誘導性多潛能干細胞成骨分化的研究進展

賀旭峰 婁向新 朱華鋒 張慧敏

[摘要] 誘導性多潛能干細胞（iPS Cell）是一種經(jīng)人工誘導重新編程后產(chǎn)生的多潛能分化干細胞。目前，iPS細胞已成功再分化為多種不同的成熟細胞，其中包括成骨細胞。因此，利用iPS細胞誘導成骨以治療骨組織疾病成為一個可期待的選擇。本文回顧了iPS細胞成骨分化的體內(nèi)外研究成果;除此之外，討論了細胞因子及微小RNA（miRNA）對iPS細胞成骨分化的作用;最后，綜述了各類支架對于iPS細胞成骨作用的影響，并分析了相關優(yōu)缺點，以期為進一步實驗及研究提供參考。

[關鍵詞] 誘導性多潛能干細胞;成骨分化;骨重建;成骨細胞

[中圖分類號] R329? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）01（a）-0049-04

誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cell， iPS cell）由日本京都大學Yamanaka研究小組于2006年率先成功制備，他們利用逆轉(zhuǎn)錄病毒，將Oct3/4、Klf4、Sox2和c-Myc基因轉(zhuǎn)入小鼠胚胎成纖維細胞內(nèi)，成功將體細胞重編程為具有多種分化能力的干細胞。2007年該小組將人類的成纖維細胞誘導為iPS細胞[1]。iPS細胞有著與胚胎干細胞相似的分化能力，目前iPS細胞已成功地被分化為多種特異性細胞，相關細胞研究涉及帕金森病[2]、糖尿病[3]、肌萎縮側(cè)索硬化癥[4]、血友病[5]、阿爾茨海默病[6]、牙釉細胞分化[7]等多個方面。iPS細胞的出現(xiàn)對于組織工程及干細胞研究具有劃時代的意義。

雖然骨組織具有一定的再生能力，但骨缺損及骨不連仍是各種骨折后出現(xiàn)的較難處理的臨床問題。據(jù)統(tǒng)計，有5%～10%的骨折后患者均會出現(xiàn)不同程度的骨缺損及骨不連[8]。臨床異體植骨有著免疫排斥的問題，自體移植也有諸如二次創(chuàng)傷及高并發(fā)癥等限制，于是將iPS細胞誘導成骨進行治療成為一個可期待的選擇。目前已有一些相關研究，現(xiàn)綜述如下：

1 iPS細胞的成骨分化體外實驗研究

近年來，越來越多人或鼠類iPS細胞成骨分化研究出現(xiàn)，替代原先只有胚胎干細胞的情況[9]?；诩韧咛ジ杉毎夹g，很多研究利用同樣的技術試圖將iPS細胞分化為成骨細胞[10-11]，并取得成功。

Okamoto等[12]利用含有10%胎牛血清（FBS）等成分的培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠iPS細胞，通過生成胚胎小體（EB）細胞隨后成骨細胞分化，將EB細胞置于含有明膠涂層的培養(yǎng)皿，利用含有地塞米松的培養(yǎng)液培養(yǎng)進行體外成骨細胞分化。另有研究利用未分化的iPS細胞，用緩沖液去除滋養(yǎng)層細胞，然后于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。在EB細胞形成后，將EB細胞播種到培養(yǎng)皿上 ，培養(yǎng)5 d后，將形成的細胞利用過濾器過濾，并培養(yǎng)在誘導成骨液中，進行成骨分化[13] 。Tashiro 等[14]通過懸滴法培養(yǎng)獲得EB細胞，將EB細胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)液，培養(yǎng)皿中懸浮培養(yǎng)3 d，然后在分化培養(yǎng)液中再培養(yǎng)2 d，接著細胞經(jīng)過載體轉(zhuǎn)導，然后在含有明膠涂層培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，最后在成骨分化液中體外成骨分化。

由于體外iPS細胞培養(yǎng)技術的漸漸成熟，有研究不僅探索了成骨嘗試，并進行了相關成骨檢驗和定量。Li等[15]用不同來源生長因子處理的iPS細胞，并對其進行消化處理，然后在成骨分化培養(yǎng)液中培養(yǎng)孵化28 d后，用茜紅素染色觀察定量礦化的程度。Kao等[16]將iPS細胞放在含有FBS、維生素C等成分的培養(yǎng)基中成骨誘導，得到的細胞用PBS沖洗然后固定，最后通過馮庫薩染色和茜紅素染色評估成骨分化。

另外，胚胎干細胞及iPS細胞分化為骨細胞的技術同樣適用于間充質(zhì)干細胞[17]。Deyle等[18]通過iPS細胞生成EB細胞，在培養(yǎng)液中培養(yǎng)，由此生成的間充質(zhì)干細胞（iMSC）誘導為成骨細胞，進行體外成骨分化，表達堿性磷酸酶、RUNX2以及成骨細胞特有的基因骨鈣素，同時體外生成礦物質(zhì)。最后利用茜紅素染色確定鈣的存在。

