miRNA在激素性股骨頭壞死中的作用研究進展

孔令馳 關(guān)俊杰 康慶林

激素性股骨頭壞死(SONFH)是臨床上非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的最常見類型，是骨科常見的疑難雜癥之一[1-2]。長期大量使用糖皮質(zhì)激素可導(dǎo)致患者股骨頭局部微循環(huán)受損，引發(fā)成骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并促使其凋亡，以及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)成脂與成骨分化失衡。目前認(rèn)為，上述變化相互聯(lián)系，與SONFH發(fā)病機制密切相關(guān)[1,3-6]。據(jù)最新統(tǒng)計，我國約有70%的SONFH晚期患者需行髖關(guān)節(jié)置換術(shù)[3]。由于髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后患者生活質(zhì)量下降，且存在感染等風(fēng)險，該手術(shù)并不適用于中青年患者。因此，通過研究和探討SONFH發(fā)病相關(guān)分子機制開發(fā)新的預(yù)防和治療手段尤為迫切。

微RNA(miRNA)是一類由19～24 個核苷酸序列組成的單鏈非編碼RNA 分子，其在基因轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控作用，即通過堿基互補配對與靶基因的mRNA 3’端非翻譯區(qū)(3’-UTR)特異性結(jié)合，抑制mRNA的翻譯過程或直接介導(dǎo)mRNA的降解，從而達到調(diào)控靶基因表達的目的[7-8]。miRNA有如下特點：①高度保守性；②時間和空間的有序性；③部分miRNA具有組織特異性[7,9]。編碼miRNA的基因雖然在全基因組中占比不到3%，但可以調(diào)控人類20%～30%基因的表達，在影響與基因表達相關(guān)的生物學(xué)行為方面具有不可替代的作用。miRNA的發(fā)現(xiàn)為人類探索SONFH發(fā)生發(fā)展機制開辟了新思路[9]。

1 SONFH患者或動物模型miRNA表達失調(diào)

為篩選SONFH患者或動物模型中差異性表達的miRNA，最常用的方法是利用miRNA芯片或RNA測序技術(shù)進行高通量分析，再通過實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)實驗在組織或細(xì)胞中對目的miRNA進行驗證。近年來，部分miRNA表達失調(diào)可見于SONFH患者和動物模型壞死組織及BMSC。

1.1 患者股骨頭組織miRNA表達失調(diào)

Yuan等[10]利用miRNA芯片技術(shù)比較9例SONFH患者和6例急性股骨頸骨折患者(正常對照)的股骨頭miRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)在SONFH患者組織中miR-181c-3p、miR-34a-3p、miR-146a-5p、miR-187-3p、miR-181a-3p、miR-30c-1-3p、miR-650、miR-3652、miR-4444、miR-1273、miR-99a-3p和miR-3064-5p等12種miRNA的表達上調(diào)，而miR-132-3p、miR-212-3p、miR-212-5p、miR-6836-5p和miR-629-3p等5種miRNA的表達下調(diào)；qRT-PCR實驗進一步證實，SONFH患者組織中miR-146a和miR-34a的表達上調(diào)。Wu等[11]利用miRNA芯片技術(shù)對4例SONFH患者與4例急性股骨頸骨折患者的股骨頭miRNA表達譜進行比較，發(fā)現(xiàn)22種miRNA的表達上調(diào)和17種miRNA的表達下調(diào)；qRT-PCR實驗進一步證實，miR-210-3p、miR-320e和let-7c等3種miRNA的表達上調(diào)，而miR-133a-3p、miR-335-5p和miR-146b-5p等3種miRNA的表達下調(diào)。上述結(jié)果提示，miRNA在SONFH患者和健康人股骨頭組織中的表達存在差異。

1.2 動物模型股骨頭組織miRNA表達失調(diào)

Gu等[12]首先采用甲強龍肌肉注射(10 mg/kg/d，連續(xù)3 d)方法成功建立大鼠SONFH模型，再利用miRNA芯片技術(shù)分別對模型組和對照組大鼠股骨頭組織miRNA的差異性表達進行篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-10b和miR-27a等9種miRNA的表達明顯上調(diào)，而miR-20a、miR-23b和let-7e等28種miRNA的表達明顯下調(diào)；體外實驗進一步證實，miR-27a有促進細(xì)胞成骨分化和抑制細(xì)胞成脂分化的作用。Yue等[13]先采用腹腔注射脂多糖(20 μg/kg)、24 h后肌肉注射甲強龍(40 mg/kg/d，連續(xù)3 d)的方法建立大鼠SONFH模型，再利用miRNA芯片技術(shù)和qRT-PCR技術(shù)進行檢測，結(jié)果顯示模型組股骨頭局部微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞中miR-132-3p和miR-335的表達較對照組明顯上調(diào)，而miR-466b-2-3p和let-7c-1-3p的表達則較對照組明顯下調(diào)。

