芒果皮多酚的微波輔助提取及體外抗氧化活性研究

劉煥云，王艷哲，李敬，李飛

（河北經(jīng)貿(mào)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，石家莊 050061）

芒果（Mangifera indica L.），又名檬果、漭果等，其營養(yǎng)價值極高，被譽(yù)為“熱帶果王”，是世界第二大熱帶水果，在印度、巴基斯坦和中國的廣東、廣西、海南等地均有廣泛種植。芒果皮是其鮮食及加工過程中的主要副產(chǎn)物，約占鮮果重的16%，一般被廢棄，既造成巨大的資源浪費(fèi)，又污染環(huán)境。國內(nèi)外研究表明芒果皮中富含多酚類化合物［1－3］、膳食纖維、果膠等活性物質(zhì)，具有消除有害自由基、抗氧化、抑菌、食品保鮮等功效［4－6］，可廣泛用于食品工業(yè)。杜瑜欣等綜述了甘蔗多酚在食品、調(diào)味品中的應(yīng)用［7］，黃和等的實驗結(jié)果表明番石榴多酚對蝦肉糜有較好的保鮮效果［8］，目前有關(guān)微波技術(shù)在芒果皮多酚類物質(zhì)提取及其保鮮方面的應(yīng)用尚未見報道。本研究以臺農(nóng)芒果皮為原料，通過單因素及正交試驗對微波輔助法提取芒果多酚的工藝條件進(jìn)行了考察和優(yōu)化，并采用兩種體外抗氧化試驗方法，對芒果皮多酚的抗氧化活性進(jìn)行了研究，并與2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）作對比，為開發(fā)利用芒果皮作為天然、高效的防腐保鮮劑提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料及試劑

市售海南產(chǎn)“臺農(nóng)1號”芒果，取皮，洗凈，于60℃烘干后粉碎并過60目篩，得芒果皮粉，干燥、避光、儲存?zhèn)溆?；市售雞蛋。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（中檢所）；乙醇、甲醇、丙酮、酒石酸鉀鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、硫酸亞鐵、鄰二氮菲、亞硝酸鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、三氯乙酸（TCA）、硫代巴比妥酸（TBA）、1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）、抗壞血酸、H2O2等，以上試劑均為分析純；配制用水為二次蒸餾水。

1.1.2 主要儀器

XFB-1000新型密封式中藥粉碎機(jī) 吉首市中誠制藥機(jī)械廠；723型分光光度計 上海光譜儀器有限公司；WD-800B格蘭仕微波爐 順德格蘭仕電器公司；離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；電子天平；恒溫水浴鍋；干燥箱等。

1.2 芒果皮多酚微波輔助提取條件的確定

1.2.1 浸提溶劑的選擇

稱取芒果皮粉1.0g（準(zhǔn)確至±0.0001g），分別加入20mL蒸餾水、50%乙醇、60%乙醇、50%甲醇、50%丙酮中，在微波功率160W下處理20s后，60℃水浴浸提30min，減壓過濾得提取液，定容至50.00mL。吸取1.00mL，顯色測定吸光度值，計算多酚提取得率。

1.2.2 浸提方法及處理條件的確定

稱取芒果皮粉1.0g（準(zhǔn)確至±0.0001g），按料液比1∶20（g／mL）加入所選浸提溶劑，分別按如下不同方法浸提：微波法（160W下處理20s）；先微波（160W處理20s）后水?。?0℃，30min）。然后同上操作，計算多酚提取得率，以確定浸提方法。分別對微波輔助提取的浸提劑體積分?jǐn)?shù)、料液比、微波功率、微波處理時間進(jìn)行單因素試驗，在此基礎(chǔ)上采用L9（34）正交試驗對微波輔助提取芒果皮多酚的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，其因素水平見表2，各試驗重復(fù)2次，取平均值。

1.3 芒果皮提取物多酚含量的測定

參照文獻(xiàn)［9］，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用酒石酸亞鐵法測定芒果皮提取物中的多酚含量，測得沒食子酸在0～100μg／mL內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：A＝0.0107c＋0.0774，A為吸光度值，c為多酚質(zhì)量濃度（μg／mL），R2＝0.9959。

1.4 芒果皮多酚抗氧化活性的測定

1.4.1 清除DPPH自由基能力的試驗

參照鄭德勇等［10］的方法，將1.50mL不同質(zhì)量濃度的芒果皮多酚樣液分別加入至2.50mL 6.5×10－5mol／L的DPPH 溶液中，混勻，避光30min后于波長517nm處測定吸光度值。以浸提劑為空白對照，等質(zhì)量濃度的BHT代替樣品作為陽性對照，每個濃度的樣品平行測定3次，取平均值。按下式計算DPPH自由基清除率：

