基于多元統(tǒng)計分析的不同產(chǎn)地紅花椒揮發(fā)性成分差異分析

王思思，鐘葵，史波林，汪厚銀，張璐璐，劉龍云，趙鐳＊

（1.西南交通大學 生命科學與工程學院，成都 610031；2.中國標準化研究院 食品與農(nóng)業(yè)標準化研究所，北京 102200）

花椒（Zanthoxylum bungeanumMaxim.）屬蕓香科花椒屬落葉小喬木或灌木，在我國已有2000多年的栽培歷史。作為一種食藥兩用經(jīng)濟作物，花椒在我國分布極廣，在華東、華北、華中、西南、西北等地區(qū)均有栽培。受生態(tài)環(huán)境影響，不同產(chǎn)地花椒品質特征具有明顯差異，這種差異導致其在應用價值、價格上差別較大［1－5］。

香氣是花椒品質評價的重要指標之一，易受氣候條件（日照時間、降水量、干燥度、氣溫等）以及土壤特性等的影響，因此不同產(chǎn)地花椒中揮發(fā)性物質的組成和含量存在差異。樊丹青等［6］采用氣相色譜-質譜聯(lián)用技術（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）對甘肅、四川等6個產(chǎn)地紅花椒的揮發(fā)性成分進行了分析，結果表明不同產(chǎn)地紅花椒中芳樟醇、乙酸芳樟酯等主要成分存在差異。陳光靜等［7］也采用GC-MS對陜西、甘肅、四川3個省8個產(chǎn)地的紅花椒揮發(fā)物進行了比較，發(fā)現(xiàn)21個共有成分在不同產(chǎn)地紅花椒中存在較大的差異，非共有成分的含量均比較低。

為進一步擴大研究樣本范圍，并將物質構成分析與整體模式識別和數(shù)據(jù)挖掘相結合，更好地揭示我國紅花椒主產(chǎn)區(qū)、產(chǎn)地紅花椒的主要差異，本研究收集了我國西南、西北、華北、華東4大花椒主要產(chǎn)區(qū)16個不同產(chǎn)地紅花椒樣品。首先采用HeraclesⅠ快速氣相電子鼻技術從樣品揮發(fā)性組分整體模式特征上進行分類，再采用GC-MS結合非監(jiān)督學習算法主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚類分析對樣品進行具體物質構成上的區(qū)分，同時運用偏最小二乘判別分析（partial least squares-discrimination analysis，PLS-DA）進行變量重要性因子分析（variable importance for the projection，VIP），尋找區(qū)分不同產(chǎn)地花椒樣品的重要貢獻性物質，以期為花椒產(chǎn)地識別、定向應用等提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

花椒樣品均為大紅袍花椒，其中四川花椒樣品由成都珪一食品開發(fā)股份有限公司提供，其余樣品均由陜西省韓城市花椒管理局提供，詳細信息見表1。

表1 花椒樣品產(chǎn)地信息Table1 The origin information of Zanthoxylum bungeanum

1.2 儀器及試劑

HeraclesⅠ快速氣相電子鼻（配有Combi PLA自動進樣器，瑞士CTC公司） 法國Alpha M.O.S公司；7890A-5975C氣相色譜-質 譜 聯(lián) 用 儀、2cm 50／30μm PDMS／DVB／CAR萃取頭、C6～C16 正構烷烴標品 美國Agilent科技公司；FW100型高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；40目標準檢驗篩 浙江省上虞市沙篩廠；AL 104-1C型電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；手動SPME進樣器 美國Supelco公司；PC-420D磁力加熱攪拌器 美國Corning公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 HeraclesⅠ測定條件

1.3.1.1 樣品制備

依據(jù)GB／T 12729.2—2008《香辛料和調味品取樣方法》進行取樣［8］，去除花椒中葉、柄、籽、閉目椒及其他雜質，粉碎（約1min）過40目篩。準確稱取0.20g花椒粉于20mL頂空瓶中，加蓋密封待測，每個樣品重復測定3次。

1.3.1.2 檢測參數(shù)及程序

載氣（H2），流速160mL／min；頂空時間600s，頂空溫度60℃；進樣量500μL，進樣速率500μL／s，進樣口溫度250℃；捕集肼溫度35℃，解吸溫度250℃；柱溫40℃，保持1s，以3℃／s升至250℃，保持30s；氫火焰離子化檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）溫度280℃；采集時間100s。

將裝有待測樣品的頂空瓶放入樣品托盤中，每3個平行后加1個空白樣（空瓶），以消除對下一個樣品的影響。

1.3.2 GC-MS測定條件

1.3.2.1 樣品制備

花椒粉制備方法同上，準確稱取50mg花椒粉于20mL頂空瓶中密封待測，每個樣品平行測定3次。

1.3.2.2 檢測參數(shù)及程序

固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）條件：萃取溫度60℃，頂空時間20min，萃取時間30min。

