雪茄煙品種Beinhart1000-1赤星病抗性基因的QTL定位

童治軍 張誼寒 陳學(xué)軍 曾建敏 方敦煌 肖炳光

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雪茄煙品種Beinhart1000-1赤星病抗性基因的QTL定位

童治軍 張誼寒 陳學(xué)軍 曾建敏 方敦煌*肖炳光*

云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 / 煙草行業(yè)煙草生物技術(shù)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 國(guó)家煙草基因工程研究中心, 云南昆明 650021

由鏈格孢菌()引起的赤星病是最具破壞性的煙草葉斑病害之一, 在中國(guó)嚴(yán)重地影響煙草(L)的產(chǎn)量和質(zhì)量。選育抗煙草赤星病的優(yōu)良品種雖是預(yù)防該病最經(jīng)濟(jì)、有效的途徑, 但因其抗性受數(shù)量性狀基因控制而很難通過(guò)常規(guī)育種手段實(shí)現(xiàn)。為了便于開(kāi)展煙草抗赤星病分子標(biāo)記輔助選擇育種, 本研究利用抗赤星病雪茄煙品種Beinhart1000-1和感病烤煙品種紅花大金元經(jīng)雜交、自交產(chǎn)生的362個(gè)F2單株構(gòu)建了一張包含670個(gè)SSR標(biāo)記的煙草遺傳連鎖圖譜, 并結(jié)合組培快繁形成的F2株系的田間赤星病病情指數(shù)(DI), 在全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)獲得2個(gè)與煙草赤星病抗性相關(guān)的QTL, 分別位于第20和23連鎖群上的SSR標(biāo)記TMs05179和TMs04022, 以及TM61049和TM62212之間。這2個(gè)QTL等位基因均來(lái)自抗病親本Beinhart1000-1, 它們一起解釋了兩親本間81%的病情指數(shù)(DI)差異及64%的加性效應(yīng)。為下一步開(kāi)展煙草抗赤星病的分子標(biāo)記輔助育種奠定了基礎(chǔ)。

煙草赤星病; 簡(jiǎn)單重復(fù)序列; 遺傳連鎖圖譜; 數(shù)量性狀基因座

赤星病由鏈格孢菌((Fries) Keissl)[1-3]引起, 是最具破壞性的煙草(L)葉斑病害之一, 在煙草的整個(gè)生育期內(nèi)均有發(fā)生, 尤其在煙葉的成熟期更嚴(yán)重[1-4]。病害通常從煙株下部葉開(kāi)始發(fā)生, 隨著葉片的成熟, 病斑自上而下發(fā)生[5]。最初在葉片上出現(xiàn)黃褐色圓形小斑點(diǎn), 而后變成褐色, 并會(huì)逐步擴(kuò)大, 病斑呈圓形或不規(guī)則圓形, 有同心輪, 外圍有淡黃色暈圈[6-8]。嚴(yán)重時(shí), 病斑相互連接合并, 致使病斑焦枯、破碎。在中國(guó), 赤星病在各個(gè)煙區(qū)廣泛發(fā)生, 嚴(yán)重影響煙草的產(chǎn)量和質(zhì)量。

培育抗煙草赤星病的優(yōu)良品種雖然是預(yù)防該病最經(jīng)濟(jì)有效的途徑, 但其抗性屬于受微效多基因控制且極易受環(huán)境影響的數(shù)量性狀[9-12], 極大地增加了育種的難度。分子標(biāo)記輔助選擇育種(MAS)是利用與目的性狀基因連鎖的分子標(biāo)記快捷、有效地選擇目標(biāo)性狀基因型, 加快作物育種進(jìn)程[13]。對(duì)數(shù)量性狀(或微效多基因控制的復(fù)雜性狀)進(jìn)行MAS的先決條件是利用分子標(biāo)記對(duì)目的性狀掃描定位全基因組的QTL。迄今, QTL定位研究在煙草上雖有較多的報(bào)道[14-16], 但在煙草赤星病抗性基因QTL定位分析方面的報(bào)道較少[17-20]。究其原因是煙草栽培品種間的多態(tài)性水平極其低下[21-29], 高質(zhì)量的煙草遺傳連鎖圖譜構(gòu)建工作十分困難[30-33], 因而已報(bào)道的基于不完整(低質(zhì)量)的煙草遺傳圖譜進(jìn)行的赤星病抗性基因QTL定位分析的結(jié)果, 不能滿(mǎn)足煙草抗赤星病的分子標(biāo)記輔助育種需求。

