超聲波細(xì)胞破碎法提取香蕉皮中 水解單寧的工藝研究

劉濤，劉寧，王雅，張鐵鵬

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院，哈爾濱 150076)

單寧(或稱(chēng)鞣質(zhì)、單寧酸)，屬于多酚化合物，其結(jié)構(gòu)屬于高度聚合型，是活潑性化學(xué)物質(zhì)。單寧在食品的加工中有很多方面的應(yīng)用，如食品輔色、調(diào)味、酒水的澄清等[1]。單寧可以從色澤、風(fēng)味兩個(gè)方面影響食品的風(fēng)味。天然的單寧很容易被氧化，變成紅棕色或褐色的醌類(lèi)物質(zhì)，成為食品色素的一部分。單寧對(duì)天然色素也有一定的輔色作用。另外，單寧還可以和口腔黏膜或唾液蛋白結(jié)合使食品產(chǎn)生澀味，產(chǎn)生粗糙褶皺的收斂感與干燥感。澀味可以加強(qiáng)口腔對(duì)其他味覺(jué)的感受能力。同時(shí)，還可以通過(guò)氧化耦合、分子降解反應(yīng)生成天然色素，從而改變食品的色澤，在視覺(jué)與味覺(jué)兩個(gè)方面影響食品的風(fēng)味[2]。近些年來(lái)，單寧又因?yàn)槠涞挚寡趸钚?、捕捉自由基、抵御菌?lèi)感染和相關(guān)類(lèi)型的衍生化反應(yīng)等生理性質(zhì)被陸續(xù)開(kāi)發(fā)研究，而被多次應(yīng)用到食品、果蔬加工以及醫(yī)藥、水處理等領(lǐng)域[3]，具有十分廣闊的開(kāi)發(fā)前景。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器、試劑與材料

1.1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器

JY92-11N型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；HWS12型電熱恒溫水浴鍋、DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；B型玻璃儀器氣流烘干箱 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；TDL-80-2B型低速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；DFY-500型搖擺式高速中藥粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與材料

實(shí)驗(yàn)原材料：香蕉皮、市售香蕉。

實(shí)驗(yàn)試劑：氯化銨、乙酸鋅、乙二胺四乙酸二鈉、無(wú)水乙醇、氨水、丙酮、鉻黑T，純度皆為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 香蕉皮預(yù)處理

將待處理的香蕉皮于105 ℃的鼓風(fēng)干燥箱中殺青處理15 min，再在65 ℃的溫度下烘干香蕉皮到恒重[4]。用粉碎機(jī)將處理后的香蕉皮粉碎成粉末，過(guò)80目篩后，備用。

1.2.2 水解單寧的提取和測(cè)定

1.2.2.1 水解單寧的提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.00 g的1.2.1得到的備用香蕉皮粉末于錐形瓶中，加入一定量的提取試劑后，在一定的提取時(shí)間與超聲功率條件下，于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中進(jìn)行提取，收集提取液并測(cè)定水解單寧的含量。

1.2.2.2 水解單寧含量的測(cè)定

水解單寧含量的測(cè)定采用乙酸鋅配位滴定的方法[5]，按公式(1)計(jì)算水解單寧含量：

提取量=(c1V1-25c2V2)×0.1556。

(1)

式中：c1為乙酸鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；V1為乙酸鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；c2為EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；V2為滴定時(shí)消耗的EDTA的體積，mL；0.1556為由實(shí)驗(yàn)得出的比例常數(shù)，g/mmol；25為分取倍數(shù)。

1.2.2.3 水解單寧總含量的測(cè)定及提取效果的計(jì)算

稱(chēng)取香蕉皮粉末1.0000 g，料液比為1∶25(g/mL)，超聲波功率為100 W，超聲時(shí)間為25 min，用丙酮多次提取，當(dāng)濾液加1% FeCl3不顯綠色時(shí)，停止提取，將每次提取得到的水解單寧量累計(jì)計(jì)算，得出水解單寧的總含量。經(jīng)測(cè)定，香蕉皮的總含量為6.7156 mg/g。水解單寧的提取率按公式(2)計(jì)算：

(2)

