些基因改變后RNA水平的異?？梢蚤g接檢測到CTCs的存在[8]。此法靈敏度較高，但是假陽性率高，無法檢測CTCs細(xì)胞形態(tài)等問題局限了該方法在臨床上的應(yīng)用。隨著近幾年逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)的發(fā)展，實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR、熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR等新方法的出現(xiàn)，由于其高擴增效率和高特異度、靈敏度，逆轉(zhuǎn)錄PCR及其改進技術(shù)廣泛應(yīng)用于CTCs的檢測中，被公認(rèn)為目前最準(zhǔn)確的檢測方法[9]。

1.2.5富集與檢測技術(shù)結(jié)合 為了加速CTCs檢測在臨床實踐中的應(yīng)用，近年來，結(jié)合富集和檢測技術(shù)的自動化檢測系統(tǒng)已被用于提高檢測的靈敏度和特異度。目前，CellSearch檢測系統(tǒng)相對成熟并得到廣泛應(yīng)用。CellSearch 系統(tǒng)是一個使用靈活，功能強大的研究平臺。

CellSearch檢測系統(tǒng)首先通過納米磁珠特異性地富集血液中的CTCs。再進一步將富集出來的CTCs進行化學(xué)或生物染色，最后通過檢測系統(tǒng)完成對CTCs的準(zhǔn)確檢測。該系統(tǒng)具有特異度、靈敏度、重復(fù)性高的優(yōu)點，可從400多億的血細(xì)胞中檢測到單一的一個CTCs,并且檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。值得注意的是，使用單一抗原富集CTCs(如表面的EpCAM)經(jīng)常導(dǎo)致檢測結(jié)果中的假陰性，因為并非每種腫瘤細(xì)胞都表達(dá)上皮標(biāo)志。為了避免這一問題的出現(xiàn)，研究者開始加入新的表面分子。使用抗EpCAM和抗CK(CK7/8)的免疫磁珠富集CTCs，用酶學(xué)方法去檢測CTCs[10]。OncoCEE平臺運用了多種混合抗體富集轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的CTCs，與CellSearch相比，靈敏度提高了21%[11]。雖然使用新的檢測標(biāo)志物可以提高檢出率，但同時會增加與正常有核細(xì)胞的特異和非特異性反應(yīng)，因此，只有篩選出具有強特異度的標(biāo)志物才可以提高CTCs的檢出率。此外,具有高靈敏度的CTCs-Chip也是一項集富集與檢測為一體的先進技術(shù),即使只有極少量的腫瘤細(xì)胞,CTCs-Chip技術(shù)也可以一步將它們于全血中捕獲,捕獲的腫瘤細(xì)胞存活率高達(dá)98%[12]，并且檢測結(jié)果不受腫瘤細(xì)胞間歇性釋放的影響。鑒于肺癌影像學(xué)篩查的效用和成本爭議，CTCs-Chip的血液檢測作為吸煙者等肺癌高危人群的篩查工具極具吸引力。

2 CTCs在肺癌中的應(yīng)用

肺癌是當(dāng)今世界各國常見的惡性腫瘤，肺癌患者的5年生存率低于15%[13-14]，其中非小細(xì)胞肺癌占肺癌患者總數(shù)的80%～85%[15]。近年來，基于血液中生物標(biāo)志物的液體活檢技術(shù)為肺癌的早期診斷與早期轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的檢測提供了新思路，這些生物標(biāo)志物包括循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)[16]和CTCs。ctDNA主要是指來自腫瘤細(xì)胞壞死凋亡后釋放于人體血液系統(tǒng)中不斷循環(huán)的腫瘤基因組游離DNA片段[17]。CHAN等[18]通過對比肺癌患者與健康人的ctDNA含量的顯著差異，證明通過檢測ctDNA含量的變化，可以對肺癌高危人群進行早期篩查。相較于ctDNA檢測，CTCs檢測具有獨特優(yōu)勢，通過檢測從實體腫瘤上脫落后進入血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，對轉(zhuǎn)移癌的診斷具有極高的特異度，能夠鑒定所有類型的腫瘤細(xì)胞，并且能進一步進行腫瘤分子生物學(xué)和遺傳學(xué)分析。

