PRP、PRF聯(lián)合脂肪來(lái)源干細(xì)胞治療慢性皮膚潰瘍研究

陳 陽(yáng)，宋良萍，何 宇，陳 瑛，彭 錚

（1 福州市皮膚病防治院整形美容外科，福建 福州,350025；2 福州國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心，福建 福州,350001）

糖尿病、創(chuàng)傷感染、動(dòng)脈供血不足、靜脈回流不暢以及壓迫等因素引起的慢性皮膚潰瘍，是臨床上的常見病、多發(fā)病[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，目前以糖尿病繼發(fā)足部皮膚潰瘍?yōu)樽畛Ｒ姡瑑H我國(guó)就早已有1000萬(wàn)以上的糖尿病足患者，其中又以老年人居多；因組織再生修復(fù)能力差，潰瘍經(jīng)久不愈，或愈后又迅速?gòu)?fù)發(fā)，形成難愈性潰瘍，其創(chuàng)面修復(fù)一直是醫(yī)學(xué)上的難題[2,3]。脂肪來(lái)源干細(xì)胞（adiposederived stem cell，ADSC）是一種具有多項(xiàng)分化潛能的多能干細(xì)胞，來(lái)源豐富，分離培養(yǎng)容易，自體應(yīng)用無(wú)免疫排斥反應(yīng)和繼發(fā)傳染病風(fēng)險(xiǎn)，已成為組織工程研究中常用的種子細(xì)胞[4-7]。近年的研究表明其對(duì)心、肺、皮膚、肌肉等組織創(chuàng)傷具有促進(jìn)愈合和功能恢復(fù)的作用[8,9]。富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）是通過(guò)離心分離自體全血而得到的血小板濃縮物，經(jīng)激活后能釋放出大量高濃度的生長(zhǎng)因子，刺激細(xì)胞增殖分化及新組織的形成，從而促進(jìn)創(chuàng)傷的修復(fù)和愈合[10-13]。而富血小板纖維蛋白（platelet rich fibrin，PRF），是一種富含細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的自體來(lái)源的新型生物材料，被譽(yù)為新一代血小板濃縮物；其分子結(jié)構(gòu)類似天然血凝塊，為組織細(xì)胞提供遷移、增殖和分化的場(chǎng)所[14-16]。為此，我們開展PRP、PRF聯(lián)合脂肪來(lái)源干細(xì)胞治療皮膚潰瘍的實(shí)驗(yàn)研究，以觀察它們對(duì)皮膚潰瘍修復(fù)的效果，以期為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器超凈工作臺(tái)(蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司)、CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)、倒置顯微鏡、熒光顯微鏡(日本Olympus公司)、輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(RM2235型，LEICA公司)、病理組織漂烘儀(tec 2500型、常州市郝思琳儀器設(shè)備有限公司)、顯微鏡(BX43型，OLYMPUS公司)、移液器(北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、細(xì)胞培養(yǎng)皿/細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó)Fisher Scientific公司)、低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(TDZ4-WS型，湖南湘儀)、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器公司，型號(hào)TGL-16)、臺(tái)式低速離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器公司，型號(hào)TDZ4-WS)、倒置生物熒光顯微鏡(IX73型,Olympus公司)等。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)、SD大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基、胰酶、I型膠原酶(美國(guó)Gibco公司)、胎牛血清(Gibco公司)、HaCaT細(xì) 胞(赫貝公司細(xì)胞庫(kù))、纖維蛋白膠(廣州倍繡公司)，Tegaderm(3M公司)，抗體(AnaSpec公司)，蘇木精(sigma公司)，伊紅(sigma公司)，青霉素鈉、青霉素鈉(美侖生物公司)、DAPI、D9542(sigma公司)、細(xì)胞角蛋白antibody(proteintech公司)、生理鹽水(辰欣藥業(yè)有限公司)