1.3 動物模型BMSC miRNA表達失調(diào)

實驗證明，經(jīng)地塞米松處理后人或鼠BMSC的增殖能力降低，這與SONFH的發(fā)病機制密切相關(guān)[14]。Bian等[15]從健康人骨髓中提取BMSC，并用地塞米松(10-9mol/L或10-7mol/L)對其進行干預(yù)；高通量測序結(jié)果顯示，與對照組相比，兩個濃度梯度的處理組miRNA表達譜均發(fā)生改變；miR-16-5p、miR-103a-3p、miR-107、miR-196a/b-5p、miR-378d/f/g、miR-1268a/b和miR-4289等11種miRNA 的表達明顯上調(diào)，而miR-24-3p、miR-378a/h/I、miR-4448和miR-4634等6種miRNA的表達下調(diào)。有研究采用皮下注射甲強龍(21 mg/kg)的方法建立C57BL/6J小鼠SONFH模型并分別提取模型組和對照組的BMSC，再對兩組細(xì)胞的miRNA進行高通量測序和生信分析，發(fā)現(xiàn)miR-21-3p和miR-652-5p的表達明顯上調(diào)，而miR-34b-3p、miR-34c-5p、miR-148a-3p、miR-206-3p和miR-196a-5p的表達下調(diào)[16]。上述結(jié)果可用于預(yù)測表達失調(diào)的miRNA發(fā)揮調(diào)控作用的靶點，而這些靶點多與成骨分化過程相關(guān)。Wang等[17]采用同樣方法研究模型組和對照組的BMSC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，模型組BMSC在成骨分化過程中miR-601、miR-452-3p、miR-647、miR-516b-5p和miR-127-5p的表達明顯上調(diào)，而miR-122-3p的表達顯著下調(diào)；在成脂分化過程中，上述miRNA的差異性表達譜則呈相反趨勢。

2 miRNA對SONFH的重要調(diào)控作用

目前對于單個miRNA在SONFH中的作用，研究多以上述高通量測序等方法的篩選結(jié)果為參照，再通過生信分析、雙熒光素酶實驗和轉(zhuǎn)染后的靶蛋白表達水平檢測確定miRNA分子在SONFH中發(fā)揮調(diào)控作用的靶點。學(xué)者常利用miRNA類似物和抑制劑的轉(zhuǎn)染在細(xì)胞實驗中驗證目標(biāo)miRNA在SONFH發(fā)病過程中的作用，并使用miRNA分子或其轉(zhuǎn)染的細(xì)胞干預(yù)動物模型進行體內(nèi)實驗。

2.1 影響成骨與成脂分化平衡的miRNA

2.1.1 miR-17-5p

Jia等[18]應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)證實，SONFH患者BMSC中的miR-17-5p表達水平低于骨關(guān)節(jié)炎患者(對照組)；進一步研究則證實，miR-17-5p可通過靶向抑制Smad7的表達增加β-連環(huán)蛋白的核轉(zhuǎn)位，促進Ⅰ型膠原α1鏈(COL1A1)表達并誘導(dǎo)BMSC增殖和分化。Wei等[19]研究證實，一種名為HOTAIR的長鏈非編碼RNA(lncRNA)位于miR-17-5p上游，在miR-17-5p相關(guān)SONFH中具有調(diào)控作用，HOTAIR高表達可抑制miR-17-5p表達，從而提高Smad7表達量，最終抑制COL1A1和Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Runx)2表達及堿性磷酸酶(ALP)活性。HOTAIR-miR-17-5p-Smad7-COL1A1/Runx2/ALP軸在調(diào)節(jié)BMSC增殖和成骨分化過程中發(fā)揮重要作用，是SONFH的潛在治療靶點。

