肺結(jié)核患者T輔助細(xì)胞、NKT細(xì)胞、NK細(xì)胞水平與疾病發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系

李利娟

[摘要] 目的 研究肺結(jié)核患者T輔助細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞（NKT細(xì)胞）、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）水平與疾病發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系。 方法 選取2015年12月～2016年12月四川大學(xué)華西廣安醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）收治的肺結(jié)核病患者100例，選取同期我院體檢的健康者100例;根據(jù)初診、復(fù)診、結(jié)核菌素情況將其分為四組（Ⅰ～Ⅳ組分別為初診肺結(jié)核組、復(fù)診肺結(jié)核組、結(jié)合菌素陽(yáng)性健康組、結(jié)合菌素陰性健康組）。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)四組治療前外周血T細(xì)胞、NKT、NK細(xì)胞表達(dá)率。 結(jié)果 與Ⅲ組比較，Ⅰ組患者NKT細(xì)胞表達(dá)率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），兩組T細(xì)胞及NK細(xì)胞表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）;與Ⅳ組比較，Ⅰ組患者NKT細(xì)胞表達(dá)率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），兩組T細(xì)胞及NK細(xì)胞表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）;與Ⅰ組比較，Ⅱ組患者T細(xì)胞表達(dá)率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），但兩組NKT細(xì)胞及NK 細(xì)胞表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）;Ⅲ組及Ⅳ組在T細(xì)胞、NK、NKT細(xì)胞表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。Ⅰ組患者中輕癥、中癥及重癥亞組T細(xì)胞表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），表達(dá)率：重癥>中癥>中輕癥。三個(gè)亞組的NKT細(xì)胞及NK細(xì)胞表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。100例肺結(jié)核患者治療后均隨訪6個(gè)月，2例痰菌復(fù)陽(yáng)，1例病灶惡化，其余均未復(fù)發(fā)。 結(jié)論 初診患者T細(xì)胞表達(dá)水平與健康者相當(dāng)，與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。復(fù)診患者T細(xì)胞表達(dá)率明顯升高?；顒?dòng)性結(jié)核患者中NKT細(xì)胞表達(dá)增加。因此，NK、T細(xì)胞測(cè)定可輔助診斷活動(dòng)性結(jié)核。

[關(guān)鍵詞] 肺結(jié)核;T輔助細(xì)胞;NKT細(xì)胞;NK細(xì)胞;預(yù)后

[中圖分類號(hào)] R521? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）01（a）-0098-04

當(dāng)結(jié)核分枝桿菌侵入人體時(shí)，可激活人體先天性及適應(yīng)性免疫防御反應(yīng)，反應(yīng)強(qiáng)度與癥狀呈正相關(guān)[1]。一些患者感染結(jié)核分枝桿菌后立即變?yōu)榛顒?dòng)性結(jié)核病，但大多數(shù)患者體內(nèi)感染結(jié)核菌會(huì)處于終身潛伏感染狀態(tài)[2]。自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）主要參與先天性免疫，T輔助細(xì)胞主要參與適應(yīng)性免疫，自然殺傷T細(xì)胞（NKT細(xì)胞）為新型的免疫細(xì)胞，主要特征為CD3和CD56雙陽(yáng)[3]。NKT細(xì)胞具有NK細(xì)胞及T細(xì)胞的雙重表型功能，可作為先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的連接紐帶[4]。其作用靶點(diǎn)為結(jié)核分枝桿菌胞壁的磷酯酰肌醇甘露糖，當(dāng)NKT細(xì)胞被激活后，可分泌γ干擾素（INF-γ），抑制結(jié)核菌正?；顒?dòng)，并分泌具有殺傷作用的顆粒素[5]。肺結(jié)核患者免疫作用復(fù)雜，本研究探討了肺結(jié)核患者T輔助細(xì)胞、NKT細(xì)胞及NK細(xì)胞的表達(dá)，旨在分析上述細(xì)胞對(duì)結(jié)核病診治及預(yù)后的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年12月～2016年12月四川大學(xué)華西廣安醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）收治的肺結(jié)核病患者100例，包括61例初診患者和39例復(fù)診患者。所有患者均符合《臨床診療手冊(cè)（結(jié)核病分冊(cè)）》[6]的診斷標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)痰抗酸桿菌涂片檢驗(yàn)確診為肺結(jié)核，且人類免疫缺陷病毒（HIV）呈陰性。其中男73例，女27例;年齡17～70歲，平均（41.6±6.7）歲。另選取同期我院體檢且X線胸片未見(jiàn)異常的健康者100例。其中56例結(jié)核菌素皮試陽(yáng)性，44例陰性。根據(jù)初診、復(fù)診、結(jié)核菌素情況將其分為四組，各組的基本資料：①初診肺結(jié)核組（Ⅰ組）：共61例，其中男42例，女19例;年齡19～68歲，平均（40.2±5.5）歲。根據(jù)患者的肺部病變、空洞、發(fā)熱等癥狀，由2位醫(yī)生根據(jù)《結(jié)核病的診斷標(biāo)準(zhǔn)和分類（續(xù)1）臨床與X線表現(xiàn)》[7]將患者分為輕癥、中癥及重癥亞組，分別有15、22、24例。②復(fù)診肺結(jié)核組（Ⅱ組）：共39例，其中男31例， 女8例;年齡23～71歲，平均（42.6±6.0）歲。③結(jié)核菌素陽(yáng)性健康組（Ⅲ組）：共56例，其中男21例，女35例;年齡21～67歲，平均（34.7±5.1）歲。④結(jié)核菌素陰性健康組（Ⅳ組）：共44例，其中男16例，女28例;年齡20～67歲，平均（38.9±6.4）歲。四組在治療前的一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入選者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)? ①符合結(jié)核病診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)檢測(cè)證實(shí)為肺結(jié)核;②同意參與并簽署知情同意書。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)? ①合并糖尿病、免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病、腫瘤;②痰培養(yǎng)為非結(jié)核分枝桿菌;③合并嚴(yán)重疾病;④孕期或哺乳期婦女;⑤HIV感染者及AIDS患者;⑥未收集到完整資料。