從體外成骨實驗可以發(fā)現(xiàn)，iPS細胞轉(zhuǎn)化成骨所利用的成骨因子借鑒了之前胚胎干細胞的實驗經(jīng)驗，基本沿襲了相似的成骨因子（如地塞米松、維生素C等）。再者鮮有iPS細胞體外直接進行成骨誘導分化，大多先將iPS細胞誘導培養(yǎng)為EB細胞，或者將其培養(yǎng)為間充質(zhì)干細胞，再進行成骨誘導。結合筆者經(jīng)驗，這很可能與iPS細胞直接誘導成骨的成功率較低有關。

2 iPS細胞的成骨分化體內(nèi)實驗研究

近年來，有研究進一步嘗試了體內(nèi)植入iPS細胞，使其分化為骨組織[19]，該研究顯示人iPS細胞可在裸鼠實驗中分化為牙周類骨組織，他們將iPS細胞移植入鼠類牙槽中，結合牙釉基質(zhì)蛋白復合體，最終形成牙骨質(zhì)。

體內(nèi)iPS細胞的研究除了將細胞直接植入外，很多研究均將細胞與一些介質(zhì)或支架相結合進行體內(nèi)植入。比如利用羥基磷灰石/磷酸鈣基質(zhì)與iPS細胞所分化的間充質(zhì)干細胞相結合，一起移植到免疫缺陷小鼠身上，8周后取出進行研究[18]。Ye等[20]利用絲纖蛋白支架結合iPS細胞進行體內(nèi)實驗。進行細胞消化后，將iPS細胞吸移懸浮在絲纖蛋白支架上，含有iPS細胞的絲纖蛋白支架經(jīng)孵化后將iPS細胞與絲素蛋白三維支架復合體置入顱骨缺損裸鼠模型的顱骨缺損處，觀察其成骨情況。

還有利用明膠海綿作為支架進行體內(nèi)成骨的報道，將明膠海綿浸潤在成骨分化液中，iPS細胞所分化的成骨細胞加入明膠海綿，在小鼠背部縱向切開切口，將帶有已分化成骨細胞的明膠海綿植入切口中縫合，分批培養(yǎng)觀察成骨情況[21]。

此外有報道將iPS細胞誘導所產(chǎn)生的細胞播種于HA/TCP陶瓷支架上，在37℃孵化2 h，確保細胞黏附在陶瓷上。再將帶有細胞的陶瓷支架移植到聯(lián)合免疫缺陷小鼠背部皮下，移植5周后，處死小鼠取出陶瓷支架以研究成骨情況[15]。這項研究已非常接近臨床實用情況。

通過iPS細胞體內(nèi)成骨實驗可以發(fā)現(xiàn)，為了避免免疫反應，大多利用裸鼠進行研究。植入部位有的選擇直接注入皮下，有的則放于骨缺損部位。很明顯，后者研究更具有臨床意義，也是目前研究方向之一。另外，有的實驗選用所分化細胞直接植入體內(nèi)，也有結合支架及介質(zhì)植入體內(nèi)研究。目前報道顯示，細胞結合支架的成骨效果明顯好于單純細胞植入。

除此之外，Polo等[22]研究表明，不同來源誘導的iPS細胞，其基因表達會有不同，與其來源有關，不同來源的iPS細胞似乎仍有與來源相關的“轉(zhuǎn)錄記憶”。因此，基因重編程及表觀遺傳編程機制仍需更深入的研究。當然，來源于骨髓間充質(zhì)干細胞的iPS細胞，其成骨作用已被證實[13]。因此，我們可以選擇不同來源的iPS細胞以選擇最優(yōu)的分化方向，但相關機制仍需進一步深入研究。

3 細胞因子及微小RNA在iPS細胞成骨分化中的作用

在干細胞成骨誘導過程中，比較基本的成骨介質(zhì)為胎牛血清、維生素C、甘油磷酸酯以及地塞米松[23-24]。其他促進因素包括骨形成蛋白（BMP）[9]及維生素D3[25]。有報道顯示BMP在干細胞分化中有著重要的作用[26]。尤其是BMP-2，研究表明在一定條件下對于干細胞的成骨及成軟骨過程有極強的作用[27]。最近一項進展顯示，白藜蘆醇可以促進iPS細胞及胚胎干細胞的成骨分化。實驗中將細胞注射到裸鼠背部皮下組織，觀察和測量體內(nèi)成骨情況。實驗顯示，在糖皮質(zhì)激素環(huán)境下誘導的iPS細胞成骨實驗中，白藜蘆醇可促進iPS細胞分化為類骨細胞，并減少激素對細胞的氧化損傷，減少畸胎瘤的發(fā)生率[16]。

許多研究表明，iPS細胞與胚胎干細胞分化時，對各種因子的反應是有所不同的，同時也報道了將iPS細胞定向到特定細胞的方法[28]。其中，體內(nèi)實驗顯示轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β家族可增強成骨效應及骨重建，Li等[15]的研究揭示了TGF-β1和TGF-β3結合維A酸，能在體外實驗中更好地使iPS細胞進入“間充質(zhì)狀態(tài)”，促使其成骨分化。另一項研究則顯示僅用維A酸也可促進鼠類iPS細胞的成骨分化與增殖[21]。所有這些體內(nèi)外實驗均說明TGF-β家族至少能促進鼠類iPS細胞向成骨細胞分化。

