靜電紡絲技術在纖維環(huán)組織工程支架中的應用進展

劉晨 張玙 肖良 趙泉來 徐宏光

椎間盤退行性疾病是骨科常見疾病，其發(fā)病率及致殘率均較高，可能嚴重影響患者生活質(zhì)量[1-2]。目前該類疾病的治療方法主要有保守治療和手術治療兩大類。椎間融合術雖被認為是首選治療方法，卻無法終止椎間盤退變。此外，由椎間融合術導致的脊柱穩(wěn)定性改變甚至可能引發(fā)或加重相鄰節(jié)段退變，從而導致更嚴重的脊柱退行性疾病。近年的研究表明，通過以組織工程方式培育的仿生椎間盤替代病變椎間盤的方法可用于治療椎間盤退行性疾病，其應用前景廣闊[3-4]。此外，對組織工程方法治療髓核退變的研究也取得一定進展。許多研究認為，如果髓核外纖維環(huán)損傷不能得到有效修復，椎間盤退變治療終究會失敗。因此，有關纖維環(huán)組織工程的研究越來越受關注。

用組織工程技術制備的纖維環(huán)由支架材料、種子細胞和生長因子3部分構(gòu)成。支架是組織工程化纖維環(huán)的重要組成部分。理想的纖維環(huán)支架應具備以下性能：①良好的生物相容性，種子細胞可以在支架材料上黏附并增殖；②合適的機械力學性能；③仿生于天然細胞外基質(zhì)的纖維組織結(jié)構(gòu)，如合適的孔隙率和相連的孔形態(tài)；④纖維環(huán)組織的降解速率與再生速率相匹配。只有特殊的制備工藝才可以使纖維環(huán)支架達到上述要求。

靜電紡絲技術是一種特殊的纖維制造工藝。該工藝通過電場作用將針頭處的聚合物液滴由球形變?yōu)閳A錐形(即“泰勒錐”)，再通過圓錐尖端延展得到纖維細絲，最終生產(chǎn)出直徑為微米級及納米級的聚合物細絲[5]。靜電紡絲纖維支架的結(jié)構(gòu)類似于天然的細胞外基質(zhì)，且具有較高的表面積/容積比率，有利于種子細胞的黏附、增殖和分化[6]，近年來在各類組織工程支架的研究中備受關注。

1 靜電紡絲支架材料選擇

材料選擇在纖維環(huán)組織工程中至關重要，目前可用于靜電紡絲技術制備纖維環(huán)組織工程支架的材料主要分為兩大類，即高分子合成材料和復合材料。

1.1 高分子合成材料

人工合成材料具有低免疫原性和結(jié)構(gòu)均一性，且原材料來源可靠，近些年來越來越受關注。目前用于纖維環(huán)組織工程的高分子合成材料主要有聚氨酯(PECUU)、聚羥基乙酸、聚乳酸和聚己內(nèi)酯(PCL)等。Zhu等[7]利用不同彈性模量的PECUU制備靜電紡絲三維支架，以模擬實際纖維環(huán)徑向力學梯度差異，并在支架上種植兔纖維環(huán)源干細胞(AFSC)，發(fā)現(xiàn)AFSC可在不同彈性模量的靜電紡絲上分化成類似纖維環(huán)內(nèi)、中、外區(qū)的細胞。對植入小鼠體內(nèi)的不同彈性模量的靜電紡絲支架開展降解實驗，則可發(fā)現(xiàn)PECUU具有較好的降解能力。Nesti等[8]以左旋聚乳酸(PLLA)為支架材料制備纖維環(huán)組織工程支架，并在支架上接種人骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)，通過免疫組化和二甲基亞甲基藍法可以檢測到膠原及糖胺聚糖的分泌。Nerurkar等[9]將PCL通過靜電紡絲技術制備成厚度為1 mm、長寬分別為30 mm和5 mm的矩形定向靜電紡絲纖維支架，并在支架上種植牛間充質(zhì)干細胞，培養(yǎng)120 d后發(fā)現(xiàn)支架上沉積了豐富的膠原及糖胺聚糖，同時膠原呈現(xiàn)定向排列，結(jié)果表明靜電紡絲技術非常適合于制備纖維軟骨支架材料。