本研究旨在利用抗、感煙草赤星病品種Beinhart1000-1和紅花大金元經(jīng)雜交、自交產(chǎn)生的F2作圖群體構(gòu)建一張高質(zhì)量煙草遺傳連鎖圖譜, 并結(jié)合組培快繁形成的F2株系的田間赤星病病情指數(shù)進(jìn)行全基因組QTL定位分析, 檢測(cè)獲得與煙草赤星病抗性相關(guān)的QTL, 為下一步開(kāi)展煙草抗赤星病的分子標(biāo)記輔助育種工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

用于遺傳圖譜構(gòu)建的群體是由紅花大金元和Beinhart1000-1經(jīng)雜交、自交產(chǎn)生的362個(gè)F2單株構(gòu)成。其中, 紅花大金元是具有優(yōu)良品質(zhì)但極易感煙草赤星病的烤煙品種, 而B(niǎo)einhart1000-1則是由美國(guó)引進(jìn)的具有煙草赤星病抗性的優(yōu)良雪茄煙品種。2015年種植親本紅花大金元和Beinhart1000-1, 雜交后獲得其后代F1; 2016年種植F1和親本, 自交并收獲F2種子; 2017年種植包含親本、F1、F2各世代材料及抗、感對(duì)照品種。其中, 抗感對(duì)照品種(凈葉黃和Speight G-140)、兩親本和F1各種植3個(gè)重復(fù), 每個(gè)重復(fù)15株, 共計(jì)45株; 此外, 用于田間煙草赤星病抗性鑒定的362個(gè)F2株系(組培快繁獲得), 每個(gè)株系含有45個(gè)具有相同基因型的組培單株, 即每個(gè)株系種植3個(gè)重復(fù), 每個(gè)重復(fù)15個(gè)單株。于云南省玉溪市研和實(shí)驗(yàn)基地種植以上試驗(yàn)材料, 株行距為0.50 m×1.00 m, 按當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙生產(chǎn)技術(shù)措施進(jìn)行栽培管理。

1.2 組培快繁

通過(guò)外植體的處理、培養(yǎng)基的配置、組培室培養(yǎng)和再生植株誘導(dǎo)及移栽將362個(gè)F2單株進(jìn)一步擴(kuò)繁為362個(gè)F2株系。

1.3 接菌與抗性調(diào)查

將赤星病強(qiáng)致病力菌株0-268 (由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供)接種于PDA培養(yǎng)基上, 在28℃條件下培養(yǎng)15 d, 待菌絲布滿(mǎn)培養(yǎng)基表面時(shí), 保存在4℃的冰箱中備用[6]。在田間葉片接近成熟期時(shí), 用1%滅菌葡萄糖溶液洗下菌苔, 過(guò)濾獲得分生孢子液, 再用1%葡萄糖、1%甘油、0.25%吐溫-80組成的水溶液配制10,000個(gè)mL–1的分生孢子懸浮液。利用新配置的煙草赤星病菌分生孢子懸浮液對(duì)兩親本、362個(gè)F2株系和抗、感病對(duì)照品種(凈葉黃和Speight G-140)進(jìn)行接病菌試驗(yàn)[34], 并在對(duì)照品種病情指數(shù)(DI)達(dá)到75%時(shí), 按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23222-2008煙草病蟲(chóng)害分級(jí)及調(diào)查方法進(jìn)行調(diào)查。將3個(gè)重復(fù)共計(jì)45株接種煙株的所有葉片進(jìn)行分級(jí)調(diào)查, 并計(jì)算出平均病情指數(shù)來(lái)替代原始F2單株的病情指數(shù)。

1.4 SSR標(biāo)記分析

按照Tong等[32]方法提取和純化親本和362份F2單株的基因組DNA。參照Bindler等[30-31]和Tong等[33]進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增體系配置和程序設(shè)置。參照Xu等[35]的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的6%非變性聚丙烯酰胺凝膠(non- denaturing PAGE)電泳檢測(cè)。

1.5 遺傳圖譜構(gòu)建

首先, 利用兩親本和F1三份材料對(duì)參試的SSR標(biāo)記進(jìn)行多態(tài)標(biāo)記篩選, 選取呈共顯性多態(tài)的SSR標(biāo)記進(jìn)行F2群體基因型分析。其次, 將獲得的F2群體基因型數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)偏分離分析(卡方檢測(cè)), 并將分離比符合1∶2∶1的標(biāo)記用于遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建。最后, 利用作圖軟件JoinMapv 4.0[36]分析符合1∶2∶1分離比例的標(biāo)記間的遺傳連鎖關(guān)系, 并利用軟件MapChart v2.22[37]繪制遺傳圖譜。參照Tong等[32-33]設(shè)置以上軟件相關(guān)參數(shù)。

