干細(xì)胞治療椎間盤退變研究進(jìn)展

趙達(dá)旺 蔚建魯 程雷

椎間盤退變引起的腰背痛嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。椎間盤退變的治療包括保守治療和手術(shù)治療，但兩者均不能逆轉(zhuǎn)椎間盤退變的病理狀態(tài)[2]。近年，干細(xì)胞再生療法為治療椎間盤退變提供了新選擇，其具有以下特點(diǎn)：通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)重新填充椎間盤，恢復(fù)受損組織；不引起額外的椎間盤損傷[3]；可分泌生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，加強(qiáng)組織再生。

隨著干細(xì)胞研究不斷深入，干細(xì)胞治療椎間盤退變的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)獲得持續(xù)進(jìn)展，生物支架得到廣泛運(yùn)用，同時(shí)也開(kāi)展了一些臨床試驗(yàn)，評(píng)估治療的有效性和安全性。椎間盤退變的干細(xì)胞治療中，種子細(xì)胞選擇是首要考慮的問(wèn)題，常用的外源性干細(xì)胞包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。本文對(duì)應(yīng)用干細(xì)胞治療椎間盤退變的研究進(jìn)展作一綜述。

1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

1.1 體外實(shí)驗(yàn)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相對(duì)容易獲取且具有免疫調(diào)節(jié)功能[4]，近年來(lái)很多學(xué)者將其作為種子細(xì)胞用于椎間盤退變治療的研究中。Gan等[5]的研究探索了相對(duì)寬幅度動(dòng)態(tài)壓縮對(duì)3D骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的影響，發(fā)現(xiàn)該培養(yǎng)系統(tǒng)在無(wú)壓縮組和低幅度壓縮組均表現(xiàn)出良好的細(xì)胞相容性和細(xì)胞活力，而在中等幅度和高幅度壓縮組則出現(xiàn)細(xì)胞活力下降，這表明低壓機(jī)械環(huán)境有利于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化；與無(wú)壓縮組相比，低幅度壓縮組的糖胺聚糖和羥脯氨酸的mRNA和蛋白表達(dá)均增加，這將更有利于細(xì)胞外基質(zhì)沉積。他們推測(cè)，低幅度壓縮促進(jìn)3D培養(yǎng)系統(tǒng)的合成代謝可能是通過(guò)瞬時(shí)感受器電位香草素4通道依賴途徑完成的。Gao等[6]探究了機(jī)械應(yīng)力促進(jìn)髓核細(xì)胞外基質(zhì)合成的作用機(jī)制，采用0～0.2 MPa和0.1 Hz的周期性機(jī)械應(yīng)力作用于髓核細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)周期性機(jī)械應(yīng)力能夠有效促進(jìn)Ⅱ型膠原α1鏈、聚集蛋白聚糖和整合素α1的mRNA表達(dá)，并促進(jìn)磷脂酶Cγ1的磷酸化。

外泌體是細(xì)胞分泌的特異性膜泡，在細(xì)胞通訊中發(fā)揮重要作用。Lu等[7]研究發(fā)現(xiàn)，髓核細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞均可分泌外泌體，髓核細(xì)胞來(lái)源外泌體可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移并誘導(dǎo)其分化為髓核樣表型的細(xì)胞；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體可促進(jìn)髓核細(xì)胞增殖并產(chǎn)生新的細(xì)胞外基質(zhì)。深入研究退變髓核細(xì)胞與外源性干細(xì)胞之間的外泌體通訊機(jī)制具有重要意義。

1.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

骨形態(tài)生成蛋白(BMP)-7是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β超家族的一員，其可增加髓核細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生，增高椎間盤高度，上調(diào)髓核蛋白聚糖的表達(dá)[8]。Xu等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，慢病毒介導(dǎo)的過(guò)表達(dá)BMP-7可誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向髓核表型分化，Smad1沉默可抑制以上作用，表明BMP-7在細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)方面的作用由Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)。

張子琦等[10]將微囊化軟骨細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果顯示共培養(yǎng)后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力未受明顯影響，但增加了軟骨細(xì)胞的部分表面特征，并且能夠合成蛋白多糖及Ⅱ型膠原蛋白；將共培養(yǎng)后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞植入椎間盤退變的動(dòng)物模型，與對(duì)照組相比，植入干細(xì)胞后椎間盤顯示更好的形態(tài)、結(jié)構(gòu)及力學(xué)特征。

在組織工程中，生物支架能夠維持細(xì)胞功能并為細(xì)胞提供機(jī)械保護(hù)。Gan等[11]成功建立葡萄聚糖-明膠水凝膠裝載TGF-β的生物支架，并使用該支架有效誘導(dǎo)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向髓核樣細(xì)胞分化，促進(jìn)相關(guān)細(xì)胞外基質(zhì)基因的表達(dá)。Wu等[12]制作功能性自組裝肽納米纖維支架，并驗(yàn)證該支架具有促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞髓核樣分化、增殖以及趨化性遷移的能力。生物材料負(fù)載干細(xì)胞的策略是再生醫(yī)學(xué)的研究重點(diǎn)，材料植入后的體內(nèi)免疫排斥反應(yīng)需得到更多關(guān)注。