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)24只SD大鼠購(gòu)自上海斯萊克有限公司，SCXK(滬）2017-0005，合格證號(hào)：20170005004523。飲用水為超純水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房使用許可證號(hào)為SYXK(浙)2015-0008，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度范圍20～25℃，相對(duì)濕度范圍 40～70%。實(shí)驗(yàn)前在動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，飼料由江蘇協(xié)同生物工程有限責(zé)任公司提供，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn) GB14924.3-2010《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物配合飼料營(yíng)養(yǎng)成分》。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞(ADSCs)的分離、培養(yǎng)取8周齡SD大鼠4只，10 g/L戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，750 ml/L乙醇消毒腹股溝處，無(wú)菌條件下取腹股溝部的脂肪組織約5g，去除血管及其它組織，用含青、鏈霉素的PBS反復(fù)沖洗以除去血液。用剪刀將脂肪組織剪成1mm3小塊，置于12.5 ml I型膠原酶中，37℃搖床100 r/min消化50 min，然后800r/min離心5 min，棄去上層的脂肪及上清，沉淀物用含100 ml/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以2×105/ml的密度接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，原代2 d后換液，細(xì)胞長(zhǎng)滿80%時(shí)用胰酶和EDTA消化傳代培養(yǎng)。

1.2.2 SD大鼠脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞(ADSCs) 體外成表皮誘導(dǎo)分化及免疫熒光鑒定第3代ADSCs細(xì)胞，用0.25% Typsin消化，1000rpm離心5min，計(jì)數(shù)板下計(jì)數(shù)，鋪1個(gè)24孔板，選擇4個(gè)孔每孔均加入5×104個(gè)細(xì)胞，分別放入培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。細(xì)胞長(zhǎng)滿80%后，兩個(gè)孔作為對(duì)照正常培養(yǎng)，另兩個(gè)孔加入HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)上清液聯(lián)合表皮生長(zhǎng)因子(EGF)10%作為培養(yǎng)基，2d換一次液，培養(yǎng)一個(gè)星期后。吸棄培養(yǎng)基，PBS洗3×3min，4%多聚甲醛室溫固定20min，PBS洗3×3min，0.1%Triton X-100室溫破膜20min，PBS洗3×3min，10% FBS室溫封閉1h，PBS洗一遍，加入適當(dāng)稀釋比例的一抗（CK191:300），4℃孵育過(guò)夜，PBS洗3×3min，加入適當(dāng)稀釋比例的熒光二抗Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)ReadyProbes? Secondary Antibody（1:800），4℃避光孵育1h，PBS洗3×3min，加入10ng/ml的DAPI，4℃避光孵育10min；PBS洗3×3min，倒置熒光顯微鏡下觀察拍照，完成免疫熒光檢測(cè)。

1.2.3 SD大鼠脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞(ADSCs) 體外成脂誘導(dǎo)分化及染色鑒定取第3代ADSCs細(xì)胞接種于預(yù)先放置玻片的6孔板內(nèi)，用含100 ml/L FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，達(dá)到80%融合后，用成脂誘導(dǎo)液(含1μmol/L地塞米松、10μmol/L牛胰島素、200 μmol/L吲哚美辛、0.5 μmol/L的IBMX、10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，20 d后用4%多聚甲醛固定，油紅O染色。

1.2.4 SD大鼠脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞(ADSCs) 體外成骨誘導(dǎo)分化及染色鑒定另取第3代ADSCs細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)板中加入成骨誘導(dǎo)液(含50μmol/L抗壞血酸、10 mmol/L的β-磷酸甘油鈉、0.01μmol/L的維生素D及100ml/L FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基)培養(yǎng)，3～4 d換液1次。培養(yǎng)10 d時(shí)，取部分細(xì)胞爬片行I型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色。培養(yǎng)21 d時(shí)，取部分細(xì)胞爬片行von Kossa染色觀察礦化結(jié)節(jié)的形成。

1.2.5 SD大鼠脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞(ADSCs)體外成軟骨誘導(dǎo)分化及染色鑒定再取第3代ADSCs細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)板中加入成軟骨誘導(dǎo)液（含10%胎牛血清、10 μg/L TGF-β1、6.25mg/L胰島素、6.25 mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白、50 μmol/L抗壞血酸-2-磷酸酯）培養(yǎng)，每2 d更換1次誘導(dǎo)培養(yǎng)基，21 d后行阿爾辛藍(lán)染色，觀察有無(wú)藍(lán)色結(jié)節(jié)形成。

