非酒精性脂肪性肝病相關(guān)動(dòng)物模型研究進(jìn)展

沈李婷 陳東風(fēng) 文良志

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)已成為全球慢性肝病最主要的病因。隨著生活水平的提高，NAFLD的患病率呈逐年升高趨勢(shì),在亞洲已達(dá)到25%[1]。NAFLD以無(wú)過(guò)量酒精攝入但出現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪變?yōu)橹饕卣?通常伴隨有肝外代謝相關(guān)疾病，如肥胖，血脂異常，胰島素抵抗。大量的證據(jù)表明，NAFLD相關(guān)疾病包括非酒精性單純性脂肪肝(nonalcoholic simple fatty liver, NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)、NAFLD相關(guān)肝硬化和肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)，還與心血管事件，慢性腎臟疾病，結(jié)直腸癌和其他肝外疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)[2]。近年來(lái)，已有多種NAFLD動(dòng)物模型應(yīng)用于相關(guān)研究之中，我們對(duì)目前實(shí)驗(yàn)研究中常用的動(dòng)物模型進(jìn)行了歸納分析，旨在為相關(guān)研究的動(dòng)物模型選擇提供便利。

一、NAFLD動(dòng)物模型

(一)高脂飲食(high-fat diet, HFD)HFD是誘導(dǎo)小鼠NAFLD的常用飲食。經(jīng)典的HFD包含71%的脂肪，11%的碳水化合物和18%的蛋白質(zhì)。動(dòng)物總卡路里攝入量45%～75%來(lái)自脂肪。有文章報(bào)道，雄性小鼠用HFD喂養(yǎng)16周后，出現(xiàn)以下情況：①體質(zhì)量增加；②肝細(xì)胞脂肪變性，表現(xiàn)為甘油三酯水平升高、肝細(xì)胞氣球樣變和Mallory小體形成；③高糖血癥和胰島素抵抗，表現(xiàn)為血清葡萄糖水平升高和胰島素水平升高[3]。因此，HFD喂養(yǎng)的動(dòng)物模型能夠很好的模擬臨床NAFLD患者的發(fā)病機(jī)制和組織病理表現(xiàn)。但是該模型的缺點(diǎn)是耗時(shí)長(zhǎng)(12～16周)，肝脂肪變性程度較輕，且很少出現(xiàn)炎癥及纖維化，難以構(gòu)建NASH相關(guān)模型。除了常見(jiàn)的HFD誘導(dǎo)NAFLD小鼠模型外，還有自助餐飲食(cafeteria diet, CAF)用于構(gòu)建NAFLD小鼠。

(二)自助餐飲食 CAF是一種參照西方文化，能夠模擬人類(lèi)飲食習(xí)慣的方法，Brante P. Sampey等[4]分別通過(guò)CAF，基于45%豬油的HFD和正常飲食喂養(yǎng)雄性Wistar小鼠15周，觀察到CAF喂養(yǎng)的小鼠體質(zhì)量增加程度，高糖血癥、高胰島素血癥和脂肪組織炎癥程度均重于HFD飲食和正常飲食小鼠。CAF模型與HFD模型相比，能更好的研究西方飲食結(jié)構(gòu)下導(dǎo)致的肥胖及肥胖相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制。

(三)瘦素缺失小鼠(ob/ob小鼠)Ob/ob小鼠也是常用于NAFLD研究的動(dòng)物模型。瘦素由脂肪細(xì)胞產(chǎn)生，它參與下丘腦對(duì)攝食行為的調(diào)節(jié)，通過(guò)增加飽腹感以減少食物的攝入。Ob/ob小鼠因瘦素合成障礙，表現(xiàn)為懶惰、貪吃和過(guò)度肥胖，肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性，同時(shí)伴有高糖血癥、高脂血癥、高胰島素血癥和腸菌過(guò)度增殖。這類(lèi)動(dòng)物模型的缺點(diǎn)是在無(wú)外加條件下很難自發(fā)發(fā)生NASH和肝纖維化。最重要的是，在人類(lèi)NAFLD中，血清瘦素通常呈現(xiàn)升高的狀態(tài)。因此，ob/ob小鼠需要一些外加刺激來(lái)模擬人類(lèi)NAFLD/NASH發(fā)生，如予以ob/ob小鼠含果糖和膽固醇的高脂飲食，此時(shí)不但可以誘發(fā)肝臟的脂肪變性、炎癥和肝細(xì)胞氣球樣變，還可以導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生[5]。