1.6 QTL定位分析

基于構(gòu)建獲得的遺傳圖譜并結(jié)合田間赤星病病情指數(shù)(DI), 利用MapQTL v 6軟件[38]提供的Restricted Multiple-QTL model Mapping (rMQM)方法進(jìn)行全基因組QTL掃描定位, 相關(guān)參數(shù)設(shè)置為: Algorithm=Regression, Test statistic=LOD, Fit dominance for F2=Yes, Mapping step size=1.0, Maximum number of neighboring markers=30, Maximum number of iterations=10,000, Number of permutations=10,000。按照McCouch等[39]的方法命名QTL, 即前綴q+性狀名稱(chēng)縮寫(xiě)+ LG數(shù)目。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤星病抗性鑒定

由田間鑒定結(jié)果可知, 兩親本間的赤星病抗性差異較大, Beinhart1000-1和紅花大金元的平均病情指數(shù)(DI)分別為7.39 (變異范圍為2.03~13.96)和91.28 (變異范圍為78.85~98.38)。

赤星病的病情指數(shù)在由組培快繁獲得的F2群體中呈連續(xù)性分布(變異范圍為2.30~98.13), 即呈典型的正態(tài)分布且所有的數(shù)據(jù)均落在兩親本內(nèi)(圖1)。這一結(jié)果與已報(bào)道的研究結(jié)果相符, 即煙草赤星病的抗性是典型的數(shù)量性狀[9-12,20,40]。同時(shí)也表明, 在F2群體中不存在赤星病抗性的超親分離現(xiàn)象, 這意味著感病(高值病情指數(shù))和抗病(低值病情指數(shù))的等位基因在兩親本間是完全連鎖在一起的, 即所有高值病情指數(shù)的親本具有易感病的等位基因, 而所有低值病情指數(shù)的親本具有抗病等位基因。

圖1 煙草赤星病病情指數(shù)在F2群體中的分布頻率

2.2 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建

利用雙親(紅花大金元和Beinhart1000-1)及其F1三份材料, 對(duì)共計(jì)38,437對(duì)SSR引物(TM、TMt、TMs和PT系列引物分別為11,302、12,016、10,000和5119對(duì))進(jìn)行多態(tài)性分析, 其中, 僅篩選出677對(duì)(TM、TMt、TMs和PT系列多態(tài)性引物分別為138、187、172和180對(duì))在兩親本間有多態(tài)且在F1上呈共顯性的SSR引物, 多態(tài)率低至1.76% (677/38,437)。利用篩選出的穩(wěn)定且呈共顯性多態(tài)的SSR引物在362個(gè)F2單株中所獲得的基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行連鎖分析, 最終獲得一張含有670個(gè)SSR標(biāo)記、較均勻分布于24個(gè)連鎖群、覆蓋煙草基因組總長(zhǎng)度為2878.732 cM、相鄰標(biāo)記間的平均距離為4.297 cM的高質(zhì)量煙草遺傳連鎖圖譜。每條連鎖群所包含的SSR 標(biāo)記數(shù)目在13(LG05)~43(LG02)之間, 各染色體的長(zhǎng)度范圍是43.122 cM (LG19)~186.598 cM (LG22), 各染色體相鄰標(biāo)記間平均間隔的變化在2.398~6.794 cM之間。此外, 受益于共有的180個(gè)PT系列標(biāo)記, 我們參照Bindler等[30-31]公布的圖譜將本研究構(gòu)建獲得的連鎖群編號(hào), 使二者的連鎖群順序和編號(hào)保持一致。

2.3 QTL定位分析

最終有2個(gè)與煙草赤星病抗性基因相關(guān)的QTL被檢測(cè)到, 分別位于第20(LG20)和第23(LG23)連鎖群上 (表1)。其中,是2個(gè)QTL中具有最大效應(yīng)值的一個(gè), 可解釋18.31%的表型變異。2個(gè)QTL均具有顯著的加性效應(yīng), 但僅有表現(xiàn)出顯著的顯性效應(yīng), 這表明, 感病基因(具有較高的DI值)相對(duì)于抗病基因(具有較低的DI值)呈現(xiàn)出完全顯性。此外, 2個(gè)抗病的等位基因全部源自抗病親本Beinhart1000-1。