1.2.6 PRP制備抽取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠靜脈血10ml，枸櫞酸二鈉抗凝，采用改良的Appel法分離提取PRP備用，同時(shí)進(jìn)行全血及PRP血小板計(jì)數(shù)，以確保PRP中血小板數(shù)量是全血的4倍以上[17,18]。

1.2.7 PRF制備抽取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠靜脈血10ml，置于無(wú)抗凝血酶的無(wú)菌試管中，立即將試管以3000r/min離心10min，靜置后，血液樣本分為3層，在位于底層的紅細(xì)胞碎片和位于頂層的淡黃色澄清液體血小板血漿之間，取出中間層的淡黃色凝膠，即為富血小板纖維蛋白(PRF)。棄上清，去除凝膠狀物底部的紅細(xì)胞部分，獲得初級(jí)的PRF凝膠，再將其靜置于干燥消毒的容器內(nèi)10min，使其自然收縮并釋放其內(nèi)的血清，或用無(wú)菌紗布吸附血清，同時(shí)經(jīng)擠壓塑形制備出具有一定形態(tài)、彈性及韌性的富血小板纖維蛋白膜[19,20]。

1.2.8 動(dòng)物皮膚潰瘍模型制備及治療SD大鼠麻醉后于其背部脊柱兩側(cè)制作 6個(gè)1.5cm×1.5cm大小的全層皮膚缺損潰瘍創(chuàng)面（圖1），并隨機(jī)分為A、B、C、D、E、F六組，給藥治療。A組創(chuàng)面注射PRF聯(lián)合ADSCs治療，B組創(chuàng)面注射PRF治療，C組創(chuàng)面注射ADSCs治療，D組創(chuàng)面注射ADSCs聯(lián)合PRP治療，E組創(chuàng)面注射PRP治療，F(xiàn)組創(chuàng)面注射等量生理鹽水(NS)治療。治療后7、14、21、28d潰瘍創(chuàng)面取活檢行組織病理學(xué)檢查和觀察潰瘍愈合的速度和質(zhì)量以及比較各自的表皮、真皮、成纖維細(xì)胞、血管及皮膚附屬結(jié)構(gòu)的再生情況。

2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 ADSCs的觀察及多向誘導(dǎo)分化檢測(cè)

顯微鏡下ADSCs呈長(zhǎng)梭形生長(zhǎng)，大小均勻一致，類似成纖維細(xì)胞（圖2）。ADSCs細(xì)胞在HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)上清液聯(lián)合表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的體外誘導(dǎo)后，表皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白細(xì)胞角蛋白含量明顯增加，表明細(xì)胞誘導(dǎo)成功（圖3）。ADSCs成脂誘導(dǎo)20d，看見細(xì)胞內(nèi)充滿圓形脂滴，呈單房或多房，油紅O染色呈橘紅色，說(shuō)明為成熟脂滴（圖4A）。成骨誘導(dǎo)21d，可見細(xì)胞聚集且表面形成不透光結(jié)節(jié)，茜素紅染色呈紅色，說(shuō)明鈣結(jié)節(jié)形成（圖4B）。成軟骨誘導(dǎo)21d，可見細(xì)胞聚集成團(tuán)，阿新藍(lán)染色呈藍(lán)色結(jié)節(jié)，說(shuō)明有軟骨結(jié)節(jié)形成（圖4C）。提示ADSCs在體外能夠向脂肪、骨、軟骨系細(xì)胞分化，有多向分化潛能，具有干細(xì)胞特性。