研究發(fā)現(xiàn)，進入人體循環(huán)系統(tǒng)的CTCs絕大多數(shù)被機體的免疫系統(tǒng)殺傷或在血液動力學(xué)的作用下破壞死亡，只有少數(shù)能存活下來,并在一定條件下發(fā)展為轉(zhuǎn)移灶[19]，而外周血中CTCs的數(shù)量反映了肺癌發(fā)生血行轉(zhuǎn)移的程度和能力，CTCs計數(shù)會隨著腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的進展而顯著增高。此外，CTCs在肺癌的早期診斷、微轉(zhuǎn)移、評估療效與預(yù)后、選擇合適的個體化治療等方面的作用也得到了大量的研究證實。LV等[20]使用CellSearch系統(tǒng)檢測32例非小細(xì)胞肺癌患者肺靜脈血中的CTCs，結(jié)果顯示陽性率為90.6%(29/32)，且CTCs計數(shù)與腫瘤大小呈正相關(guān)(P=0.012),后將來自3例患者的富集的CTCs注射到3只免疫缺陷小的小鼠中，1只小鼠產(chǎn)生異種移植腫瘤，表明CTCs檢測有助于早期發(fā)現(xiàn)肺癌及可能出現(xiàn)的微轉(zhuǎn)移。LOU等[21]使用定量PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測各階段肺癌患者的外周血CTCs,結(jié)果顯示陽性率為70%，研究結(jié)果同時表明，CTCs陽性率與血清腫瘤標(biāo)志物(包括血清癌胚抗原、細(xì)胞角蛋白片段19抗原21-1)升高的水平無關(guān)，但與肺癌的臨床分期有關(guān)，其中Ⅰ期肺癌的陽性率為67.2%，CTCs對肺癌的早期診斷更為靈敏。FIORELLI等[22]應(yīng)用細(xì)胞大小富集法從77例患有惡性(n=60)和良性(n=17)肺病變的患者外周血中分析CTCs,統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，60例(90%)惡性腫瘤患者中有54例檢測出CTCs，17例(5%)良性患者中有1例檢測出CTCs，在測試的Ⅰ期肺癌患者(42%)中，CTCs的數(shù)量與腫瘤大小相關(guān)(P=0.001)。另一項研究數(shù)據(jù)表明，CTCs在肺癌早期即可檢測到，陽性率為68%[23]，表明CTCs檢測有助于早期發(fā)現(xiàn)肺癌及可能出現(xiàn)的微轉(zhuǎn)移。PUNNOOSE等[24]通過CellSearch法檢測41例非小細(xì)胞肺癌患者的CTCs,發(fā)現(xiàn)CTCs計數(shù)的降低與放射性治療具有相關(guān)性，表明CTCs檢測可作為肺癌患者放射性治療后的檢測手段。MAHESWARAN等[25]采用CTCs-Chip法檢測27例非小細(xì)胞肺癌患者的CTCs,結(jié)果顯示，從接受酪氨酸激酶抑制劑治療的EGFR突變患者中收集的CTCs中檢測到T790M突變(該突變賦予藥物抗性)，表明CTCs檢測可作為肺癌患者靶向藥物治療后檢測治療期間基因型變化的方法。BREITENBUECHER等[26]研究表明，攜帶EGFR突變的肺癌患者中有84%的CTCs可檢測到EGFR突變，在94%的病例中，CTCs中發(fā)現(xiàn)的突變與腫瘤組織中的突變不一致，這可能是由于原發(fā)病灶和轉(zhuǎn)移部位之間的腫瘤異質(zhì)性導(dǎo)致。 TANIGUCHI等[27]采用逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測8例肺癌患者的CTCs，結(jié)果顯示EGFR突變患者在CTCs中均表現(xiàn)出相同的突變。 此外，CTCs在其他腫瘤的臨床應(yīng)用方面也取得了一些進展，如胰腺癌、胃癌、膀胱癌。

3 CTCs檢測面臨的挑戰(zhàn)與展望

CTCs檢測是一種真正的無創(chuàng)、可以動態(tài)監(jiān)測病情變化、對于腫瘤的早期診斷、復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移、靶向藥物篩選等具有重要臨床意義的檢測方法，在惡性腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療領(lǐng)域具有良好的臨床應(yīng)用前景和巨大的社會效益。但目前尚缺乏規(guī)范的檢測流程與相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，還需進一步的臨床試驗去完善檢測的重復(fù)性。各種富集和檢測新方法的聯(lián)合使用也將極大地提高檢測的靈敏度和特異度，隨著技術(shù)的不斷改進與發(fā)展,CTCs檢測必將在臨床腫瘤診治中得到推廣應(yīng)用。