肝竇內(nèi)皮細(xì)胞在肝纖維化中的作用

吳玲 李鋒

肝纖維化是慢性肝病發(fā)生進(jìn)展的共同病理生理過(guò)程，在持續(xù)或反復(fù)存在的各種損傷因素作用下，肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的產(chǎn)生與降解失衡而致纖維組織在Disse間隙沉積。

高通透性的肝竇是肝內(nèi)特殊的毛細(xì)血管，其正常的形態(tài)及功能對(duì)維持肝臟正常的生理功能具有重要作用，持續(xù)的損傷導(dǎo)致的肝竇毛細(xì)血管化是肝纖維化過(guò)程中一個(gè)重要的病理過(guò)程。作為構(gòu)成肝竇最主要的細(xì)胞，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(liver sinusoidal endothelial cell, LSEC)在肝纖維化過(guò)程中的作用備受關(guān)注。本文就肝竇內(nèi)皮細(xì)胞在肝纖維化發(fā)生中的重要作用予以綜述。

一、LSEC簡(jiǎn)述

正常情況下，LSEC是一種缺乏基底膜的高度特化的內(nèi)皮細(xì)胞，即分化型LSEC；受損后，LSEC失去窗孔、發(fā)生毛細(xì)血管化，成為去分化型LSEC或去窗孔化LSEC。

正常情況下，電鏡下可見窗孔成群聚集成為篩板，并且不同位置的篩板的窗孔數(shù)量及大小會(huì)有所不同：位于門脈周圍的篩板含有的窗孔數(shù)量少但直徑大，而位于肝小葉中央的篩板的窗孔數(shù)量多但直徑小[1]；并且，前者更多地表現(xiàn)為CD45陽(yáng)性，而后者則更多地表現(xiàn)為CD45陰性。因?yàn)閷?duì)于某些細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)還存在爭(zhēng)議，如CD31[2]，而且尚未發(fā)現(xiàn)分化型LSEC特有的細(xì)胞表面標(biāo)志物，所以目前多用標(biāo)志物的組合來(lái)提示LSEC的存在及分類：同時(shí)表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子3(vascular endothelia growth factor3，VEGF3)、VEGF受體VEGFR2、鈣黏蛋白及Ⅷ因子的LSEC可認(rèn)為是分化型LSEC；而表達(dá)上調(diào)的內(nèi)皮素-1及表達(dá)下調(diào)的VEGFR2則可提示LSEC發(fā)生毛細(xì)血管化[3]。并且，鑒于LSEC的內(nèi)吞功能，除了細(xì)胞表面標(biāo)志物，胞質(zhì)內(nèi)的內(nèi)吞囊泡也可用來(lái)判斷LSEC的存在[1，4]，熒光標(biāo)記的胚胎硫糖蛋白抗原攝入能力亦可用來(lái)檢測(cè)分離的LSEC的純度。

電鏡下看到含有窗孔的篩板是檢測(cè)LSEC存在的金標(biāo)準(zhǔn)[5]。LSEC許多重要功能，諸如物質(zhì)交換、血流調(diào)節(jié)等的有效實(shí)現(xiàn)依賴于窗孔的存在[6]；而遭遇損傷后細(xì)胞因子、血流動(dòng)力學(xué)的改變、交感及副交感系統(tǒng)的激活等等都會(huì)影響LSEC窗孔的數(shù)量及大小[7]，若損傷持續(xù)，則LSEC發(fā)生失窗孔化，繼而出現(xiàn)肝細(xì)胞壞死及肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)活化等，肝內(nèi)代謝環(huán)境失衡，最終導(dǎo)致肝纖維化的出現(xiàn)及進(jìn)展。因此，分化型LSEC對(duì)正常肝功能的維持有著重要的作用，LSEC的失窗孔化是肝纖維化早期的一個(gè)重要事件。