由公式(1)和公式(2)可得公式(3)：

(3)

式中：x為單寧的提取率，%；m為1.0000 g香蕉皮中的單寧總含量，經(jīng)測(cè)定為6.7156 mg/g。

1.2.3 香蕉皮中水解單寧提取單因素考察

1.2.3.1 不同有機(jī)溶劑對(duì)水解單寧提取效果的影響

1.2.3.2 料液比對(duì)水解單寧提取效果的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.00 g香蕉皮粉末，用60%(V/V)的丙酮作為提取劑，按照料液比為1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，1∶45，1∶50，1∶55(g/mL)，于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中，在100 W功率下超聲提取25 min。按1.2.2.2測(cè)定水解單寧含量，按公式(3)計(jì)算提取率。

1.2.3.3 提取劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)水解單寧提取效果的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.00 g香蕉皮粉末，在料液比1∶25(g/mL)，超聲功率100 W、提取時(shí)間25 min的條件下，分別用體積分?jǐn)?shù)20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%的丙酮作為提取劑，于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中進(jìn)行提取，按1.2.2.2測(cè)定水解單寧含量，按公式(3)計(jì)算提取率。

1.2.3.4 提取時(shí)間對(duì)水解單寧提取效果的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.00 g香蕉皮粉末，用60%(V/V)的丙酮作為提取劑，在料液比1∶25 (g/mL)、超聲功率100 W的條件下，分別于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中提取5，15，25，35，45，55，65，75，85 min，按1.2.2.2測(cè)定水解單寧含量，按公式(3)計(jì)算提取率。

四是注重心理素質(zhì)健康教育培訓(xùn)。針對(duì)監(jiān)獄戒毒警察工作生活中面臨的監(jiān)管安全壓力、執(zhí)法安全壓力等導(dǎo)致的心理問(wèn)題，河南省司法廳聯(lián)合高校舉辦由政工干部和基層業(yè)務(wù)骨干參加的心理健康教育能力素質(zhì)提升培訓(xùn)班，引導(dǎo)政工干部把心理矯治的手段運(yùn)用到干部思想政治工作中，引導(dǎo)基層一線警察掌握釋放自我、緩解壓力的手段和方法。各直屬單位也把隊(duì)伍心理健康教育作為教育培訓(xùn)的重要內(nèi)容，定期邀請(qǐng)社會(huì)心理咨詢(xún)專(zhuān)家或利用單位內(nèi)部心理咨詢(xún)師對(duì)警察開(kāi)展心理輔導(dǎo)、心理知識(shí)講座、心理咨詢(xún)、心理拓展、心理矯治等心理素質(zhì)培訓(xùn)，使隊(duì)伍掌握應(yīng)對(duì)壓力和解決心理問(wèn)題的方法技巧，有效緩解工作生活壓力，提升心理健康水平。

1.2.3.5 超聲波功率對(duì)水解單寧提取效果的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.00 g香蕉皮粉末，用60%(V/V)的丙酮作為提取劑，在料液比1∶25 (g/mL)的條件下，分別于超聲功率為10，20，40，60，80，100，120，130，140 W，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)提取25 min，按1.2.2.2測(cè)定水解單寧含量，按公式(3)計(jì)算提取率。

1.2.4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案

響應(yīng)面設(shè)計(jì)法(Response Surface Methodology，RSM)是指使用合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并利用回歸方程對(duì)實(shí)驗(yàn)得到的一系列數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次擬合，以擬合各實(shí)驗(yàn)因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系[6]。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析研究結(jié)果，選擇料液比、溶劑體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、超聲波功率4個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面分析，采用響應(yīng)面法中的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及響應(yīng)曲面圖等來(lái)優(yōu)化超聲波法提取香蕉皮中水解單寧的提取工藝。分別將料液比、溶劑體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、超聲波功率這4個(gè)因素作為自變量，+1，0，-1分別代表各個(gè)因素的高、中、低水平，其中，-1，0，+1分別代表的是自變量即各個(gè)因素的低、中、高水平值，實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Design of factors and levels