2.1.2 miR-27a

Gu等[12]通過高通量測序和qRT-PCR實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，甲強龍誘導(dǎo)的大鼠SONFH模型股骨頭組織中的miR-27a表達明顯下調(diào)，且其靶蛋白過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)γ和gremlin-1蛋白(GREM1)的表達量均增加，而兩者均為成脂分化通路中的關(guān)鍵蛋白分子，提示該模型存在成骨與成脂分化失衡；體外實驗證實，模型大鼠BMSC的miR-27a下調(diào)可促進成脂分化，而其過表達則可抑制成脂分化，并促進成骨分化。上述結(jié)果提示，miR-27a可通過調(diào)節(jié)SONFH患者中GREM1和PPARγ的表達，抑制脂肪生成并促進成骨。Bai等[20]抽提模型大鼠血清中的miRNA，通過qRT-PCR實驗發(fā)現(xiàn)miR-27a的表達下調(diào)，并通過體外實驗證實小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞(MC3T3-E1)中miR-27a的過表達可促進細(xì)胞增殖和成骨分化，抑制半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3/9和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)的表達，促進ALP、Runx2等成骨相關(guān)蛋白的表達；同時發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-27a可增加轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β的表達，TGF-β過表達則可增強miR-27a促成骨分化的效應(yīng)，兩者形成正反饋，對修復(fù)SONFH具有重要意義。

2.1.3 miR-548d-5p

Sun等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在地塞米松誘導(dǎo)的人BMSC成脂分化過程中miR-548d-5p表達下調(diào)，后者與CCAAT-增強子結(jié)合蛋白(C/EBP)-α和PPARγ上調(diào)及細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量增加有關(guān)。而miR-548d-5p過表達可增加骨鈣蛋白(OCN)和Runx2表達量，并提升ALP活性。除miR-27a外，PPARγ也被證實為miR-548d-5p的直接作用靶點。維持miR-548d-5p的表達水平可促進BMSC的成骨分化，并可作為SONFH的潛在治療方法。

2.1.4 miR-708

Hao等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在接受糖皮質(zhì)激素治療患者的BMSC中，miR-708的表達明顯上調(diào)，而Smad3是miR-708的直接作用靶點；體外實驗證實，抑制miR-708的表達可增強BMSC的成骨分化能力，并抑制其成脂分化。敲除miR-708可在一定程度上延緩SONFH動物模型的骨壞死進程。系列研究均證實，糖皮質(zhì)激素可直接導(dǎo)致miR-708過表達，并介導(dǎo)SONFH進展。

2.1.5 其他

Zhao等[23]研究發(fā)現(xiàn)，miR-199b-5p可以通過糖原合成激酶(GSK)-3β/β-連環(huán)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進BMSC成骨分化，從而對SONFH進程造成潛在影響。Liu等[24]研究發(fā)現(xiàn)，兔SONFH模型組miR-206的表達水平高于對照組，并伴有Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路拮抗分子Dickkopf相關(guān)蛋白(Dkk)-1的升高及連接蛋白(Cx)43、β-連環(huán)蛋白、ALP和Runx2等成骨分化相關(guān)指標(biāo)的降低。Cx43/miR-206軸可通過影響Wnt/β-連環(huán)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控成骨分化。

2.2 影響骨代謝的miRNA

2.2.1 miR-34a

Zha等[25]和Kang等[26]分別使用地塞米松處理小鼠BMSC,結(jié)果顯示BMSC細(xì)胞的增殖能力和成骨分化能力均明顯下降，而預(yù)先轉(zhuǎn)染miR-34a的BMSC發(fā)生上述改變的程度則相對較輕，提示miR-34a具有促進成骨的作用。Peng等[27]先建立大鼠SONFH模型，再分別通過骨髓腔注射miR-34a類似物、抑制劑和陰性對照劑的方式對上述模型予以干預(yù)，微CT和組織學(xué)檢查結(jié)果均顯示miR-34a類似物干預(yù)組大鼠股骨頭骨量增加；進一步研究則證實，miR-34a實現(xiàn)該效應(yīng)的機制是靶向抑制Tgif2，進而調(diào)控骨保護蛋白(OPG)/核因子-κB受體活化因子(RANK)/核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，提示miR-34a參與SONFH的骨代謝過程。

2.2.2 miR-145

Tian等[28]通過研究敲除miR-145的兔SONFH模型發(fā)現(xiàn)，Bcl-2、β-連環(huán)蛋白的表達水平升高，caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白的表達水平則降低，提示沉默miR-145的表達可抑制成骨細(xì)胞凋亡。Zhao等[29]通過大鼠SONFH模型和體外實驗發(fā)現(xiàn)，OPG是miR-145的直接作用靶點，敲除miR-145可直接抑制OPG/RANK/RANKL信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，是促進SONFH修復(fù)的有效手段。