二、影響LSEC表型改變的信號(hào)通路

(一)基質(zhì)細(xì)胞來(lái)源因子1 (SDF-1)肝臟損傷刺激LSEC產(chǎn)生的信號(hào)可決定結(jié)局是肝臟的修復(fù)再生還是進(jìn)展為纖維化甚至肝硬化[8-9]。當(dāng)肝臟遭遇損傷后，CXC亞家族的趨化因子—基質(zhì)細(xì)胞來(lái)源因子1(SDF-1)受體的表達(dá)上調(diào)。SDF-1的受體有CXCR7和CXCR4，可產(chǎn)生不同的信號(hào)途徑而導(dǎo)致不同的結(jié)局。一般在肝臟遭遇急性損傷后，LSEC內(nèi)CXCR7表達(dá)增多，SDF-1與CXCR7結(jié)合后，轉(zhuǎn)錄因子Id1被激活，Id1的激活能夠產(chǎn)生肝再生修復(fù)，一般不出現(xiàn)纖維化的修復(fù)結(jié)局；而在慢性損傷的持續(xù)作用下，LSEC的血管生長(zhǎng)因子受體1表達(dá)上調(diào)，與血管生長(zhǎng)因子2結(jié)合后，持續(xù)激活MAPK途徑，誘導(dǎo)LSEC內(nèi)CXCR4表達(dá)而抑制CXCR7的表達(dá)，所以在Id1的轉(zhuǎn)錄被抑制的同時(shí)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β等表達(dá)增多，HSC活化，生成大量的ECM而致肝臟纖維化修復(fù)。因此，通過(guò)改變LSEC受損后傳導(dǎo)的信號(hào)將可能改變肝臟的修復(fù)結(jié)局。

(二)自噬 LSEC的自噬作用對(duì)于其特殊表型的維持有重要的作用[10]。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞感受到血流動(dòng)力學(xué)變化時(shí)，具有保護(hù)血管作用的Krupple樣因子KLF2表達(dá)上調(diào)，增強(qiáng)LSEC的自噬作用而減輕損傷。當(dāng)自噬作用消失后，LSEC出現(xiàn)功能紊亂，對(duì)抗氧應(yīng)激能力下降，NO產(chǎn)生減少；而NO是維持LSEC分化狀態(tài)的重要物質(zhì)，還能使HSC保持在靜止?fàn)顟B(tài)而減少ECM的產(chǎn)生——LSEC自噬作用的消失會(huì)加重肝纖維化[3]。但另一方面，參與脂質(zhì)代謝的小窩蛋白1(caveolin-1)介導(dǎo)的LSEC的自噬，會(huì)激活A(yù)MPK-ULK1通路、抑制NO依賴性途徑、重建F肌動(dòng)蛋白，導(dǎo)致LSEC的去窗孔化[11,12]。因此，不同情況下發(fā)生的自噬作用對(duì)LSEC的表型具有不同的作用。

(三)Hedgehog(Hh)信號(hào)通路 LSEC的去分化過(guò)中有Hh信號(hào)通路的參與。哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在的三種Hh蛋白：Shh(Sonic Hedgehog)、Ihh(Indian Hedgehog)、Dhh(Desert Hedgehog)為Hh信號(hào)通路中的配體；對(duì)Hh信號(hào)通路發(fā)揮負(fù)向調(diào)控的Patched(Ptc)和發(fā)揮正向調(diào)控的Smoothened(Smo)為Hh信號(hào)通路中的受體。在無(wú)Hh配體的情況下，膜表面的Ptc抑制跨膜受體Smo活性，Hh下游信號(hào)通路被抑制，而Ptc與配體Hh蛋白結(jié)合后，其抑制Smo作用被解除，Hh下游信號(hào)通路激活繼而發(fā)生轉(zhuǎn)錄因子的改變，過(guò)度激活的Hh信號(hào)通路參與各種疾病的發(fā)生。