(四)瘦素受體缺失小鼠(db/db小鼠)db/db小鼠是常染色體隱性遺傳糖尿病基因(db)純合小鼠。 該小鼠表現(xiàn)為血清瘦素水平不同程度的升高但瘦素信號(hào)缺失。db/db小鼠生理及病理生理方面與ob/ob小鼠類(lèi)似，通常用來(lái)構(gòu)建NAFLD以及糖尿病模型。由于在正常飲食的情況下db/db小鼠不能自發(fā)出現(xiàn)NASH相關(guān)病理特征，因此，多數(shù)研究通常利用MCD飲食予以db/db小鼠第二次打擊來(lái)構(gòu)建NASH。另有研究發(fā)現(xiàn)，予以db/db小鼠過(guò)量鐵負(fù)荷，使肝臟氧化應(yīng)激，炎癥反應(yīng)增加，促進(jìn)肝臟炎性免疫細(xì)胞活性，影響肝細(xì)胞線(xiàn)粒體脂肪酸β氧化，最終使小鼠出現(xiàn)肝細(xì)胞氣球樣變和肝纖維化。即過(guò)量鐵負(fù)荷使db/db小鼠從NAFLD進(jìn)展成NASH和相關(guān)纖維化[6]。

二、NASH動(dòng)物模型

(一)甲硫氨酸-膽堿缺乏飲食(Methionine-and choline-deficient diet, MCD)MCD是構(gòu)建NASH小鼠模型常用飲食，通常由蔗糖(40%的能量)和脂肪(10%)組成，但是缺乏甲硫氨酸和膽堿[7]。甲硫氨酸和膽堿是重要的甲基供體，肝細(xì)胞完整的甲基化能力對(duì)于一些重要生理功能的維持十分重要，如脂代謝。因此，MCD誘導(dǎo)小鼠發(fā)生NASH可能與肝臟合成甘油三酯(如VLDL)功能損害以及隨之而來(lái)的脂質(zhì)堆積導(dǎo)致肝細(xì)胞氧化應(yīng)激增加有關(guān)[8]。該模型的主要優(yōu)點(diǎn)是MCD喂養(yǎng)第2周小鼠就會(huì)發(fā)生廣泛的肝臟炎癥，并且在6周后出現(xiàn)明顯的纖維化[9]，比起HFD，MCD誘發(fā)的氧化應(yīng)激、炎癥和纖維化更嚴(yán)重，更能模擬臨床病情較重的NASH患者。但是MCD喂養(yǎng)的小鼠會(huì)發(fā)生明顯的體質(zhì)量下降，血糖水平下降和胰島素敏感性增加[10]，這與大部分NAFLD患者臨床表現(xiàn)不一致。此為MCD誘導(dǎo)NASH模型的缺點(diǎn)。

(二)膽堿缺乏L-氨基酸飲食(Choline-deficient L-amino acid-defined diet, CDAA)CDAA中，蛋白質(zhì)由等效的L-氨基酸替代，組成配方為：28.9 kcal/g L-谷氨酸，15.8 kcal/g L-天冬氨酸，12.7 kcal/g L-精氨酸和10.5 kcal/g L-亮氨酸，不包含酒石酸氫膽堿。與人類(lèi)NASH相比，MCD動(dòng)物模型缺乏血清脂肪酸的升高，并且出現(xiàn)體質(zhì)量的下降，CDAA動(dòng)物模型通過(guò)改變飲食組成，提升了和人類(lèi)NASH病理生理的相關(guān)性。與MCD動(dòng)物模型類(lèi)似的是，它可以抑制肝細(xì)胞的脂肪酸氧化，增加脂質(zhì)合成，氧化應(yīng)激和炎癥，最終導(dǎo)致纖維化；區(qū)別在于在長(zhǎng)時(shí)間的CDAA喂養(yǎng)后(大約22周)，小鼠可出現(xiàn)肥胖，胰島素抵抗和血清甘油三酯與膽固醇水平升高[11]。也有報(bào)道指出在更長(zhǎng)時(shí)間的CDAA喂養(yǎng)之后(9個(gè)月)，小鼠出現(xiàn)不經(jīng)歷肝硬化的NAFLD相關(guān)肝癌(成瘤率40%)[12]。CDAA喂養(yǎng)小鼠出現(xiàn)代謝相關(guān)癥狀的時(shí)間長(zhǎng)，單獨(dú)應(yīng)用于NASH研究不多。