1.3 臨床試驗(yàn)

目前，已有學(xué)者將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用于臨床試驗(yàn)。Elabd等[13]研究低氧條件下培養(yǎng)自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療慢性腰背痛的可行性和長(zhǎng)期安全性，發(fā)現(xiàn)5例患者中4例突出物體積減小，在長(zhǎng)期隨訪中5例患者均達(dá)到可保持椎間盤高度或僅輕度降低，生活質(zhì)量問(wèn)卷調(diào)查顯示大多數(shù)患者達(dá)到病情總體改善，力量和活動(dòng)能力均有提高。盡管該研究為小樣本(5例患者)臨床試驗(yàn)，但也證實(shí)了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療人椎間盤退變的有效性和生物安全性。

2 脂肪干細(xì)胞

脂肪干細(xì)胞也是一類具備再生椎間盤潛力的干細(xì)胞，其在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下即可擴(kuò)增，并展現(xiàn)出多能分化潛力。

2.1 體外實(shí)驗(yàn)

Sun等[14]的研究是首個(gè)在非生理機(jī)械刺激環(huán)境下評(píng)估脂肪干細(xì)胞對(duì)髓核細(xì)胞作用的體外實(shí)驗(yàn)。研究表明，脂肪干細(xì)胞通過(guò)抑制caspase-9和caspase-3阻止髓核凋亡；通過(guò)增加細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生促進(jìn)金屬蛋白酶組織抑制因子的表達(dá)，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶、聚蛋白多糖酶和促炎因子的表達(dá)，顯示出對(duì)髓核細(xì)胞的有益作用。盡管研究中未發(fā)現(xiàn)脂肪干細(xì)胞對(duì)髓核標(biāo)記物表達(dá)的影響，但其可抑制細(xì)胞角蛋白8的減少。

2.2 組織工程學(xué)實(shí)驗(yàn)

在干細(xì)胞治療椎間盤退變的研究中選擇合適的干細(xì)胞支架仍是重要問(wèn)題之一，可注射性黏彈性支架是較好的選擇。水凝膠樣支架在遞送細(xì)胞過(guò)程中呈低黏度，注射后可原位凝膠化，起到填充微觀、宏觀裂縫以及恢復(fù)椎間盤高度的作用[15]，因此水凝膠樣支架是理想的支架系統(tǒng)。

交聯(lián)是穩(wěn)定生物材料最常用的方法[16-17]，許多水凝膠樣支架的凝膠速度由交聯(lián)調(diào)節(jié)。交聯(lián)方式主要有物理交聯(lián)和化學(xué)交聯(lián)，物理交聯(lián)(如光交聯(lián))可能對(duì)遞送細(xì)胞產(chǎn)生毒性，化學(xué)交聯(lián)(如戊二醛等)能有效提高生物支架穩(wěn)定性，但交聯(lián)劑的毒性和誘導(dǎo)鈣化性限制了其長(zhǎng)期植入的可能[18-19]。

京尼平因具有天然低毒性而被廣泛應(yīng)用于研究中。Zhou等[20]使用不同濃度京尼平交聯(lián)Ⅱ型膠原生成支架，通過(guò)檢測(cè)支架的微觀結(jié)構(gòu)、表面形貌、機(jī)械強(qiáng)度、孔隙率、溶脹性質(zhì)和生物學(xué)穩(wěn)定性評(píng)估支架性質(zhì)，通過(guò)測(cè)定細(xì)胞增殖、基因和蛋白質(zhì)表達(dá)量評(píng)估支架對(duì)脂肪干細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。他們的研究證實(shí)：①京尼平可增加Ⅱ型膠原支架穩(wěn)定性，但也改變了支架構(gòu)型和Ⅱ型膠原的內(nèi)在特性；②含0.1% 京尼平的交聯(lián)支架在保持支架構(gòu)型基礎(chǔ)上可提升生物穩(wěn)定性；③含0.1% 京尼平的交聯(lián)支架可促進(jìn)脂肪干細(xì)胞增殖和髓核樣分化，并促進(jìn)音猬因子基因和蛋白的表達(dá)。

