落葵種子色素提取及其抑菌作用研究

楊海韞，盧坤，王庭欣

(河北大學(xué) 質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督學(xué)院，河北 保定 071000)

落葵為落葵科落葵屬中以嫩莖葉供食用的一年生纏繞性草本植物[1]。成熟的果實(shí)為紫紅色，其漿汁內(nèi)有大量甜菜花青素和甜菜紅色素[2]。資料顯示落葵色素具有抑菌、保鮮的作用[3]，常用作香腸和化妝品的著色劑，與紅曲色素有著類(lèi)似的著色效果[4]。近年來(lái)有關(guān)落葵色素的研究多集中于對(duì)其化學(xué)性質(zhì)的研究，對(duì)其提取條件的探究報(bào)道較少[5，6]。為落葵色素的開(kāi)發(fā)利用，本研究對(duì)其提取條件進(jìn)行了探討并對(duì)其抑菌作用進(jìn)行了初步研究，為落葵種子色素的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

氫氧化鈉、石油醚、乙酸乙酯、乙醚、無(wú)水乙醇、甲醇、丙酮、鹽酸等：均為分析純；落葵果實(shí)干種子：河北大學(xué)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供；菌種：金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、大腸桿菌(8099)，河北大學(xué)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器與設(shè)備

多功能攪拌機(jī) 蘇泊爾股份有限公司；V-1100D型可見(jiàn)光分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；PTX-FA210S型電子天平 福州華志科學(xué)儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司；摩爾元素機(jī) 重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 落葵種子色素的提取

1.3.1.1 最佳提取溶劑的確定

選擇純水；有機(jī)溶劑：石油醚、甲醇、乙酸乙酯、無(wú)水乙醇。無(wú)水乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為95%,80%,70%,50%,20%。各取20 mL作為提取劑，分別加入0.5 g粉碎的落葵種子，充分搖勻后，浸提1 h，觀察顏色。取落葵色素溶液稀釋后，以純水為參比液，用可見(jiàn)光分光光度計(jì)在波長(zhǎng)400～600 nm 的范圍內(nèi)以20 nm為間隔掃描，測(cè)定吸光度，通過(guò)比較最大吸光度得到落葵種子色素吸收的最適波長(zhǎng)。以純水代替溶劑作空白對(duì)照, 根據(jù)吸光度大小確定最佳提取溶劑。重復(fù)3次，取平均值。

1.3.1.2 最佳提取溫度和時(shí)間的確定

準(zhǔn)確稱(chēng)量2 g落葵種子試樣于12個(gè)100 mL容量瓶中，用純水定容。平均分為4組，1組在室溫放置，另外3組分別在恒溫40,60,75 ℃的水浴鍋中加熱，每組容量瓶分別在浸提20,30,60 min后取出。待溶液冷卻至室溫后，用分光光度計(jì)以蒸餾水作為空白對(duì)照，在最適波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，比較最大吸光值，確定最佳提取溫度與時(shí)間。重復(fù)3次，取平均值。

1.3.1.3 最佳提取pH值的確定

最佳提取條件下取得的色素溶液各1.0 mL分別加入8支比色管中，用鹽酸溶液與氫氧化鈉溶液配制pH值梯度在2.0～9.0的酸堿度不同的溶液，分別加入8支比色管中定容至50.0 mL，觀察試管中溶液顏色，并測(cè)定在最佳波長(zhǎng)下的吸光度，以確定其最佳pH值。重復(fù)3次，取平均值。

1.3.1.4 最佳提取液料比的確定

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g落葵種子試樣5份，分別加入12,16,18,20,24 mL的蒸餾水，浸提30 min，以8000 r/min離心12 min，取相同體積上層清液于比色管中，以蒸餾水為空白對(duì)照，測(cè)定不同條件提取的溶液在最適波長(zhǎng)下的吸光度，確定最佳液料比。重復(fù)3次，取平均值。

1.3.1.5 最佳提取次數(shù)的確定

在最佳浸提條件下浸提0.5 g種子樣品，浸提至無(wú)色，分別收集每次色素溶液，測(cè)定其體積和吸光度。計(jì)算浸提率，確定最佳提取次數(shù)。

1.3.1.6 最佳濃縮干燥條件的選擇

取等量落葵色素提取液于錐形瓶中，分成2組，一組置于水浴鍋中在40 ℃蒸發(fā)干燥，另一組于室溫干燥。稱(chēng)量并記錄錐形瓶干燥后的重量，比較2種條件下的干燥效果。

1.3.2 落葵果實(shí)色素正交實(shí)驗(yàn)

確定最佳提取液為水，1∶18為最佳液料比為固定條件，以溫度、提取時(shí)間和pH值為3個(gè)因素并擬定3個(gè)程度，設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，將提取液稀釋定容至相同體積，在最適波長(zhǎng)540 nm下測(cè)定各自的吸光度，確定最佳提取條件。正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 1 Orthogonal experiment designTable

1.3.3 落葵果實(shí)色素溶液的制備

稱(chēng)量0.5 g粉碎的落葵果實(shí)試樣，加入8 mL無(wú)菌水，浸取30 min后，以10000 r/min離心10 min，取上層清液，用無(wú)菌水配成50%,10%,1% 3種不同濃度的落葵果實(shí)色素溶液備用。

1.3.4 落葵果實(shí)色素提取液的抑菌試驗(yàn)