1.2 復合材料

纖維環(huán)組織工程對支架性能的要求是多方面的，單一基材通常很難滿足實際需求。眾多學者嘗試通過靜電紡絲技術將兩種具有不同優(yōu)勢的材料制備成復合靜電紡絲支架，使其既具備與天然材料相近的生物相容性，又具有合成材料的優(yōu)越力學性能和抗拉強度，從而可以更好地為纖維環(huán)組織工程服務。Ma等[10]通過共軛紡絲的方式用明膠和聚乳酸制備三維纖維支架，電鏡檢查顯示該支架具有大的孔徑和較高的孔隙率。BMSC在支架上可較好地增殖，其Ⅰ型膠原蛋白表達率也較高。

2 靜電紡絲纖維結(jié)構(gòu)及性質(zhì)

纖維環(huán)的組織結(jié)構(gòu)對功能影響較大，通常較為復雜，系由15～25層的膠原纖維以斜交層疊方式圍繞在髓核周圍形成，每層膠原纖維均具有高度的取向性[11]。斜交層疊結(jié)構(gòu)對維持髓核的初始形態(tài)和位置并保持椎間盤內(nèi)生理壓力至關重要[12]。組織工程化纖維環(huán)支架的制備應盡量模擬實際纖維環(huán)的斜交層疊結(jié)構(gòu)，從而實現(xiàn)仿生支架的結(jié)構(gòu)及力學模擬目的。

2.1 靜電紡絲纖維取向性

Lazebnik等[13]通過靜電紡絲法制備定向的PCL納米纖維，以模擬纖維環(huán)的纖維取向特性。Koepsell等[14]為研究不同速度滾軸制備的納米纖維的取向性特點，用PCL構(gòu)建取向性納米纖維支架，發(fā)現(xiàn)接收纖維的滾軸轉(zhuǎn)速越快，其構(gòu)建支架中的納米纖維定向性就越強，平行于納米纖維方向的力學強度也越高；在定向納米纖維支架上種植的種子細胞分泌的纖維環(huán)細胞外基質(zhì)含量明顯高于無規(guī)支架。Koepsell等[15]用PCL制備定向、無規(guī)及兩頭圓鈍的靜電紡絲支架，并分別在支架上種植豬纖維環(huán)細胞，發(fā)現(xiàn)兩頭圓鈍的靜電紡絲支架能夠更好地促進細胞黏附，同時證明定向結(jié)構(gòu)纖維可以促進細胞定向排布。Liu等[16]應用靜電紡絲法將PECUU分別制備成定向和無規(guī)靜電紡絲纖維支架，并將兔AFSC種植在支架上，發(fā)現(xiàn)AFSC在定向靜電紡絲纖維上呈定向排布，其分泌的Ⅰ型膠原蛋白亦呈定向排布，且其對Ⅰ型膠原蛋白和蛋白聚醣基因的表達更多。

2.2 靜電紡絲纖維斜交層疊結(jié)構(gòu)

研究發(fā)現(xiàn)，模擬斜交層疊結(jié)構(gòu)對纖維環(huán)組織工程具有重要意義。有學者為分別模擬纖維環(huán)和髓核，制備了由斜交層疊結(jié)構(gòu)的PCL和瓊脂糖凝膠組成的雙相支架，在施加壓應力刺激的同時分別對牛纖維環(huán)細胞進行短期培養(yǎng)(1周)和長期培養(yǎng)(6周)，發(fā)現(xiàn)細胞在規(guī)則斜交結(jié)構(gòu)支架上分泌的細胞外基質(zhì)同樣表現(xiàn)出斜交層疊結(jié)構(gòu)[17]。上述研究結(jié)果為構(gòu)建仿生的組織工程化椎間盤提供了新思路。此外，有學者將混合牛纖維環(huán)細胞的斜交層疊結(jié)構(gòu)PCL靜電紡絲支架植入大鼠尾椎間盤以構(gòu)建椎間盤置換動物模型，發(fā)現(xiàn)該支架可穩(wěn)定地存在于尾椎中，且牛纖維環(huán)細胞可以遷移至支架[18]。上述研究表明，在支架材料制備過程中精確模擬實際纖維環(huán)組織微觀結(jié)構(gòu)有助于實現(xiàn)組織工程化纖維環(huán)的有效構(gòu)建。

3 靜電紡絲復合細胞因子

在多數(shù)研究中，組織工程化纖維環(huán)構(gòu)建尚不能令人滿意，主要因為膠原和糖胺聚糖在支架中的含量與其在實際纖維環(huán)基質(zhì)中的含量差距較大。細胞生長因子具有調(diào)節(jié)細胞增殖、分化及細胞外基質(zhì)代謝的作用，胰島素生長因子(IGF)-1、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1、成纖維生長因子(FGF)-2和TGF-β3等可參與纖維環(huán)細胞生長代謝，在組織工程化纖維環(huán)構(gòu)建中具有重要作用[19-22]。細胞因子是纖維環(huán)組織工程的重要組成部分。