2.2.3 其他

Li等[30]研究發(fā)現(xiàn)，SONFH終末期miR-195-5p在塌陷區(qū)域組織的表達明顯下調(diào)，提示miR-195-5p可能與成骨細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程密切相關(guān)。Wei等[31]分別通過體外實驗和動物實驗證實，miR-320通過靶向抑制細(xì)胞色素P450(CYP)家族的CYP1A2分子影響成骨細(xì)胞代謝，可延緩SONFH早期進展。

2.3 影響血管生成的miRNA

2.3.1 miR-34a

除參與骨代謝外，miR-34a也可促進SONFH患者微循環(huán)血管生成。Zha等[25]使用地塞米松干預(yù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，結(jié)果顯示可降低其增殖能力、遷移能力和成管能力，而轉(zhuǎn)染miR-34a則可減弱上述改變。該研究結(jié)果表明miR-34a具有體外成血管效應(yīng)，但尚缺乏動物實驗證據(jù)支持，也未涉及相關(guān)機制探討。

2.3.2 miR-145

Tian等[28]在敲除miR-145的兔SONFH模型中檢測血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)，結(jié)果顯示VEGF和bFGF的表達水平均升高，表明沉默miR-145的表達可促進成血管因子產(chǎn)生。

2.3.3 miR-210

目前認(rèn)為，微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞損傷是SONFH的致病機制之一。miR-210已被證實具有促進血管形成的作用[32-33]。Yamasaki等[34]研究發(fā)現(xiàn)，SONFH患者的miR-210、VEGF、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-7和MMP-2的表達量均高于對照組，且miR-210主要在產(chǎn)生血管性血友病因子(vWF)的壞死區(qū)域周圍表達，而細(xì)胞內(nèi)VEGF的表達量始終與miR-210的表達量呈正相關(guān)。Yuan等[35]研究發(fā)現(xiàn)，miR-210在SONFH患者中表達上調(diào)，并通過表觀遺傳分析證實miR-210的上調(diào)與其基因片段中兩個CpG位點的去甲基化相關(guān)，去甲基化處理可促進miR-210和VEGF等成血管相關(guān)因子的表達。miR-210在SONFH患者中的成血管作用已得到充分驗證。

3 miRNA對SONFH的潛在診療價值

鑒于miRNA與SONFH關(guān)系密切，循環(huán)血中的miRNA有可能成為SONFH的診斷標(biāo)志物。有研究利用高通量測序分別對系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)伴SONFH患者、單純SLE患者及健康人血清中的miRNA水平進行篩選和分析后發(fā)現(xiàn)，與單純SLE患者和健康人相比，SLE伴SONFH患者的27種血清miRNA的差異性表達更為明顯[36-37]。Li等[37]進一步對上述miRNA進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析，發(fā)現(xiàn)差異性表達的miRNA主要靶向通路多與成骨分化、骨代謝和成血管通路有關(guān)。Wei等[38]通過qRT-PCR實驗證實，SONFH患者血清中miR-10a-5p水平顯著升高，而miR-423-5p水平顯著降低，提示全基因組miRNA表達譜篩查可能成為診斷SONFH的另一有效方法。

目前治療研究主要聚焦于miRNA對大鼠和兔SONFH模型的干預(yù)實驗。考慮到安全性，miRNA輔助或應(yīng)用于臨床治療仍有待更深層次的評估。

4 結(jié)語

目前已有大量差異性表達的miRNA在SONFH患者組織或血清、動物模型和體外模型中被確認(rèn)。盡管很多研究通過體內(nèi)外實驗均證實，部分miRNA在SONFH發(fā)展中有特異性作用的靶點及其可調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，但鮮有研究通過1種發(fā)病機制或1條信號通路將諸多相關(guān)的miRNA聯(lián)系起來。上述研究結(jié)果為進一步認(rèn)識SONFH的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸機制提供了新思路，也為miRNA在該疾病中的臨床應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。今后，該領(lǐng)域的研究應(yīng)更加系統(tǒng)和深入地闡述多種miRNA之間或miRNA與其他非編碼RNA之間的關(guān)系，以及它們在SONFH中的交互作用和觸發(fā)的級聯(lián)反應(yīng)，為SONFH的預(yù)防和治療提供新靶點，最終造福患者。