(三)膽堿缺乏-高脂飲食(Choline-deficient high-fat diet, CD-HFD)CD不同于MCD，其飲食組成中甲硫氨酸無(wú)明顯減少，避免了過(guò)度的體質(zhì)量下降，但是大多數(shù)CD構(gòu)建的動(dòng)物模型仍缺乏明顯的肥胖，也不出現(xiàn)糖耐量的改變和胰島素抵抗。為解決上述問(wèn)題，學(xué)者聯(lián)合應(yīng)用了CD、HFD構(gòu)建NAFLD相關(guān)動(dòng)物模型，該飲食組成為20%蛋白質(zhì)，35%碳水化合物和45%脂肪，不添加膽堿。此時(shí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物能在短時(shí)間內(nèi)(一般為6～12周)發(fā)生NASH，同時(shí)伴隨血清轉(zhuǎn)氨酶升高。有學(xué)者在一定時(shí)間內(nèi)(12個(gè)月)通過(guò)CD-HFD喂養(yǎng)，成功在小鼠中誘導(dǎo)出了NAFLD相關(guān)的HCC[13]。該模型最大的缺點(diǎn)是纖維化發(fā)生緩慢，成瘤周期長(zhǎng)(12個(gè)月)，并且成瘤率低(25%)。

三、NAFLD相關(guān)肝癌模型

單純飲食誘導(dǎo)NAFLD相關(guān)HCC動(dòng)物模型雖有報(bào)道[12-14]，但是此類(lèi)模型的普遍缺點(diǎn)是造模時(shí)間長(zhǎng)，成瘤率低。因此，在一般實(shí)驗(yàn)研究當(dāng)中除了運(yùn)用特殊飲食，還會(huì)使用一些特殊小鼠，或者加用某些藥物/毒物以模擬NAFLD相關(guān)HCC。

(一)HFD喂養(yǎng)MUP-uPA小鼠 MUP-uPA小鼠是一種能在肝細(xì)胞中特異性地大量表達(dá)尿激酶纖溶酶原激活物(urokinase plasminogen activator, u-PA)的小鼠(6周齡)，大量的u-PA能夠引起肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和肝臟損傷，這兩者都與人類(lèi)NASH進(jìn)展相關(guān)[15]。Hayato Nakagawa等[16]予以MUP-uPA小鼠(6周齡)HFD喂養(yǎng)，小鼠能在整個(gè)觀察期間維持高血清轉(zhuǎn)氨酶水平，并在24周內(nèi)誘導(dǎo)出NASH，32周后出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的腫瘤灶，成瘤率85%。該小鼠模型有肝細(xì)胞氣球樣變、炎癥浸潤(rùn)、細(xì)胞周?chē)皹蚪永w維化表現(xiàn)，同時(shí)伴隨持續(xù)的肝細(xì)胞死亡和代償性增殖，這很好的模擬了人類(lèi)NASH的病理生理以及NASH進(jìn)展成HCC的過(guò)程。因此非常適用于NASH相關(guān)研究。

(二)PTEN基因敲除小鼠 PTEN被認(rèn)為是一種抑癌基因，在許多人類(lèi)腫瘤當(dāng)中存在突變。肝細(xì)胞特異性的PTEN敲除小鼠肝臟發(fā)生脂肪樣變，同時(shí)伴隨著肝細(xì)胞氣球樣變、Mallory小體形成、小葉炎癥和細(xì)胞周?chē)w維化，在74～78周時(shí)，83%的雄性小鼠和50%的雌性小鼠誘導(dǎo)出了NASH相關(guān)HCC[17]。該模型因此常用來(lái)探索NASH以及相關(guān)HCC進(jìn)展的機(jī)制。但是肝細(xì)胞特異性PTEN敲除小鼠表現(xiàn)出胰島素高敏感狀態(tài)，并且不發(fā)生肥胖，這是與人類(lèi)NASH及相關(guān)HCC發(fā)生過(guò)程中相悖的地方。