GC-MS條件：HP-5MS毛細管色譜柱（30m×0.25mm，0.25mm）；載氣（He），載氣流速1.5mL／min；進樣口溫度250℃；柱溫65℃，以25℃／min升至90℃，保持1min，以1℃／min升至105℃，保持2min，以3℃／min升至200℃，保持2min，以30℃／min升至250℃，保持2min；分流比20∶1。

質譜參數(shù)：接口溫度280℃；離子源溫度230℃；電子電離源；電子能量70eV；質量掃描范圍（m／z）35～500。

將吸附完成的SPME進樣針迅速插入GC進樣口，推出萃取頭解吸附15min，同時啟動GC進行數(shù)據(jù)采集。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

1.4.1 GC-MS定性定量

通過NIST 14.0數(shù)據(jù)庫檢索結合保留指數(shù)（retention index，RI）對GC-MS檢測結果進行鑒定，采用峰面積歸一法對目標化合物進行半定量分析。

1.4.2 統(tǒng)計分析

運用SPSS 19.0對HeraclesⅠ響應結果進行系統(tǒng)聚類分析，MetaboAnalyst繪制熱圖，SIMCA-P 11.5軟件對GC-MS數(shù)據(jù)進行PCA和PLS-DA分析，GraphPad Prism 5.0繪圖。

1.4.3 保留指數(shù)計算

式中：Ix為保留指數(shù)；n為碳數(shù)；tr′（x）為保留在碳數(shù)n和n＋1正構烷烴之間目標化合物的保留時間；tr′（n）為碳數(shù)為n的正構烷烴的保留時間；tr′（n＋1）為碳數(shù)為n＋1的正構烷烴的保留時間。

2 結果與分析

2.1 HeraclesⅠ響應特征分析

HeraclesⅠ快速氣相電子鼻是結合傳統(tǒng)氣相色譜功能和電子鼻模式識別功能的分析儀器，由自動進樣系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)（包括2根不同極性色譜柱和2個氫火焰檢測器）和數(shù)據(jù)接收系統(tǒng)組成。集合了氣相色譜高效分離和電子鼻快速識別的特點，常用于樣品中揮發(fā)性組分的快速分析［9－11］。

采用HeraclesⅠ對樣品進行分析，得到保留時間-相對含量分布圖，見圖1。

圖1 紅花椒保留時間-相對含量分布圖Fig.1 Distribution map of retention time-relative content of Zanthoxylum bungeanum

圖1中橫坐標為保留時間，代表信號響應點；縱坐標為相對含量，代表響應強度。16個產(chǎn)地的紅花椒樣品共有56個響應點，色譜柱1上有27個響應點，色譜柱2上有29個響應點。其中高于平均相對含量1.78%的響應點共有14個（18.63-1，21.32-1，22.97-1，26.29-1，28.95-1，35.90-1，16.89-2，20.49-2，22.34-2，24.77-2，27.37-2，30.18-2，33.00-2，37.60-2），陜西、四川地區(qū)（Z4，Z11～Z16）有8個，河北地區(qū)（Z1）有9個，山西、山東、甘肅地區(qū)（Z2，Z3，Z5～Z10）有10個；高于10%的響應點共有6個（22.97-1，26.29-1，35.90-1，22.34-2，24.77-2，37.60-2），其中甘肅臨夏積石山有2個響應點，山東萊蕪萊城區(qū)有3個響應點，其他地區(qū)均有4個響應點。高于20%的響應點共有2個（22.97-1和24.77-2），陜西、青海、甘肅地區(qū)無高于20%的響應點，其他地區(qū)均有2個，見圖1。

采用系統(tǒng)聚類對16個產(chǎn)地紅花椒樣品進行聚類分析，結果見圖2。

圖2 紅花椒系統(tǒng)聚類分析圖Fig.2 Hierarchical cluster analysis diagram of Zanthoxylum bungeanum

設定距離為10時，16個樣品可聚為3類。其中陜西、甘肅、青海地區(qū)聚為一類（Z3～Z7），代表我國西北花椒產(chǎn)區(qū)；河北、山西、山東地區(qū)聚為一類（Z1，Z2，Z8～Z10），代表我國華北、華東花椒產(chǎn)區(qū)；四川地區(qū)單獨聚為一類（Z11～Z16），代表我國西南花椒產(chǎn)區(qū)。三大類樣品在雙極色譜響應圖上的差別主要表現(xiàn)在響應點35.90-1和37.60-2的響應強度上，西北地區(qū)樣品在這2個響應點上的響應值均高于10%，而西南地區(qū)樣品響應值在5%～10%之間，華北、華東地區(qū)樣品響應值則低于5%，呈現(xiàn)為有明顯差異的雙極色譜響應雷達圖，見圖3。