1.3 方法

使用EPICS XL流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter公司，美國(guó)）檢測(cè)治療前四組的外周血T細(xì)胞、NKT、NK細(xì)胞表達(dá)率。住院第1天清晨采集5 mL空腹肝素鈉抗凝血，進(jìn)行熒光標(biāo)記，取100 μL全血與CD3-FITC/（CD16+CD56）-PE抗體室溫下反應(yīng)20 min，OptiLyse C溶血素溶血，磷酸鹽緩沖液（PBS） 洗滌重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀待測(cè)。使用EPICS XL SystemⅡTM Version 3.0，分析淋巴細(xì)胞的前向散射（FS）與側(cè)向散射（SS）細(xì)胞分群，在相應(yīng)的直方圖或散點(diǎn)圖中讀取CD陽(yáng)性表達(dá)率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用ANOVA，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組的不同細(xì)胞表達(dá)率比較

與Ⅲ組比較，Ⅰ組患者NKT細(xì)胞表達(dá)率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），T細(xì)胞及NK細(xì)胞表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）;與Ⅳ組比較，Ⅰ組患者NKT細(xì)胞表達(dá)率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），T細(xì)胞及NK細(xì)胞表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）;與Ⅰ組比較，Ⅱ組患者T細(xì)胞表達(dá)率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），NKT細(xì)胞及NK細(xì)胞表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）;Ⅲ組T細(xì)胞、NK、NKT細(xì)胞表達(dá)率與Ⅳ組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 Ⅰ組中輕癥、中癥及重癥亞組T細(xì)胞表達(dá)率比較

Ⅰ組患者中輕癥、中癥及重癥亞組T細(xì)胞表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 154.493，P < 0.05），表達(dá)率：重癥>中癥>中輕癥。三個(gè)亞組的NKT細(xì)胞、NK細(xì)胞表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)表2。