靜電紡絲共紡方法即在支架材料中加入生長因子，不僅可以達到生長因子緩釋的目的，而且能夠促進纖維環(huán)細胞外基質(zhì)的分泌。Vadalà等[23]通過將TGF-β1以20 ng：1 g的比例溶于質(zhì)量分數(shù)為13%的PLLA的方式制備TGF-β1功能性PLLA靜電紡絲支架，并以純PLLA靜電紡絲支架作為對照，結(jié)果證實實驗組TGF-β1于4 d后開始釋放，并于第7 d達到緩釋平衡；將牛纖維環(huán)細胞分別種植于上述兩種支架上，發(fā)現(xiàn)實驗組緩釋TGF-β1的PLLA靜電紡絲支架上牛纖維環(huán)細胞可以分泌更多的膠原及糖胺聚糖。Sahoo等[24]通過同軸共紡方式將堿性成纖維生長因子(bFGF)紡至聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)靜電紡絲纖維支架，證實bFGF的緩慢釋放有助于提高BMSC的成纖維分化能力，并可促進Ⅰ型膠原蛋白和纖維蛋白等合成。上述研究表明，將生長因子通過共紡方式加入靜電紡絲支架材料中，可通過生長因子的緩慢釋放促進細胞外基質(zhì)的分泌，使組織工程化纖維環(huán)更接近于實際纖維環(huán)的組分。

將生長因子與高分子聚合物混紡可以改善支架性能，而在靜電紡絲支架表面修飾生長因子則可以達到促進基質(zhì)分泌的目的。Guo等[25]制備PECUU靜電紡絲支架，并用兔BMSC作為種子細胞模擬實際纖維環(huán)細胞外基質(zhì)的表達，發(fā)現(xiàn)向細胞培養(yǎng)基添加質(zhì)量濃度為10 ng/mL的TGF-β3可使AFSC表達Ⅰ型膠原蛋白、Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚醣基因的能力與BMSC在支架上的表達能力接近。Nesti等[8]以PLLA靜電紡絲制備纖維環(huán)支架，以透明質(zhì)酸(HA)作為髓核支架，構(gòu)建成雙相支架來模擬實際椎間盤結(jié)構(gòu)；將人間充質(zhì)干細胞種植在該支架上，并在添加10 ng/mL的TGF-β后對細胞培養(yǎng)28 d，免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅸ型膠原蛋白和糖胺聚糖可持續(xù)分泌，所得基質(zhì)接近于實際椎間盤組織。

無論是通過共紡方式還是支架表面修飾方式，生長因子均可提高支架與種子細胞間的相互作用，促進細胞外基質(zhì)分泌。但是上述生長因子在體內(nèi)實驗效果仍需要體內(nèi)實驗予以驗證。

4 結(jié)語

用靜電紡絲技術制備的纖維紡絲支架具有表面積大、孔連通性好、孔隙率高等特點，有利于細胞黏附及營養(yǎng)物質(zhì)滲入[26]。由于靜電紡絲支架可模擬天然的細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，因此利用該技術制備的組織工程支架受到越來越多的關注。雖然靜電紡絲技術在制備組織工程化纖維環(huán)支架方面已經(jīng)取得一定的進展，但隨著組織工程對支架材料的要求不斷提升，該項技術仍有待進一步完善。目前采用該項技術制備的纖維環(huán)組織工程支架仍處于實驗室階段，其生產(chǎn)效率較低，且制備過程中影響因素較多，各批次產(chǎn)品難以保證穩(wěn)定，且國內(nèi)外均尚未有利用靜電紡絲技術將膠原、藻酸鹽等天然材料制備成纖維環(huán)組織工程支架的文獻報道。有關天然生物材料與高分子合成材料混紡的報道亦少之又少。此外，大多數(shù)研究僅限于體外實驗，有關纖維環(huán)組織修復的體內(nèi)實驗研究不多。因此，有必要進一步開發(fā)更為先進的靜電紡絲技術，制備性質(zhì)更加穩(wěn)定的天然材料紡絲，并構(gòu)建具有可控三維結(jié)構(gòu)的納米纖維支架,從而更好地實現(xiàn)仿生纖維環(huán)細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。