圖3 紅花椒雙極色譜響應雷達圖Fig.3 Bipolar chromatographic response radar map of Zanthoxylum bungeanum

2.2 GC-MS定性定量分析

快速氣相電子鼻的結果顯示了在一類結構性質相似的物質構成上樣品間存在差異，為進一步確定哪些物質構成及其含量存在差異，進一步采用GC-MS對16個產(chǎn)地紅花椒揮發(fā)性組分進行了定性和定量分析。

通過NIST數(shù)據(jù)庫檢索（匹配度≥80%）對目標化合物進行了初步判定，再通過對比計算所得RI與文獻中的RI對目標化合物進一步確定［12，13］，并采用面積歸一化法進行半定量分析。運用MetaboAnalyst繪制不同產(chǎn)地樣品GC-MS分析熱圖見圖4。

圖4 紅花椒GC-MS測定結果熱圖Fig.4 Thermal map of GC-MS determination of Zanthoxylum bungeanum

熱圖中顏色由淺到深表示化合物含量依次增加。16個產(chǎn)地紅花椒共鑒定出62個組分，主要為烯烴類（31種）、醇類（17種）、酯類（8種）以及少量其他醛、酮類（6種）化合物。其中主要揮發(fā)性物質有D-檸檬烯、芳樟醇、γ-萜品醇、乙酸芳樟酯、檜烯、β-月桂烯等，與陳光靜等報道的紅花椒中主要揮發(fā)性組分有月桂烯、檸檬烯、桉樹醇、芳樟醇、γ-萜品醇以及劉飛等報道的芳樟醇、乙酸芳樟酯、α-松醇、γ-萜品醇、檸檬烯的研究結果基本一致。與Zhu、Yang等［14，15］報道的乙酸芳樟酯、芳樟醇、檸檬烯相比，本研究鑒定出的γ-萜品醇、檜烯、β-月桂烯等物質的相對含量較高，這可能與所采用的提取方法不同有關。熱圖聚類結果表明16個不同產(chǎn)地紅花椒可以分為三類，其中陜西、甘肅、青海地區(qū)為一類（Z3～Z7）；河北、山西、山東地區(qū)為一類（Z1，Z2，Z8～Z10）；四川地區(qū)單獨聚為一類（Z1～Z16），與上述Heracles聚類結果一致。

2.3 揮發(fā)性物質PCA及PLS-DA分析

PCA分析是利用降維思想，將原來的眾多變量通過降維、除噪轉化為幾個綜合指標用于反映原來變量的信息［16，17］。利用SIMCA-P對16個不同產(chǎn)地紅花椒的GC-MS結果進行分析，繪制不同樣品得分圖，見圖5。

圖5 GC-MS結果PCA得分圖Fig.5 PCA score plot of GC-MS results

由圖5可知，華北、華東地區(qū)（Z1，Z2，Z8～Z10）、西北地區(qū)（Z3～Z7）、西南地區(qū)（Z11～Z16）仍然可以有效區(qū)分，與上述聚類分析結果一致。

由于PCA、聚類分析都是一種非監(jiān)督的學習算法，即在不給定樣品標簽的情況下進行建模，側重于描述樣品分類趨勢，不能消除組內噪音，不利于觀察不同類別之間的差異來源［18，19］。因而進一步在PCA和聚類分析的基礎上采用一種有監(jiān)督的學習算法PLS-DA進行建模。首先依據(jù)聚類結果對樣品預設分組，使用SIMCA-P軟件建模，以消除組內噪音而突出組間的差異［20，21］，得分圖見圖6。

由圖6可知，三大類不同產(chǎn)地紅花椒得到有效區(qū)分，且聚類效果略好于PCA，表明PLS-DA模型可以有效消除組內噪音和背景噪音。基于PLS-DA模型，對不同組別樣品中的差異物進行分析，繪制VIP棒狀圖，見圖7。VIP值常用于評價PLS-DA模型中變量的重要程度，即變量在不同類別樣品區(qū)分中的重要程度，值越大表明該變量越重要，通常認為VIP＝1.5的變量對樣品區(qū)分有相對較大的貢獻［22－24］。

圖6 GC-MS結果PLS-DA得分圖Fig.6 PLS-DA score plot of GC-MS results

圖7 PLS-DA模型的VIP圖Fig.7 VIP plot of PLS-DA model

由圖7可知，16個紅花椒樣品區(qū)分貢獻最大的物質為γ-萜品烯，其VIP值為1.506，其次為大根香葉烯（VIP＝1.415）、α-依蘭油烯（VIP＝1.399）、α-松油烯（VIP＝1.392）、反式-2-蒈烯-4-醇（VIP＝1.351）、β-合金歡烯（VIP＝1.331）等。VIP得分說明γ-萜品烯、大根香葉烯、α-依蘭油烯、α-松油烯、反式-2-蒈烯-4-醇、β-合金歡烯是區(qū)分華北、華東地區(qū)、西南地區(qū)、西北地區(qū)這三類紅花椒主要產(chǎn)區(qū)產(chǎn)地樣品的特征性揮發(fā)性成分。