DPPH自由基清除率（%）＝［1－（Ds－Dr）／D0］×100。

式中：Ds為加抗氧化劑后DPPH溶液的吸光度值；Dr為只加抗氧化劑及浸提劑的吸光度值；D0為只加DPPH及浸提劑的吸光度值。

1.4.2 對卵黃脂蛋白脂質(zhì)過氧化的抑制作用

按文獻(xiàn)［11］的方法制備卵黃懸液，于比色管中分別加入卵黃懸液0.20mL、不同質(zhì)量濃度的芒果皮多酚樣液0.10mL。各管再加入0.20mL 25mmol／L的FeSO4溶液，用0.1mol／L pH 值7.4的磷酸緩沖液（PBS）補(bǔ)充至2.00mL，37℃恒溫振蕩15min。取出后分別加入20%的三氯乙酸（TCA）溶液0.50mL，3500r／min離心10min沉淀蛋白質(zhì)。再分別吸取上清液2.00mL于試管中，加入0.8%的硫代巴比妥酸（TBA）1.00mL，加塞，放入沸水浴中15min。冷卻后于波長532nm處測定吸光度，對照管用60%乙醇溶液代替樣品溶液，其他與反應(yīng)管試劑相同，根據(jù)吸光度計算其抑制率［12，13］，同時以等質(zhì)量濃度的BHT作陽性對照。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多重比較用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行，平均數(shù)差異顯著性檢驗用獨(dú)立樣本T-test法進(jìn)行，同一濃度下，與對照組相比，“＊＊”表示差異極顯著（p＜0.01），“＊”表示差異顯著（p＜0.05），不標(biāo)者則為差異不顯著（p＞0.05），重復(fù)數(shù)n＝3。

2 結(jié)果與分析

2.1 芒果皮多酚提取工藝參數(shù)的確定

2.1.1 提取溶劑的確定

不同溶劑對芒果皮多酚的提取結(jié)果見表1。

表1 不同溶劑對多酚的浸提效果Table1 Effects of extraction solvents on the yield of polyphenols

由表1可知，乙醇溶液對芒果皮多酚浸提的效果較好，水提法多酚得率最小，且提取物中雜質(zhì)成分較多，不易保存，而20%以上的乙醇溶液有一定防腐功能，且相比于甲醇和丙酮無毒性，易回收，故本試驗選擇乙醇溶液作為提取溶劑。

2.1.2 微波輔助法提取工藝參數(shù)的確定

按1.2.2節(jié)方法比較了微波與微波加水浴加熱法對芒果皮多酚提取得率的影響。結(jié)果表明：微波加水浴的輔助提取法的得率較前者提高了0.57%，故本試驗選用微波輔助法。由表1可知，乙醇與水的復(fù)合體系提取多酚得率較高，且無毒性和環(huán)境污染，不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液對多酚提取得率的影響顯著，50%乙醇極顯著優(yōu)于其他；在料液比1∶20～1∶30（g／mL）時，多酚得率顯著增加，提取完全之后變化緩慢；微波處理時間在10～30s，隨著時間的延長，多酚得率顯著增加，之后下降（p＜0.01）；微波功率對多酚提取有極顯著影響（p＜0.01），功率高于320W或時間較長，多酚結(jié)構(gòu)可能會改變［14］，見表2。在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇L9（34）正交表進(jìn)行試驗，以多酚得率為評價指標(biāo)確定較佳提取工藝條件，結(jié)果見表3和表4。

表2 不同條件對多酚得率的影響Table2 The effects of different conditions on the yield of polyphenols

表3 正交試驗結(jié)果Table3 Orthogonal experimental results

表4 正交試驗的方差分析Table4 Variance analysis of orthogonal experiment

方差分析表明，A、B、D 3個因素對多酚提取得率有極顯著影響，C因素對芒果皮多酚提取得率有顯著影響。4個因素影響大小的順序為：A＞D＞B＞C。微波輔助提取芒果皮多酚較佳的工藝條件為A2B2C2D1，即芒果皮粉中加入30倍濃度為60%的乙醇溶液，微波功率160W處理30s后，于60℃水浴浸提30min，在此條件下重復(fù)驗證試驗3次，芒果皮多酚提取得率為（6.24±0.02）%。

2.2 芒果皮多酚抗氧化活性的測定

2.2.1 芒果皮多酚對DPPH自由基的清除作用

圖1 芒果皮多酚對DPPH自由基的清除能力Fig.1 DPPH radical scavenging ability of polyphenols from mango peel注：“＊＊”表示差異極顯著。

分別配制不同質(zhì)量濃度的芒果皮多酚溶液和BHT溶液進(jìn)行清除DPPH自由基試驗。由圖1可知，芒果皮多酚對DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除作用，且在試驗范圍（4.65～58.13μg／mL）內(nèi)，呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)濃度為4.65μg／mL時其清除率就達(dá)到了52.2%，說明芒果皮多酚粗提物中含有氫供體，并且可以提供氫質(zhì)子，能夠使具有高度氧化性的自由基還原。T檢驗法分析表明，在同等條件下芒果皮多酚對DPPH自由基的清除率極顯著高于BHT。