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 不同有機(jī)溶劑對(duì)水解單寧提取率的影響

為了選擇更適合、提取效率更好的提取劑，分別以丙酮、無(wú)水乙醇、水作為單寧提取劑，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)水解單寧進(jìn)行超聲波提取，其提取率分別為72.30%，69.46%，59.84%。從提取效果可以看出，以丙酮作為提取劑效果最好。其原因可能是在超聲波細(xì)胞破碎儀的輔助下，丙酮溶劑斷開(kāi)單寧-蛋白質(zhì)的化學(xué)鍵的幾率更大，從而提高了水解單寧的提取率。其次，丙酮沸點(diǎn)低，易于回收，從工業(yè)化等角度考慮，更適合作為水解單寧提取劑使用。因此，選擇丙酮作為提取劑[7]。

2.1.2 料液比對(duì)水解單寧提取率的影響

料液比分別為1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，1∶45 (g/mL)時(shí)，相應(yīng)的水解單寧提取率見(jiàn)圖1。

圖1 料液比對(duì)水解單寧提取率的影響Fig.1 The effect of ratio of solid to liquid on the extraction rate of hydrolysable tannin

由圖1可知，水解單寧的提取率隨著丙酮用量的變化先增大后減少。在料液比為1∶25(g/mL)時(shí)，提取率最大。這是由于如果料液比過(guò)大，則會(huì)影響樣品中水解單寧的溶出量；而如果料液比太小，則會(huì)稀釋提取液的質(zhì)量濃度，除此之外，如果提取溶劑的量過(guò)大，意味著提取液進(jìn)行濃縮、分離純化等過(guò)程的壓力和時(shí)間也會(huì)相應(yīng)地增加，增加了提取的難度，從而降低了水解單寧的提取率[8]。綜合考慮，選擇料液比為1∶20，1∶25，1∶30 (g/mL)作為響應(yīng)面水平。

2.1.3 提取劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)水解單寧提取率的影響

丙酮體積分?jǐn)?shù)分別為20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%時(shí)，相應(yīng)的水解單寧提取率見(jiàn)圖2。

圖2 提取劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)水解單寧提取率的影響Fig.2 The effect of extractant volume fraction on the extraction rate of hydrolysable tannin

由圖2可知，水解單寧的提取率隨著丙酮溶液體積分?jǐn)?shù)的增加先增大后減少。當(dāng)丙酮溶液的體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，丙酮對(duì)水解單寧的提取率最大。這可能是因?yàn)楫?dāng)丙酮溶劑的體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)所具有的極性最適合于水解單寧溶出，所以當(dāng)丙酮溶液的體積分?jǐn)?shù)大于60%時(shí)，單寧的溶出量減少，丙酮對(duì)水解單寧的提取率也會(huì)降低。綜合考慮實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及實(shí)驗(yàn)的安全性和節(jié)約原料的要求，選擇丙酮溶液的體積分?jǐn)?shù)為50%，60%，70%作為響應(yīng)面水平。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)水解單寧提取率的影響

提取時(shí)間分別為5，15，25，35，45，55，65，75，85 min時(shí)，相應(yīng)的水解單寧提取率見(jiàn)圖3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)水解單寧提取率的影響Fig.3 The effect of extraction time on the extraction rate of hydrolysable tannin

由圖3可知，水解單寧的提取率隨著提取時(shí)間的增長(zhǎng)先增大后減少。當(dāng)提取時(shí)間為25 min時(shí)，丙酮溶液對(duì)水解單寧的提取率最大。這可能是由于提取時(shí)間為25 min時(shí)，單寧已經(jīng)充分提取出來(lái)；當(dāng)時(shí)間長(zhǎng)于25 min后，溶出的雜質(zhì)成分增多，同時(shí)氧化分解的水解單寧的量也增加，因此導(dǎo)致水解單寧的提取率降低[9]。綜合考慮，選擇提取時(shí)間為15，25，35 min作為響應(yīng)面水平。

2.1.5 超聲波功率對(duì)水解單寧提取率的影響

超聲波功率分別為10，20，40，60，80，100，120，130，140 W時(shí)，相應(yīng)的水解單寧提取率見(jiàn)圖4。

圖4 超聲功率對(duì)水解單寧提取率的影響Fig.4 The effect of ultrasonic power on the extraction rate of hydrolysable tannin