圖1 SD大鼠背部皮膚潰瘍模型

2.1 A、B、C、D、E、F六組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各組大鼠創(chuàng)面愈合效果良好，未出現(xiàn)感染等癥狀。7天時(shí)已無(wú)明顯炎性細(xì)胞，傷口被結(jié)締組織增生形成的肉芽組織填滿，其內(nèi)可見新生毛細(xì)血管，成纖維細(xì)胞等修復(fù)細(xì)胞；表皮層出現(xiàn)并增厚，逐漸向創(chuàng)口處遷移，再上皮化增生活躍（圖5，圖6）。14天時(shí)再上皮化階段完成，肉芽組織被表皮覆蓋，并逐漸纖維化，膠原纖維等含量顯著增加，可見新生的毛囊、皮脂腺、汗腺、角質(zhì)層等附屬結(jié)構(gòu)（圖7，圖8）。21天時(shí)，皮膚創(chuàng)面基本愈合，各組愈合速度無(wú)明顯差異，同時(shí)毛囊、皮脂腺、汗腺、角質(zhì)層等附屬結(jié)構(gòu)增多，肉芽組織逐漸向瘢痕組織轉(zhuǎn)化，并進(jìn)入組織重塑期（圖9，圖10）。28天與21天比較無(wú)明顯變化，組織進(jìn)入漫長(zhǎng)重塑期（圖11，圖12）。愈合狀況：D組（ADSC+PRP組）、A組（ADSC+PRF組）和C組（ADSC組）表皮較完整，血管新生明顯增多，以D組最明顯，A、C、E、B組依次，F(xiàn)組表皮遷移速度最慢，血管相對(duì)較少；新生毛囊明顯增多，以D組最明顯，A、C、E、B組依次，F(xiàn)組最少。

愈合速度與質(zhì)量大致為ADSC+PRP＞ADSC+PRF＞ADSC＞PRP＞PRF＞NS。

圖2 ADSCs呈梭形（×40）

3 討論

創(chuàng)面愈合是一個(gè)復(fù)雜而有序的生物學(xué)過(guò)程，呈現(xiàn)高度的整體性和網(wǎng)絡(luò)性，在 機(jī)體的調(diào)控下，炎性細(xì)胞、修復(fù)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞因子等多因素相互協(xié)調(diào)，共同參與創(chuàng)面愈合[21]。一般認(rèn)為創(chuàng)面修復(fù)緩慢甚至修復(fù)停止的原因主要有以下4種：①傷口感染或壞死組織存在；②傷口血供微循環(huán)障礙；③局部生長(zhǎng)因子數(shù)量 減少，活性降低或多種生長(zhǎng)因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)失控；④修復(fù)細(xì)胞支架改變和過(guò)度凋亡，細(xì)胞膜上受體結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致生長(zhǎng)因子與受體之間失偶聯(lián)[22]。因此，移植補(bǔ)充新鮮的創(chuàng)面修復(fù)細(xì)胞和有活性的生長(zhǎng)因子成為目前慢性潰瘍創(chuàng)面修復(fù)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。ADSC是存在于脂肪組織中的一類成體干細(xì)胞，具有來(lái)源豐富、取材方便、創(chuàng)傷小、體外分離培養(yǎng)容易、可塑性強(qiáng)、自體應(yīng)用無(wú)免疫排斥反應(yīng)和繼發(fā)傳染病風(fēng)險(xiǎn)等優(yōu)勢(shì)，已成為再生醫(yī)學(xué)研究中很有前途的種子細(xì)胞[23]。本研究觀察到ADSC對(duì)創(chuàng)面愈合具有一定的促進(jìn)作用，推測(cè)這可能與干細(xì)胞具有補(bǔ)充和分化成為皮膚潰瘍創(chuàng)面修復(fù)所需的多系細(xì)胞密切相關(guān)。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)ADSC具有改善皮膚潰瘍創(chuàng)面愈合質(zhì)量的作用，使創(chuàng)面肉芽組織中成纖維細(xì)胞增多，功 能旺盛，血管密度提高，形成的新生表皮較完整、更厚。