在iPS細胞實驗中，利用腺病毒轉(zhuǎn)導有成骨表達功能的細胞因子Runx2，可加強iPS細胞成骨分化。結果顯示，經(jīng)Runx2轉(zhuǎn)換組的ALP的表達是無Runx2組的2倍，鈣沉積是其8倍[14]。

還有一些其他控制成骨表達的因素，比如微小RNA（miRNA）技術。近期研究表明miRNA在眾多細胞分化中有著作用[29]，以及多種miRNA在干細胞成骨分化中有著重要的作用[30]。Okamoto等[12]確定了6種成骨相關miRNA，包括miR-124a、miR-181a、miR-10a、miR-10b、miR-9-3p、miR-19b，并歸納了這些miRNA在鼠iPS細胞成骨過程中的具體作用。他們發(fā)現(xiàn)BMP-4誘導的成骨與常規(guī)成骨通路中miRNA抑制調(diào)控有關，在這過程中，6種miRNA對控制BMP-4誘導的iPS細胞成骨過程有著重要作用。在以后的研究中，基因治療及應用需要更多數(shù)據(jù)，以證實其有效性及安全性。鑒于已有的臨床應用，BMP2/4及Runx2顯得更具研究潛力[31]。

4 支架在iPS細胞成骨分化的作用

細胞外基質(zhì)對于維持細胞功能和結構有著重要作用。組織工程就是要建立合適的3D支架來模擬細胞外基質(zhì)，使其維持細胞生長及細胞分化。有報道顯示通過在胚胎小體細胞培養(yǎng)皿中放入聚醚砜納米纖維支架及成骨分化液進行培養(yǎng)，成功進行體外成骨分化[32]。與此同時各種材料支架均有文獻報道對iPS細胞成骨分化有著促進作用。

一些骨缺損動物模型研究將iPS細胞移入生物工程支架以加強骨組織重建再生，在實驗中，當iPS細胞移植入免疫缺陷小鼠模型后，這些細胞分裂增殖并形成骨組織[21]。Jin等[33]利用聚己內(nèi)酯3D支架結合人iPS細胞成功進行了成骨分化，實驗中iPS細胞支架聯(lián)合體的成骨作用增強并有顯著差異，這顯示以基于iPS細胞的組織工程支架來治療骨缺損是一個可能的有效方法。尤為重要的是，在iPS細胞置入并逐漸誘導成骨進行到8周，在成骨部位未發(fā)現(xiàn)畸胎瘤組織。這篇報道提示了由iPS細胞誘導成骨治療骨缺損是有效及安全的。

同時，現(xiàn)有體內(nèi)外實驗均顯示與支架相結合，iPS細胞成骨表達均有增加，體內(nèi)天然的成骨細胞外基質(zhì)機構均為納米級，相應的細胞和組織則高度依賴其機構狀態(tài)[34]。近年研究表明iPS細胞和納米纖維支架結合有著良好的成骨效果，納米支架漸成替代細胞外基質(zhì)促進成骨分化的選項之一。

靜電紡絲技術為大規(guī)模制造納米級聚合物支架以及組織工程學提供了重要的技術支持[35]。靜電紡絲技術可以任意選擇所需要的組織材料，為目標細胞提供最優(yōu)的模擬細胞外基質(zhì)。D′Angelo等[36]利用聚乳酸-羥磷灰石納米支架進行iPS細胞分化為間充質(zhì)細胞及成骨細胞的實驗，體內(nèi)外實驗均顯示了穩(wěn)定的成骨分化及增殖。

從目前支架方面研究筆者認為除了體外實驗，需加強研究體內(nèi)環(huán)境對于支架影響iPS細胞分化的作用;另外，各種不同類型支架包括納米支架均對iPS細胞成骨分化有作用或是增強作用，他們之間的差別有待探討。之后的實驗應擴展至多種細胞包括胚胎干細胞及間充質(zhì)干細胞等，以探究對骨缺損的治療，并探討及確定相關標準及條件。

綜上所述，雖然目前iPS細胞研究較多，也有一些令人鼓舞的成果，但要使得應用iPS細胞成骨分化進行骨缺損治療成為一種可靠的方法，仍然一些需要解決的問題：①iPS細胞是否有同胚胎干細胞一樣，有著持續(xù)的表達能力;②體內(nèi)植入iPS細胞是否會形成畸胎瘤[37]，在誘導其成骨分化時，又要抑制其成為畸胎瘤;③iPS細胞進行分化及代謝的外環(huán)境的維持。因此仍有很長一段路需要研究人員艱苦探索，iPS細胞研究尚有巨大潛力有待挖掘。

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（收稿日期：2018-05-08? 本文編輯：金? ?虹）