由圖4可知，水解單寧的提取率隨著超聲功率的增加先增大后減少。當(dāng)超聲功率為100 W時(shí)，丙酮對(duì)香蕉皮中水解單寧的提取率最大。這可能是因?yàn)殡S著超聲波功率的增加，放出的熱量逐漸增加，使得反應(yīng)溫度升高，溫度的升高加劇了水解單寧的分解，同時(shí)丙酮的揮發(fā)速度會(huì)加快，導(dǎo)致丙酮中水解單寧的溶解量下降。綜合考慮環(huán)境噪聲以及原料成本等方面要求，選擇超聲功率為80，100，120 W作為響應(yīng)面水平。

2.2 響應(yīng)面結(jié)果與分析

為優(yōu)化單因素實(shí)驗(yàn)得到的水解單寧提取工藝，采用Box-Behnken Design試驗(yàn)方案，對(duì)水解單寧提取工藝的主要影響因素進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，選取料液比、溶液體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、超聲波功率4個(gè)因素做顯著水平表，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 Response surface experiment design and results

續(xù) 表

將表2所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design Expert 7.0.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，回歸模型方差分析見(jiàn)表3。

表3 二次項(xiàng)模型的線性系數(shù)及方差分析Table 3 Analysis of variance and linear coefficient of quadratic model

運(yùn)用 Design Expert 7.0.0軟件進(jìn)行多元二次擬合，得到水解單寧提取率(Y)對(duì)料液比(A)、溶液體積分?jǐn)?shù)(B)、提取時(shí)間(C)、超聲波功率(D)的回歸模型為：

Y=77.47-12.82A+0.87B-5.09C+5.06D+0.80AB+1.45AC+1.86AD-9.75BC-9.06BD+6.31CD-11.58A2-10.11B2-9.47C2+1.56D2。

由表3可知，其回歸模型極顯著(P<0.0001)，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.9615>0.05)，其回歸模型決定系數(shù)為R2=0.9942，證明可以使用該模型對(duì)香蕉皮中水解單寧提取率進(jìn)行預(yù)測(cè)[10]。由表3的方差分析可以看出，在一次項(xiàng)中，料液比、提取時(shí)間和超聲波功率對(duì)香蕉皮中水解單寧的提取率影響最大，均為P<0.0001，達(dá)到極顯著水平；丙酮溶液的體積分?jǐn)?shù)對(duì)香蕉皮中水解單寧提取率影響較??；影響的程度順序依次是料液比>提取時(shí)間>超聲波功率>體積分?jǐn)?shù)。在二次項(xiàng)中，料液比、體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間對(duì)香蕉皮中水解單寧提取效果的影響皆達(dá)到極顯著水平，P<0.0001；超聲波功率對(duì)香蕉皮中水解單寧的提取率影響較小。在交互項(xiàng)中，體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間、體積分?jǐn)?shù)與超聲波功率，以及提取時(shí)間與超聲波功率之間的交互作用均對(duì)香蕉皮中水解單寧的提取率產(chǎn)生了極其顯著的影響，均為P<0.0001；而料液比與體積分?jǐn)?shù)、料液比與提取時(shí)間，以及料液比與超聲波功率的交互作用對(duì)香蕉皮中水解單寧的提取率影響均不顯著。

由此對(duì)其回歸方程進(jìn)行優(yōu)化，剔除其中二次完全回歸方程中的不顯著因素B、AB、AC、AD、D2，由此新的二次回歸方程為：

Y=77.47-12.82A+0.87B+5.06D-9.75BC-9.06BD+6.31CD-11.58A2-10.11B2-9.47C2。

根據(jù)回歸方程得出響應(yīng)面分析圖和相應(yīng)的等值線圖，見(jiàn)圖5～圖10。

圖5 料液比與體積分?jǐn)?shù)交互作用影響水解 單寧提取率的曲面線圖Fig.5 The surface curve for the interaction influences between solid-liquid ratio and volume fraction on extraction rate of hydrolysable tannin