正常情況下，胚胎發(fā)育成熟后的肝臟內(nèi)Hh配體很少，且LSEC和HSC強(qiáng)表達(dá)可與可溶性Hh配體結(jié)合而阻止其與Ptc結(jié)合的蛋白(Hh相互作用蛋白， Hhip)，所以肝組織內(nèi)很少存在激活的Hh信號(hào)通路；而在肝臟受到損傷后，肝內(nèi)產(chǎn)生的Hh信號(hào)通路的配體增多，如脂毒性常導(dǎo)致激酶JNK(c-Jun氨基末端激酶)的激活而使Shh表達(dá)增多[13]。Ptc與配體結(jié)合后，Smo活化，LSEC核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子Gli1、Gli2、Gli3激活，Gli蛋白屬于Krupple樣因子家族，一般情況下Gli1增強(qiáng)、Gli3抑制、Gli2既可抑制也可增強(qiáng)Hh基因的表達(dá)，活化的SMO在與一系列影響Gli轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)作用后大多數(shù)情況下最終引起Hh信號(hào)通路的激活[14]。在非酒精性脂肪肝、肝纖維化等多種病理過(guò)程中，出現(xiàn)的DNA甲基化、CpG島的形成、microRNA等調(diào)節(jié)Hh信號(hào)通路，影響著細(xì)胞的功能[14]。

所以抑制Hh信號(hào)通路可能對(duì)肝纖維化的緩解有益。造模膽汁性肝硬化的小鼠在經(jīng)Hh信號(hào)通路抑制劑(維莫德吉)處理后，體內(nèi)Gli2和CD31表達(dá)減少，提示Hh信號(hào)通路被抑制；同時(shí)LSEC的去分化狀態(tài)改善。體外培養(yǎng)的LSEC在2～3 d之內(nèi)就會(huì)發(fā)生去窗孔化[5]，而且在LSEC失窗孔化的發(fā)生之前Hh信號(hào)通路就已激活：在體外培養(yǎng)之前敲除Smo基因，使得發(fā)生在去分化之前的Hh信號(hào)通路無(wú)法激活，LSEC的分化狀態(tài)可維持。培養(yǎng)的LSEC發(fā)生去分化之后，在通過(guò)環(huán)巴胺、Hh信號(hào)中和劑處理或敲除去分化狀態(tài)LSEC的Smo基因來(lái)抑制原本被激活的Hh信號(hào)通路后，雖然LSEC的去分化標(biāo)志物iNOS、ET-1等表達(dá)下調(diào)，但是電鏡下未發(fā)現(xiàn)LSEC窗孔的恢復(fù)，故抑制Hh信號(hào)通路可能只能部分改善已發(fā)生去分化的LSEC的表型而不能完全恢復(fù)。有研究發(fā)現(xiàn)，在四氯化碳處理的小鼠體內(nèi)的LSEC中的肝臟X受體α(LXRα)表達(dá)升高，LXRα可通過(guò)抑制Hh信號(hào)通路使LSEC保持分化狀態(tài)，減輕四氯化碳造成的肝損傷和肝纖維化，LXR激動(dòng)劑可減緩在肝臟受到損傷后LSEC的失窗孔進(jìn)程而減輕肝纖維化[15]。

因此抑制Hh信號(hào)通路的激活可能成為治療肝纖維化或逆轉(zhuǎn)肝纖維化的靶點(diǎn)。目前FDA通過(guò)的治療基底細(xì)胞癌的藥物維莫德吉就是通過(guò)抑制SMO而抑制Hh信號(hào)通路發(fā)揮作用[16]，并且已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明維莫德吉能夠減輕非酒精性脂肪性肝炎小鼠的肝損、血吸蟲性肝硬化小鼠的肝纖維化[17]。另外，具有改善微循環(huán)作用的川穹嗪(TMP)也具有抑制Hh信號(hào)通路的作用：TMP可減少LSEC內(nèi)Shh及SMO的表達(dá)，抑制Gli1的活性而減少VEGF-A、血小板源性生長(zhǎng)因子β受體、缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α等而減少肝臟的血管生成；同時(shí)被抑制的Hh信號(hào)通路可抑制LSEC的毛細(xì)血管化，且體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明TMP可增加LSEC的窗孔數(shù)量而改善LSEC的分化狀態(tài)[18]。

三、LSEC與HSC的相互作用

活化的HSC目前被認(rèn)為是肝纖維化過(guò)程中分泌ECM的主要細(xì)胞。LSEC與HSC之間的相互作用在維持肝臟正常功能及各種病理過(guò)程中起重要作用。