圖2 基于362個(gè)F2單株(紅花大金元×Beinhart1000-1)的煙草赤星病抗性QTL定位結(jié)果

圖中每條連鎖群的左右兩側(cè)分別為遺傳距離(厘摩爾)和標(biāo)記名稱(chēng), 其中, 紅色標(biāo)記表示位于Bindler等[30-31]公布的連鎖群上。

In each linkage group, the positions (cM) and names of markers were shown on the left and right side, respectively. The red markers were mapped in the genetic map constructed by Bindler et al.[30-31]

表1 煙草赤星病抗性QTL定位結(jié)果

a負(fù)的加性效應(yīng)值表示源自抗病親本Beinhart1000-1的等位基因(位點(diǎn))降低了煙草赤星病的病情指數(shù)。b表示QTL解釋的表型變異比率。

aNegative additive effect indicates that the allele from resistant parent Beinhart1000-1 decreases the value of the trait (disease index).bPercentage of phenotypic variation explained by the QTL.

3 討論

由于用于構(gòu)建作圖群體的雙親間親緣關(guān)系較近, 因此, 本研究中用于構(gòu)建遺傳連鎖圖譜的標(biāo)記較少, 且標(biāo)記的多態(tài)性水平較低(1.76%; 677/38,437), 遠(yuǎn)低于Bindler等[31]所用標(biāo)記的多態(tài)率(46.16%; 2363/5119)。本研究利用670個(gè)多態(tài)SSR標(biāo)記構(gòu)建的圖譜中雖然也包含24個(gè)連鎖群(與普通栽培煙草中所擁有的24對(duì)染色體一致), 但仍然存在標(biāo)記數(shù)目較少的連鎖群, 尤其是LG05連鎖群其上僅有13個(gè)標(biāo)記。相較于Bindler等[31]公布的含有2363個(gè)SSR標(biāo)記分布在24個(gè)連鎖群上且覆蓋全基因組3270 cM的高密度煙草遺傳連鎖圖譜, 我們構(gòu)建的圖譜有待進(jìn)一步完善。其差距在于: 1) 作圖的親本材料不同。本研究所用的材料均屬于栽培煙草且紅花大金元與Beinhart1000-1間具有很近的(或相似的)親緣關(guān)系; 而B(niǎo)indler等[30-31]使用的2個(gè)親本材料間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(雙親間的遺傳相似性系數(shù)GS≈0.385), 接近于栽培煙草與野生煙草間的親緣關(guān)系。2) 基因型分析所使用的試驗(yàn)檢測(cè)系統(tǒng)不同。本研究使用的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)系統(tǒng)(6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠和銀染顯色)的分辨率及靈敏度均較低; 而B(niǎo)indler等[30-31]的檢測(cè)系統(tǒng)(Applied Biosystems 3100 Genetic Analyzers)很靈敏, 因此, 那些具有較小片段長(zhǎng)度差異的標(biāo)記很可能在我們的試驗(yàn)系統(tǒng)中無(wú)法檢測(cè)出來(lái)。

本研究所使用的2個(gè)親本材料的赤星病抗性表現(xiàn)剛好呈現(xiàn)出2個(gè)極端且沒(méi)有超親遺傳現(xiàn)象在F2群體中表現(xiàn)出來(lái)(即, F2群體中的赤星病病情指數(shù)變異范圍完全包含在抗、感兩親本的赤星病DI值內(nèi))。這表明, 所有的抗、感病等位基因分別來(lái)自抗、感病親本。此外, 在不計(jì)上位性效應(yīng)的前提下, 兩親本間不同的DI值(91.28-7.39= 83.89)應(yīng)該是由加性效應(yīng)的累積產(chǎn)生的。QTL定位的結(jié)果也與赤星病田間表型數(shù)據(jù)在兩親本和F2群體中的分布相符合, 即所檢測(cè)到的2個(gè)低DI值QTL的等位基因均來(lái)自抗病親本Beinhart1000-1。根據(jù)加性效應(yīng)值且不計(jì)上位性效應(yīng)的前提下, 檢測(cè)到的2個(gè)QTL共同解釋了兩親本間53.58 [2′(15.87+10.92)]或約64% (53.58/83.89)的加性效應(yīng)值。這就意味著, 通過(guò)利用在抗病親本Beinhart1000-1中的2個(gè)QTL對(duì)應(yīng)的等位基因與感病親本紅花大金元替換后, 紅花大金元的DI值如預(yù)期一樣地由89.25降低至39.73。因此, 本研究篩選獲得的2個(gè)QTL可應(yīng)用于煙草抗赤星病的分子標(biāo)記輔助育種。