2.2.2 芒果皮多酚對卵黃脂蛋白脂質(zhì)過氧化的抑制能力

圖2 芒果皮多酚對卵黃脂蛋白脂質(zhì)過氧化的抑制率Fig.2 Inhibition rate of mango peel polyphenols on lipid peroxidation of yolk lipoprptein注：“＊＊”表示差異極顯著。

以卵黃脂蛋白溶液為脂質(zhì)過氧化體系，測定芒果皮多酚對脂質(zhì)過氧化的抑制作用，并用BHT作陽性對照。由圖2可知，BHT對Fe2＋誘導(dǎo)的卵黃脂蛋白脂質(zhì)過氧化的抑制作用明顯優(yōu)于芒果皮多酚。隨著芒果皮多酚質(zhì)量濃度的增加，其抑制率呈現(xiàn)小幅度連續(xù)上升的趨勢，在濃度超過46.5μg／mL后，抑制率有明顯提高；在濃度為58.13μg／mL 時，抑制率可達(dá)59.04%。相比之下，在濃度為4.65μg／mL時，BHT對卵黃脂蛋白脂質(zhì)過氧化有較強(qiáng)的抑制作用，抑制率達(dá)68.74%，極顯著高于同質(zhì)量濃度下芒果皮多酚的抑制率。濃度超過34.88μg／mL時，抑制率達(dá)90.98%，之后抑制率趨于平緩。

3 討論

芒果資源豐富，其加工過程中大量皮、核等副產(chǎn)品未被利用，近年來，有關(guān)學(xué)者對芒果植物中的生物活性物質(zhì)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明芒果果皮提取物含有豐富的多酚類化合物，具有較強(qiáng)的抗氧化和抑菌作用，其中張國治等［15］以市購芒果為原料、41%乙醇溶液為浸提劑加入0.19%偏磷酸鈉，65℃，89min，多酚平均提取得率為1.41%；楊鄭州等以廣西百色市塘興村采摘的臺農(nóng)、貴妃、金煌芒3個品種的芒果皮和芒果葉干粉末（過40目篩）為原料，以40%乙醇溶液為浸提劑，靜置30min后用超聲波振蕩40min，3種芒果以臺農(nóng)芒果葉片和果皮多酚含量最高，分別為葉片10.091mg／g、果皮11.518mg／g。賈桂云等［16］以金煌芒果皮粉末為原料，70%乙醇溶液震蕩提取30min，重復(fù)2次，采用福林酚試劑法測得芒果皮中多酚含量為40.00GAEmg／g。本試驗以60%乙醇溶液為浸提劑，采用微波輔助法提取臺農(nóng)芒果果皮中的多酚類物質(zhì)，多酚提取得率為（6.24±0.02）%，微波提取顯著提高了多酚得率，節(jié)省了時間，避免了活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，武嬌等［17］的研究結(jié)果也證明了這一點(diǎn)。謝倩等［18］以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，加標(biāo)回收率實驗說明酒石酸鐵法和福林酚試劑法測得的多酚含量差異不顯著（p＞0.05）。因此，微波輔助法提取具有一定的應(yīng)用推廣價值。

很多疾病如癌癥、冠心病及衰老等的發(fā)生與富含抗氧化劑食品的攝入量呈負(fù)相關(guān)，天然抗氧化劑在食品保鮮、藥品、化妝品行業(yè)應(yīng)用廣泛，具有抗氧化和抑菌作用的果蔬等成為研究熱點(diǎn)。體外抗氧化試驗結(jié)果表明芒果皮多酚粗提物對DPPH自由基和卵黃脂蛋白過氧化的抑制作用都隨著質(zhì)量濃度的增加而逐漸提高，尤其對DPPH自由基的清除能力較強(qiáng)，其效果極顯著高于BHT，這一結(jié)果與楊鄭州等的抗氧化活性試驗結(jié)果相符。對卵黃脂蛋白脂質(zhì)過氧化有一定的抑制作用，但極顯著低于BHT。芒果皮多酚粗提物已表現(xiàn)出良好的抗氧化作用，其多酚組成、結(jié)構(gòu)及抗氧化機(jī)理還有待進(jìn)一步探討，另外，樣液的濃度梯度還有待進(jìn)一度增大。

4 結(jié)論

微波輔助法提取芒果皮多酚的較佳工藝條件為：浸提乙醇溶液濃度60%，料液比為1∶30（g／mL），在微波功率160W處理30s，于60℃水浴浸提30min，芒果皮多酚提取得率為（6.24±0.02）%，明顯高于單獨(dú)微波法。體外抗氧化試驗結(jié)果表明，芒果皮中多酚表現(xiàn)出較好的抗氧化作用，可作為天然抗氧化劑和防腐保鮮劑進(jìn)行深入研究和開發(fā)。