圖3 ADSCs成表皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化及鑒定

圖4 ADSCs成脂、成骨和成軟骨誘導(dǎo)分化及鑒定

圖5 六組SD大鼠背部皮膚潰瘍治療7天創(chuàng)面大體愈合情況

圖6 六組SD大鼠背部皮膚潰瘍治療7天創(chuàng)面病理活檢切片光鏡下所見

圖7 六組SD大鼠背部皮膚潰瘍治療14天創(chuàng)面大體愈合情況

圖8 六組SD大鼠背部皮膚潰瘍治療14天創(chuàng)面病理活檢切片光鏡下所見

圖9 六組SD大鼠背部皮膚潰瘍治療21天創(chuàng)面大體愈合情況

圖10 六組SD大鼠背部皮膚潰瘍治療21天創(chuàng)面病理活檢切片光鏡下所見

圖11 六組SD大鼠背部皮膚潰瘍治療28天創(chuàng)面大體愈合情況

圖12 六組SD大鼠背部皮膚潰瘍治療28天創(chuàng)面病理活檢切片光鏡下所見

PRP是血小板濃縮物，經(jīng)激活后能釋放出大量高濃度的生長(zhǎng)因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、骨形成蛋白(BMPs)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、類胰島素生長(zhǎng)因子(IGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)等[24]，這些生長(zhǎng)因子具有誘導(dǎo)表皮細(xì)胞遷移、增殖、分化和促進(jìn)第三、第四型的膠原蛋白有效增生的作用，從而促進(jìn)創(chuàng)面的愈合。而且真皮干細(xì)胞增殖、分化，與血小板的濃度有直接正關(guān)聯(lián)性，血漿濃度達(dá)到正常血小板濃度的4～5倍時(shí)，在優(yōu)良的環(huán)境下，才會(huì)引起細(xì)胞的增殖與分化[25]。

目前研究證明，PRF富含的多種生長(zhǎng)因子可協(xié)同作用，促進(jìn)Ⅰ型膠原及纖連蛋白的合成，促進(jìn)基質(zhì)干細(xì)胞的趨化及增殖，刺激成纖維細(xì)胞及血管內(nèi)皮的分化增殖在組織愈合過(guò)程中起重要調(diào)控作用[26]；PRF的三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)作為基質(zhì)，為細(xì)胞的附著、遷移以及分化提供了有利的場(chǎng)所，使組織細(xì)胞及循環(huán)血中的干細(xì)胞能更快的長(zhǎng)入其中，且這種結(jié)構(gòu)彈性好，孔隙大，利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及氧氣的彌散，加速愈合過(guò)程[27]；大量的滯納的血小板及生長(zhǎng)因子與纖維蛋白發(fā)生化學(xué)鍵結(jié)合，這種特殊的結(jié)構(gòu)與多種生長(zhǎng)因子有較強(qiáng)的親和力，從而使生長(zhǎng)因子緩慢釋放，延長(zhǎng)PRF在創(chuàng)口的作用時(shí)間[28]；也有研究表明，PRF的立體結(jié)構(gòu)可以滯納大部分白細(xì)胞，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，并使多種細(xì)胞因子緩慢持續(xù)釋放，對(duì)于組織修復(fù)產(chǎn)生積極效果[29]。

本研究發(fā)現(xiàn)，單純的ADSC或單純的PRP、PRF對(duì)創(chuàng)面愈合也有一定的促進(jìn)作用，但效果不如兩者聯(lián)合應(yīng)用。其原因可能是，在創(chuàng)面愈合過(guò)程中，ADSC起到種子細(xì)胞的作用，在機(jī)體內(nèi)環(huán)境的誘導(dǎo)作用下向組織細(xì)胞分化，而PRP起到營(yíng)養(yǎng)的作用，同時(shí)，PRP中各種高濃度有活性的生長(zhǎng)因子可促進(jìn)ADSC的增殖分化，增加修復(fù)細(xì)胞數(shù)量，這些修復(fù)細(xì)胞通過(guò)旁分泌和自分泌形式分泌生長(zhǎng)因子又可以作用于周圍細(xì)胞及細(xì)胞自身；而PRF的三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)則作為基質(zhì)，為細(xì)胞的附著、遷移以及分化提供了有利的場(chǎng)所，從而構(gòu)成了一個(gè)良性循環(huán)，各自聯(lián)合起到協(xié)同修復(fù)的效果，促進(jìn)創(chuàng)面的愈合和改善愈合質(zhì)量。另外，本研究發(fā)現(xiàn)愈合速度與質(zhì)量大致為ADSC+PRP＞ADSC+PRF＞ADSC＞PRP＞PRF＞NS，推測(cè)ADSC在皮膚潰瘍創(chuàng)面愈合中發(fā)揮的作用大于PRP和PRF，而RPR的作用又大于PRF，其具體分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。