前人關(guān)于煙草赤星病抗病基因QTL定位分析的研究主要集中在抗病烤煙品種凈葉黃上[17-19], 通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)(二者用于QTL定位的標(biāo)記和連鎖群順序是相同的, 均按照Bindler等[31]公布的連鎖群排序), Tong等[17]獲得的3個(gè)源自?xún)羧~黃的赤星病抗性QTL與本研究獲得的2個(gè)QTL不同, 前者分別位于第3 (LG03)、第4 (LG04)和第17 (LG17) 3個(gè)連鎖群上, 而后者分別位于第20 (LG20)和第23 (LG23) 2個(gè)連鎖群上。因此, 源自?xún)羧~黃與源自Beinhart1000-1的赤星病抗性基因(QTL)是不同的。目前僅有1篇基于Beinhart1000-1的赤星病抗性QTL定位分析研究[20], 雖也檢測(cè)獲得2個(gè)QTL(分別位于第7和第15連鎖群上的RBS-1和RBS-2), 但二者因使用的標(biāo)記和連鎖圖譜不同而無(wú)法進(jìn)一步將同是源自Beinhart1000-1赤星病抗性的4個(gè)QTL間的關(guān)系進(jìn)行比較。

本研究通過(guò)對(duì)2個(gè)QTL兩側(cè)的標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè), 在362個(gè)F2單株中分別有5株和3株與紅花大金元和Beinhart1000-1一致的基因型單株, 其平均DI值分別為85.93 (變異范圍為78.38~91.57)和17.96 (變異范圍為9.49~26.17)。所以, 這兩組的DI值差異為85.93–17.96= 67.97 (占兩親本間DI值差異的81%), 解釋了23%的加性效應(yīng)值(2個(gè)QTL共同解釋了64%)。這說(shuō)明, 在2個(gè)QTL的加性效應(yīng)中存在著兩兩間的互作效應(yīng)(上位性效應(yīng)), 這也正解釋了兩親本間剩余19% (100%~81%)的DI值。與預(yù)期一致, 上位性效應(yīng)與加性效應(yīng)均在同一方向上提高兩親本間DI值的差異。因此, 在2個(gè)QTLs中與Beinhart1000-1基因型相同的單株可能是赤星病抗性最優(yōu)的。

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Mapping of quantitative trait loci conferring resistance to brown spot in cigar tobacco cultivar Beinhart1000-1

TONG Zhi-Jun, ZHANG Yi-Han, CHEN Xue-Jun, ZENG Jian-Min, FANG Dun-Huang*, and XIAO Bing-Guang*

Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences / Key Laboratory of Tobacco Biotechnological Breeding / National Tobacco Genetic Engineering Research Center, Kunming 650021, Yunnan, China

Tobacco brown spot (TBS) caused byis one of the most destructive foliar diseases affecting tobacco (L) production and quality in China. Breeding TBS-resistant cultivars is difficult by traditional method because the resistance has proved to be quantitatively inherited. To facilitate marker-assisted selection, we carried out a study of mapping quantitative trait loci (QTLs) for TBS resistance. We developed an F2population consisting of 362 individuals from a cross between a TBS-susceptive flue-cured tobacco Honghua Dajinyuan (HD) and a TBS-resistant cigar tobacco cultivar Beinhart1000-1, and constructed a genetic map consisting of 670 SSR markers based on this population. Using disease index (DI) as the indicator of TBS resistance, we detected two QTLs located between SSR markers TMs05179 and TMs04022, and TM61049 and TM62212 on linkage group (LG) 20 and LG23, respectively. The resistant alleles of the two QTLs were all from the resistant parent Beinhart1000-1. The two QTLs together could explain 81% of the DI difference between the two parents in total, and 64% of their additive effects. Therefore, the two QTLs will be useful for TBS resistance breeding.

tobacco brown spot (TBS); simple sequence repeats (SSR); genetic linkage map; quantitative trait locus (QTL)

2018-03-05;

2018-12-24;

2019-01-05.

10.3724/SP.J.1006.2019.84035

方敦煌, E-mail: fdhkm@sina.com; 肖炳光, E-mail: xiaobg@263.net

E-mail: tzj861@163.com

本研究由云南省基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2018FB064), 中國(guó)煙草總公司項(xiàng)目(110201601027(JY-01), 110201603008)和中國(guó)煙草總公司云南省公司項(xiàng)目(2017YN01, 2016YN23)資助。

This study was supported by the Fundamental Research Program of Yunnan Province (2018FB064), China National Tobacco Company (110201601027 (JY-01), 110201603008), and Yunnan Tobacco Company (2017YN01, 2016YN23).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190103.0910.004.html