圖6 料液比與提取時(shí)間交互作用影響水解 單寧提取率的曲面線圖Fig.6 The surface curve for the interaction influences between solid-liquid ratio and extraction time on extraction rate of hydrolysable tannin

圖7 料液比與超聲功率交互作用影響水解 單寧提取率的曲面線圖Fig.7 The surface curve for the interaction influences between solid-liquid ratio and ultrasonic power on extraction rate of hydrolysable tannin

圖8 體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間交互作用影響水解 單寧提取率的曲面線圖Fig.8 The surface curve for the interaction influences between volume fraction and extraction time on extraction rate of hydrolysable tannin

圖9 體積分?jǐn)?shù)與超聲功率交互作用影響水解 單寧提取率的曲面線圖Fig.9 The surface curve for the interaction influences between volume fraction and ultrasonic power on extraction rate of hydrolysable tannin

圖10 提取時(shí)間與超聲功率交互作用影響水解 單寧提取率的曲面線圖Fig.10 The surface curve for the interaction influences between extraction time and ultrasonic power on extraction rate of hydrolysable tannin

由圖5～圖10可較直觀地看出各因素的交互作用對(duì)香蕉皮中水解單寧提取率的影響。曲線越陡峭，說(shuō)明該組因素的響應(yīng)面值的變化程度越大，則表明其交互作用對(duì)丙酮提取香蕉皮中水解單寧的提取率影響越大。通過(guò)比較6組圖可知，體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間、體積分?jǐn)?shù)與超聲功率及提取時(shí)間與超聲功率的交互作用對(duì)香蕉皮中水解單寧的提取率影響較大[11]，表現(xiàn)為響應(yīng)面圖較陡；而料液比與體積分?jǐn)?shù)、料液比與提取時(shí)間及料液比與超聲功率的交互作用則不明顯，表現(xiàn)為響應(yīng)面曲線較為平滑。綜上所述，可知響應(yīng)面分析的結(jié)果與方差分析的結(jié)果完全相符。

對(duì)優(yōu)化過(guò)后的二次回歸模型數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出水解單寧最佳的提取條件是：料液比1∶21.68(g/mL)、丙酮溶液的體積分?jǐn)?shù)69.47%、提取時(shí)間15 min、超聲波功率80 W，這時(shí)香蕉皮中水解單寧提取率可以得到的理論最大值是90.58%。為了便于實(shí)際的操作，將最佳提取條件修改為料液比1∶22(g/mL)、丙酮溶液的體積分?jǐn)?shù)70%、提取時(shí)間15 min、超聲波功率80 W。在新改正的條件下進(jìn)行3次平行的驗(yàn)證試驗(yàn)，得到水解單寧提取率的平均值是88.62%，相對(duì)誤差-1.96%，與模型的預(yù)測(cè)結(jié)果幾乎相同，說(shuō)明通過(guò)響應(yīng)面的方法優(yōu)化得到水解單寧的超聲波提取工藝，在實(shí)際中是十分可行的。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以香蕉皮粉末作為原材料，采用超聲波法即運(yùn)用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)對(duì)香蕉皮中的水解單寧進(jìn)行提取，通過(guò)對(duì)有機(jī)溶劑的種類(lèi)、料液比、丙酮溶液的體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、超聲波功率5個(gè)影響因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，并在此基礎(chǔ)上運(yùn)用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，優(yōu)化提取工藝，得出了最佳提取工藝的條件。結(jié)果表明：采用超聲波法對(duì)香蕉皮中水解單寧進(jìn)行提取的最佳提取工藝條件為：料液比1∶22(g/mL)、丙酮溶液的體積分?jǐn)?shù)70%、提取時(shí)間15 min、超聲波功率80 W。此條件下香蕉皮中水解單寧的提取率為88.62%。根據(jù)此次實(shí)驗(yàn)分析，可得出利用超聲波法進(jìn)行香蕉皮中水解單寧的提取，具有操作簡(jiǎn)便、提取率高、節(jié)能、節(jié)省時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)，有利于為香蕉皮中水解單寧的各項(xiàng)研究打好基礎(chǔ)，做好準(zhǔn)備。