2.6 治療后隨訪

100肺結(jié)核患者治療后均隨訪6個(gè)月，2例痰菌復(fù)陽(yáng)，1例病灶惡化，其余均未復(fù)發(fā)。

3 討論

肺結(jié)核的發(fā)生與年齡、性別、職業(yè)等因素有關(guān)[8]，絕大多數(shù)患者感染結(jié)核分枝桿菌后并不會(huì)發(fā)病，主要原因是機(jī)體受到刺激后，T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫會(huì)抵抗結(jié)核分枝桿菌，從而產(chǎn)生獲得性免疫。NK細(xì)胞為先天性免疫的重要細(xì)胞。NKT細(xì)胞可增強(qiáng)免疫反應(yīng)，在抗腫瘤、感染、治療自身免疫性疾病、移植中起到重要作用。刺激NKT細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-4（IL-4）及INF-γ等，從而起到免疫調(diào)節(jié)作用;NKT細(xì)胞同時(shí)存在NK細(xì)胞樣細(xì)胞毒活性，可釋放穿孔素、Fas配體等溶解靶細(xì)胞，從而起到結(jié)核分枝桿菌作用。鄢仁晴等[9]研究表明，肺結(jié)核患者NKT水平顯著高于正常者，T細(xì)胞及NK細(xì)胞則無(wú)顯著差異，3種細(xì)胞水平與年齡、性別等均無(wú)顯著相關(guān)性，因此NKT可作為結(jié)核病活動(dòng)性判斷指標(biāo)。研究[10]表明，NKT和NK細(xì)胞在活動(dòng)性肺結(jié)核患者體內(nèi)表達(dá)率高，且NKT水平顯著低于正常及結(jié)核病接觸者，且其水平在抗結(jié)核治療6個(gè)月內(nèi)一直較低。本研究提示，初、復(fù)診的肺結(jié)核患者NKT細(xì)胞表達(dá)率顯著高于健康者，提示肺結(jié)核患者細(xì)胞免疫異常表現(xiàn)為NKT細(xì)胞增加，加劇了細(xì)胞毒性效應(yīng)，患者NKT細(xì)胞水平有助于辨認(rèn)潛伏感染或活動(dòng)性結(jié)核。結(jié)核菌素陽(yáng)性健康者的結(jié)核菌相對(duì)靜止，未激活NKT細(xì)胞，因此其表達(dá)與結(jié)核菌素陰性健康者類似，均水平較低[11]。但本研究中各組NK細(xì)胞表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與胥萍等[12]研究結(jié)果相似。

T細(xì)胞通過(guò)Th1產(chǎn)生INF-γ、CD8+ T細(xì)胞，釋放顆粒素、穿孔素，以殺死結(jié)核菌[13-19]。本研究結(jié)果提示，初診肺結(jié)核患者與健康者比較，T細(xì)胞表達(dá)水平相當(dāng)。主要原因可能為：①本研究測(cè)定了外周血T細(xì)胞，并不能完全代表病灶局部變化;②與健康者相比，肺結(jié)核患者CD4+ T細(xì)胞水平減少，CD8+ T增加[20-23]。本研究測(cè)定CD3+ T細(xì)胞，為各亞群變化總和，與健康者相當(dāng);③發(fā)病前，初診患者T細(xì)胞水平偏低，但本組患者均為HIV陰性，發(fā)病后T細(xì)胞增加，使之與健康者水平相當(dāng)。本研究結(jié)果提示，外周血T細(xì)胞與初診患者疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，T細(xì)胞增加，疾病更嚴(yán)重，預(yù)后更不好，但與NKT、NK細(xì)胞均無(wú)明顯相關(guān)性，提示T細(xì)胞為主要的免疫反應(yīng)。與初診患者相比，復(fù)診患者T細(xì)胞表達(dá)率顯著增加，可能是由于已致敏細(xì)胞反復(fù)暴露于病原菌，激發(fā)了強(qiáng)烈增生反應(yīng)，提示復(fù)診肺結(jié)核患者免疫反應(yīng)可能與T細(xì)胞所有亞群相關(guān)。T細(xì)胞檢測(cè)有助于了解患者是否復(fù)發(fā)。

綜上所述，T細(xì)胞、NKT細(xì)胞是細(xì)胞免疫重要組成部分，可誘導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌特異性免疫反應(yīng)。初診患者T細(xì)胞表達(dá)水平與健康者相當(dāng)，并與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。復(fù)診患者T細(xì)胞表達(dá)率明顯升高[24-25]?；顒?dòng)性結(jié)核患者中NKT細(xì)胞表達(dá)增加。因此，NKT細(xì)胞測(cè)定可輔助診斷活動(dòng)性結(jié)核。本研究測(cè)定的細(xì)胞均為外周血細(xì)胞，與真實(shí)的病灶細(xì)胞可能存在差異。NKT細(xì)胞在發(fā)病不同階段的免疫效應(yīng)及表達(dá)率的診斷意義及其與不同疾病的關(guān)系尚需進(jìn)一步的研究。

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（收稿日期：2018-07-11? 本文編輯：王? ?蕾）