Zhou等[21]制作的京尼平交聯(lián)Ⅱ型膠原-硫酸軟骨素復(fù)合支架具備原位凝膠化能力，并在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證該支架具有誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞髓核樣分化及再生椎間盤的能力。他們首先在研究中確定含0.02%京尼平的交聯(lián)支架能提供最好的細(xì)胞相容性。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組(僅含脂肪干細(xì)胞)和交聯(lián)支架負(fù)載脂肪干細(xì)胞組相比，含0.02%京尼平的交聯(lián)支架負(fù)載脂肪干細(xì)胞組的聚集蛋白聚糖基因、Sox9基因及其蛋白表達(dá)均更高，Krt19表達(dá)量在第14天分別為對(duì)照組的4.87倍和交聯(lián)支架負(fù)載脂肪干細(xì)胞組的3.29倍，Pax1表達(dá)量在第7天和第14天分別是對(duì)照組的4.99倍和11.62倍(聚集蛋白聚糖、Sox 9基因和蛋白的表達(dá)水平代表脂肪干細(xì)胞基質(zhì)的合成能力，Krt19和Pax1則是髓核細(xì)胞的特異性基因標(biāo)志物)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，他們對(duì)大鼠尾退變椎骨注射載有脂肪干細(xì)胞的支架系統(tǒng)，通過(guò)X線和MRI檢查測(cè)定椎間盤高度指數(shù)，進(jìn)行組織學(xué)分析、免疫組化分析，以及硫酸鹽黏多糖及羥脯胺酸含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)該支架系統(tǒng)有利于髓核組織再生。

在該類支架的相關(guān)研究中，交聯(lián)劑的種類和濃度、水凝膠樣支架的成分、緩釋生物粒子以及材料的表面改性等均是需進(jìn)一步研究的方向，這些研究可為治療椎間盤退變提供更佳的生物材料。

除水凝膠樣支架外，生物支架也有應(yīng)用。Zhou等[22]通過(guò)模擬天然髓核成分制作脫細(xì)胞髓核支架，并將其加載脂肪干細(xì)胞后注射于兔椎間盤退變模型，結(jié)果證實(shí)脫細(xì)胞髓核遞送系統(tǒng)具有與新鮮髓核組織相似的機(jī)械性能和生物相容性，并能夠誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞的髓核樣分化，增加細(xì)胞外基質(zhì)合成。生物支架因具有低免疫原性和良好的生物相容性，是治療人椎間盤退變的理想支架系統(tǒng)。

2.3 臨床試驗(yàn)

Kumar等[23]開(kāi)展了脂肪干細(xì)胞治療椎間盤退變的Ⅰ期臨床試驗(yàn)。他們將Tissuefill○R(韓國(guó)食品藥品安全部批準(zhǔn)其用作細(xì)胞遞送和缺損組織填充的材料)聯(lián)合自體脂肪干細(xì)胞注射入10例椎間盤退變患者的退變部位，在治療及12個(gè)月的隨訪中未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞移植引起的不良事件和其他嚴(yán)重不良事件，未觀察到骨贅形成和椎間盤縮小；治療前患者的疼痛視覺(jué)模擬評(píng)分(VAS)為(6.50±1.27)分，治療后1個(gè)月和12個(gè)月VAS降低至(4.60±1.07)分和(2.90±1.66)分；治療前患者的腰椎功能障礙指數(shù)(ODI)為42.80%±15.03%，治療后1個(gè)月和12個(gè)月ODI下降至31.20%±13.86%和16.80%±9.77%；表觀彌散系數(shù)圖顯示，3例患者的椎間盤含水量增加。該臨床試驗(yàn)的成功表明了脂肪干細(xì)胞治療椎間盤退變的有效性和安全性將對(duì)干細(xì)胞治療人椎間盤退變的研究產(chǎn)生重要影響。

3 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞

與其他種類干細(xì)胞相比，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療椎間盤退變的研究報(bào)道較少。Qi等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞能夠通過(guò)增加Bcl-2表達(dá)，降低Bax表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和有絲分裂，以保護(hù)髓核間充質(zhì)干細(xì)胞免受高糖損傷。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞能夠顯著上調(diào)髓核中Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的生成。此外，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可通過(guò)p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路減輕高糖環(huán)境下細(xì)胞外基質(zhì)的降解。這些均有利于椎間盤退變的修復(fù)。

Pang等[25]數(shù)年前進(jìn)行了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療慢性椎間盤源性腰痛的臨床試驗(yàn)，在治療后的2年隨訪中，2例患者的VAS、ODI評(píng)分均明顯下降。

4 結(jié)語(yǔ)

近年來(lái)，椎間盤退變的干細(xì)胞治療出現(xiàn)許多新穎研究。在動(dòng)物模型上進(jìn)行干細(xì)胞治療椎間盤退變的有效性已得到廣泛證實(shí)，但還需要開(kāi)展更多的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步了解干細(xì)胞的分化機(jī)制，確定高效安全的干細(xì)胞種類和數(shù)量，尋找最佳載體和遞送方法。進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化前，必須在動(dòng)物模型上驗(yàn)證其療效和安全性。