(三)鏈脲霉素聯(lián)合HFD 鏈脲霉素(streptozotocin, STZ)是一種抗腫瘤藥物，其對(duì)胰島β細(xì)胞具有毒性作用，可以導(dǎo)致胰島炎癥和損傷，引起胰島素分泌障礙，從而誘發(fā)糖尿病。Masato Fujii等[18]對(duì)出生2 d的C57BL/6J 雄性小鼠皮下注射200 μg STZ，出生4周后予以HFD喂養(yǎng)，該模型在HFD喂養(yǎng)后第2周即出現(xiàn)肝臟炎癥，氣球樣變及纖維化，在喂養(yǎng)后第16周形成肉眼可見(jiàn)的腫瘤，成瘤率100%。但當(dāng)利用相同條件處理雌性小鼠時(shí)，小鼠僅出現(xiàn)糖尿病癥狀而無(wú)腫瘤發(fā)生。這是多數(shù)小鼠模型中存在的問(wèn)題，即通常只有雄性小鼠才能誘導(dǎo)出較為理想的NAFLD相關(guān)表型。但總體而言，STZ注射聯(lián)合HFD喂養(yǎng)的小鼠成瘤時(shí)間短，成瘤率高，是實(shí)驗(yàn)研究中常用的NAFLD-HCC動(dòng)物模型。

(四)四氯化碳聯(lián)合CDAA 四氯化碳(Carbon Tetrachloride, CCl4)具有肝毒性，在經(jīng)肝臟代謝后增加了肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致脂質(zhì)和氧化產(chǎn)物的堆積以及強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，最終引起肝纖維化。單獨(dú)使用CCl4不能引起肥胖，胰島素抵抗，本身并不適用于構(gòu)建NAFLD相關(guān)動(dòng)物模型。因此常常結(jié)合一些特殊飲食。CCl4聯(lián)合CDAA是一種常見(jiàn)的用于模擬NAFLD-HCC的形式，CDAA喂養(yǎng)C57BL/6小鼠(6～8周齡)，每周腹腔注射CCl40.2μl/g ，9個(gè)月時(shí)成瘤率100%。該模型的缺點(diǎn)是造模時(shí)間較長(zhǎng)，且動(dòng)物肝臟纖維化程度過(guò)重[12]。

(五)二乙基甲硝胺聯(lián)合HFD或ob/ob小鼠 二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine, DEN)是一種研究常用的致癌制劑，它能夠引起肝細(xì)胞氧化應(yīng)激和DNA突變，增強(qiáng)脂毒性，加速肝臟纖維化和肝硬化進(jìn)展，廣泛用于構(gòu)建HCC動(dòng)物模型。通過(guò)結(jié)合特殊飲食或者特殊基因型小鼠，就能夠模擬NAFLD基礎(chǔ)上HCC的發(fā)生。Eek Joong Park等[19]予以野生型和ob/ob 小鼠(14 d齡)腹腔注射DEN25mg/kg，4周后予以野生型小鼠HFD喂養(yǎng)，ob/ob小鼠低脂飲食，9月后成功誘導(dǎo)出NAFLD相關(guān)HCC。

上述模型雖然能很好地幫助我們研究NAFLD相關(guān)HCC病理生理，模擬大多數(shù)NAFLD患者經(jīng)歷肝纖維化、肝硬化這一晚期階段再形成HCC的過(guò)程[20]，但是人類(lèi)很少有機(jī)會(huì)接觸到這些具有致癌作用的藥物或者毒物，并且NAFLD基礎(chǔ)上發(fā)生HCC機(jī)制復(fù)雜，因此上述藥物/毒物基礎(chǔ)是構(gòu)建的動(dòng)物模型最大的缺點(diǎn)就是與人類(lèi)成瘤病因不同。

四、總結(jié)與展望

NAFLD現(xiàn)今仍無(wú)精準(zhǔn)有效的治療手段，因此臨床上迫切的需要在闡明其中發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)上，找到和確認(rèn)新的藥物干預(yù)治療靶點(diǎn)。動(dòng)物模型是一種不可或缺的研究工具。本文總結(jié)了目前常用的動(dòng)物模型，分析了模型各自的優(yōu)缺點(diǎn)，為學(xué)者獲得高質(zhì)量研究成果提供保障。