VEGF是調(diào)節(jié)LSEC與HSC的重要細(xì)胞因子。由HSC和肝細(xì)胞分泌的VEGF可通過(guò)旁分泌途徑作用于LSEC，通過(guò)激活LSEC中內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS)合成NO，NO進(jìn)一步通過(guò)可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(sGC)將三磷酸鳥苷(GTP)轉(zhuǎn)變成環(huán)鳥甘酸(cGMP)，通過(guò)蛋白激酶G途徑磷酸化靶蛋白，或者蛋白質(zhì)的巰基亞硝基化等途徑來(lái)維持LSEC的分化狀態(tài)及各種功能并維持HSC的靜止?fàn)顟B(tài)[1]。LSEC的分化狀態(tài)的維持依賴于cGMP途徑即NO依賴性途徑，但同時(shí)也存在MAPK等非NO依賴性途徑。分化狀態(tài)的LSEC具有維持HSC靜止的功能也是通過(guò)NO途徑實(shí)現(xiàn)的，而去分化狀態(tài)的LSEC則失去維持HSC靜止的功能；當(dāng)抑制LSEC中的eNOS時(shí)，LSEC同樣無(wú)法維持HSC的靜止?fàn)顟B(tài)。在慢性損傷持續(xù)存在的情況下，sGC激動(dòng)劑可逆轉(zhuǎn)LSEC的去分化狀態(tài)，分化狀態(tài)的LSEC又可通過(guò)使活化的HSC凋亡、抑制HSC的活化使得活化HSC的標(biāo)志物α-SMA減少，ECM合成減少，但是否是完全恢復(fù)靜止?fàn)顟B(tài)抑或是僅活化受抑制還需進(jìn)一步驗(yàn)證。體外培養(yǎng)時(shí)，sGC激動(dòng)劑可抑制靜止的HSC活化，但無(wú)法直接使活化的HSC逆轉(zhuǎn)為靜止?fàn)顟B(tài)，而需先通過(guò)逆轉(zhuǎn)去分化的LSEC為分化狀態(tài)，再間接發(fā)揮抑制HSC活化狀態(tài)的作用，原因可能是靜止的HSC內(nèi)存在產(chǎn)生cGMP需要的異二聚體sGC，而活化的HSC內(nèi)未檢測(cè)到這種異二聚體sGC，故無(wú)法產(chǎn)生cGMP而無(wú)法產(chǎn)生作用[1]。

四、細(xì)胞間相互作用

在肝纖維化過(guò)程中，LSEC與肝臟其他細(xì)胞之間也存在著復(fù)雜的相互作用。接受通過(guò)LSEC窗孔轉(zhuǎn)運(yùn)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的肝細(xì)胞同樣可以分泌VEGF而發(fā)揮著影響LSEC表型的作用，TGF-β可刺激LSEC和肝細(xì)胞的CD147表達(dá)上調(diào)，刺激肝細(xì)胞的VEGF-A與LSEC的VEGF-R2表達(dá)上調(diào)，造成LSEC的去窗孔化[19]。LSEC與庫(kù)普弗細(xì)胞都是肝臟固有免疫系統(tǒng)的重要組成細(xì)胞，庫(kù)普弗細(xì)胞表面的PD-1與LSEC表面的PD-L1相互作用會(huì)導(dǎo)致LSEC功能受損[20]。LSEC可通過(guò)膜表面表達(dá)TGF-β而誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的產(chǎn)生，減少炎癥及自身免疫性反應(yīng)的發(fā)生，維持肝臟的免疫耐受狀態(tài)[21]。

五、小結(jié)

肝纖維化的發(fā)生是一個(gè)涉及多分子、多細(xì)胞、多信號(hào)通路復(fù)雜的過(guò)程，LSEC表型的調(diào)節(jié)及與肝臟細(xì)胞之間的相互作用在肝纖維化中發(fā)揮著重要的作用，多種受體-配體介導(dǎo)的信號(hào)通路參與維持LSEC的去分化狀態(tài)并介導(dǎo)其與其它細(xì)胞之間的相互作用。