用滅菌的牛肉膏-蛋白胨液體培養(yǎng)基分別對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌在37 ℃，24 h進(jìn)行增菌，菌液濃度為106個(gè)/mL。采用滅菌的瓊脂培養(yǎng)基制成平板，分別取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌2種菌懸液各0.2 mL制成菌平板，每個(gè)平板放3片浸有不同濃度樣品的濾紙片做平行樣品，并設(shè)陰性對(duì)照(無(wú)菌)在37 ℃，24 h培養(yǎng)，觀察抑菌圈大小。

2 結(jié)果與討論

2.1 落葵果實(shí)色素單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 最佳提取溶劑的確定

表2 不同浸提液效果Table 2 Different extract's effects

由表2可知，呈現(xiàn)紫紅色的純水浸提液浸提效果最好，浸提液呈現(xiàn)淡黃色的有機(jī)溶劑的提取效果較差，乙醇溶液隨著濃度增加，浸提效率逐漸降低；根據(jù)相似相溶的性質(zhì)，落葵紅色素為水溶性色素。確定水是最佳提取液，相較而言水的成本低，符合實(shí)際生產(chǎn)工藝的要求。

2.1.2 最佳提取溫度和時(shí)間的確定

表3 不同溫度和時(shí)間浸提液效果比較Table 3 Comparison of extract's effects at different temperatures and time

由表3可知，溫度對(duì)色素的穩(wěn)定性影響較大，室溫下隨著提取時(shí)間的加長(zhǎng)，色素的提取效果逐步提升，而高溫下，隨著時(shí)間的加長(zhǎng)，色素提取效果下降。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)降低成本、減少流程步驟的需要，故選擇最佳提取溫度為室溫，提取時(shí)間為30 min。

2.1.3 最佳提取pH值的確定

表4 不同pH值浸提液效果比較Table 4 Comparison of extract's effects of different pH values

由表4可知，色素在酸性環(huán)境下吸光度較大，吸光值在pH 4～6之間達(dá)到峰值，綜合工業(yè)需求，考慮選擇pH 5為最佳提取條件，同時(shí)在浸提工藝中可以加入鹽酸或者醋酸為pH調(diào)節(jié)劑，增加色素穩(wěn)定性。

2.1.4 最佳提取液料比的確定

表5 不同液料比浸提液效果比較Table 5 Comparison of extract's effects of different liquid-material ratios

由表5可知，液料比越大，提取效果越好；在液料比1∶18之后，提取效果基本穩(wěn)定，提取率變化幅度小。綜合考慮實(shí)際生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)和后續(xù)濃縮的需要，選擇1∶18為最佳提取液料比。

2.1.5 最佳提取次數(shù)的確定

表6 不同浸提次數(shù)浸提液效果比較Table 6 Comparison of extract's effects of different extraction times

由表6可知，浸提次數(shù)越多，提取率越大。提取3次后，提取率增加不明顯，出于成本考慮，確定最佳提取次數(shù)為3次。

2.1.6 最佳濃縮干燥條件的選擇

表7 不同干燥條件比較Table 7 Comparison of different drying conditions

由表7可知，水浴蒸干用時(shí)短，色素得率高。自然干燥不僅耗時(shí)長(zhǎng)，且易引起色素變質(zhì)，因此確定最佳干燥條件為水浴蒸干。

2.2 落葵果實(shí)色素正交實(shí)驗(yàn)

表8 正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Table 8 Orthogonal experimental scheme and results

由表8可知，根據(jù)極差 R 值，不同水平因素對(duì)色素提取率影響的主次順序?yàn)?A>C>B，溫度為主要影響因素，由此確立最佳提取工藝為 A1B1C1，A1B2C2，綜合考慮，選擇提取溫度 25 ℃、pH值5、時(shí)間30 min 為最適條件。

2.3 落葵果實(shí)色素抑菌實(shí)驗(yàn)

采用卡尺測(cè)量抑菌圈直徑的方法對(duì)落葵果實(shí)色素的抑菌性進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示：在含有浸泡原液、50%濃度、10%濃度、1%濃度濾紙片的大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的含菌平板上均無(wú)明顯抑菌圈，初步判斷落葵果實(shí)色素?zé)o抑菌作用。

3 討論

本文對(duì)落葵種子色素提取條件的優(yōu)化做了初步探討。落葵種子色素的提取條件為：將原料清洗后，烘干，粉碎；以純水為提取劑，在pH 4～6條件下用1∶18的液料比，將原料于常溫下浸提 3 次，每次30 min，浸提液可以經(jīng)高速離心后過(guò)濾或直接過(guò)濾后，用恒溫水浴蒸干，色素在高溫下易變質(zhì)，水浴溫度宜控制在40 ℃以下。本文得出的落葵種子色素提取的最適吸收波長(zhǎng)、最佳提取液、最適pH值、最適提取溫度等提取條件與目前所存文獻(xiàn)基本一致。在判斷指標(biāo)上，張美榮等采用色價(jià)為比較項(xiàng)目，更加便于判斷色素的品質(zhì)。與以往文獻(xiàn)相比，本研究結(jié)果更加確切，pH的范圍進(jìn)一步縮小，為生產(chǎn)提供了可靠依據(jù)。本文對(duì)落葵種子色素的抑菌性做了探究，進(jìn)一步拓寬了對(duì)落葵種子色素性質(zhì)的了解；較為全面地探究了落葵種子色素的提取條件，為落葵種子色素進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。