對不同地區(qū)樣品中這6種物質的相對含量進行分析，結果見圖8。

圖8 VIP得分較高的6種物質含量分布圖Fig.8 Distribution map of six substances with higher VIP score

由圖8可知，第一類地區(qū)（華北、華東）紅花椒中γ-萜品烯、α-松油烯含量均高于其他兩類地區(qū)，α-依蘭油烯含量與第三類地區(qū)（西南）水平相當且高于第二類地區(qū)（西北），大根香葉烯和β-合金歡烯含量低于第三類地區(qū)而高于第二類地區(qū)；第二類地區(qū)γ-萜品烯、大根香葉烯、α-松油烯、α-依蘭油烯、反式-2-蒈烯-4-醇、β-合金歡烯含量均低于第一類地區(qū)，γ-萜品烯、α-松油烯含量高于第三類地區(qū)；第三類地區(qū)大根香葉烯、β-合金歡烯含量高于其他兩類地區(qū)。整體而言，華北、華東地區(qū)紅花椒中大根香葉烯、γ-萜品烯、α-依蘭油烯、α-松油烯、β-合金歡烯、反式-2-蒈烯-4-醇6種物質含量高，而西北地區(qū)含量高的物質為γ-萜品烯和α-松油烯，西南地區(qū)花椒中大根香葉烯、α-依蘭油烯、β-合金歡烯、反式-2-蒈烯-4-醇含量高。

花椒揮發(fā)性組分相對含量的不同賦予其特有的香氣特征。6種特征物中，γ-萜品烯具有松木香、甜柑橘香等香氣特征，大根香葉烯具有青香、木香，α-松油烯具有檸檬似香氣，β-合金歡烯具有花香、木香、青香、膏香等香氣特征［25，26］。華北、華東地區(qū)中 γ-萜品烯、α-松油烯、β-合金歡烯、大根香葉烯含量較高，表現(xiàn)為偏柑橘香、檸檬香、木香、花香、青香等綜合香氣特征。西北地區(qū)中γ-萜品烯、α-松油烯含量相對較高，說明其香氣偏柑橘香、檸檬香。西南地區(qū)中大根香葉烯、β-合金歡烯含量相對較高，說明其香氣偏木香、花香、青香等香氣特征。

3 結論

本研究以我國4個花椒主要產(chǎn)區(qū)的16個花椒主要產(chǎn)地的紅花椒作為研究對象，首先采用快速氣相電子鼻對16個產(chǎn)地的紅花椒揮發(fā)性組分指紋信息進行分析，以探討揮發(fā)性組分與產(chǎn)地的相關性。在此基礎上采用GC-MS技術對不同產(chǎn)地花椒樣品的揮發(fā)性組分進行鑒定以分析不同產(chǎn)地樣品揮發(fā)性組分的差異。通過多元統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)我國不同產(chǎn)地紅花椒樣品可以分為三類，其中以四川為代表的西南地區(qū)為一類，以陜西、青海、甘肅為代表的西北地區(qū)一類，以河北、山西、山東為代表的華北、華東地區(qū)為一類，這與我國地理分區(qū)基本吻合，表明生態(tài)環(huán)境對紅花椒的香氣品質有顯著影響。

在對產(chǎn)地進行區(qū)分后，對PLS-DA模型的VIP值進一步展開分析以探討不同地區(qū)樣品揮發(fā)性物質特征差異。結果表明：γ-萜品烯、大根香葉烯、α-松油烯、α-依蘭油烯、反式-2-蒈烯-4-醇、β-合金歡烯可以區(qū)分不同產(chǎn)區(qū)紅花椒樣品，是樣品間香氣差異來源。西南地區(qū)紅花椒中大根香葉烯、α-依蘭油烯、反式-2-蒈烯-4-醇、β-合金歡烯含量高，西北地區(qū)紅花椒中γ-萜品烯、α-松油烯含量高，華北、華東地區(qū)紅花椒中γ-萜品烯、大根香葉烯、α-松油烯、α-依蘭油烯、反式-2-蒈烯-4-醇、β-合金歡烯含量高。通過對6種物質中4種具有香氣特征物質進行分析，發(fā)現(xiàn)華北、華東地區(qū)花椒偏柑橘香、檸檬香、木香、花香、青香；西北地區(qū)花椒偏柑橘香、檸檬香；西南地區(qū)花椒偏木香、花香、青香等。