類風濕關節(jié)炎動物模型研究進展

葉冠成，陳光耀，江雯欣，徐 甜，王嘉鋮，馬 驍

(1．北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學中日友好臨床醫(yī)學院，北京 100029； 3.東南大學公共衛(wèi)生學院，江蘇 南京 210009；4.首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，北京 100069； 5.中日友好醫(yī)院體檢中心，北京 100029)

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以侵蝕性、對稱性多關節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的慢性、全身性自身免疫性疾病，其發(fā)病機制尚不明確，給患者的生活帶來較大的干擾，并降低患者的生活質量[1-2]。其基本的病理改變是滑膜炎和血管炎，常為四肢對稱性多關節(jié)炎癥。病變慢性期所形成的血管翳具有較強的破壞性，是導致關節(jié)破壞、畸形和功能障礙的病理基礎?；镜拿庖吒淖儎t是T、B淋巴細胞的改變，并且患者血清中類風濕因子(rheumatoid factor，RF)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、輔助性T細胞17(T helper cell 17, Th17)等免疫因子的表達亦出現(xiàn)異常[3-4]。良好的RA動物模型作為實驗的前提，在實驗設計中意義重大。近年來，RA動物模型除了經(jīng)典的膠原誘導性關節(jié)炎(collagen induced arthritis，CIA)及佐劑性關節(jié)炎(adjuvant arthritis，AA)模型以外，還有膠原抗體誘導關節(jié)炎(collagen-antibody-induced arthritis，CAIA)模型、降植烷誘導關節(jié)炎(pristante-induced arthritis，PIA)模型、聯(lián)合免疫缺陷小鼠模型、轉基因小鼠關節(jié)炎模型、鏈球菌細胞壁誘導關節(jié)炎模型和卵蛋白(ovalbumin，OVA)誘導的家兔關節(jié)炎模型等，其模型復制的思路主要在于誘導實驗動物的免疫改變。

本病屬于中醫(yī)學“痹病”“歷節(jié)”和“尪痹”等范疇，發(fā)病原因與風、寒、濕邪關系密切，因此從中醫(yī)學角度建立的病證結合模型備受關注。本研究通過梳理當前的文獻資料，對常用的RA模型進行綜述。

1 疾病動物模型

1.1 CIA動物模型 CIA模型由Trentham等于1977年最先創(chuàng)建，后來有較多的學者對其模型復制方法不斷進行補充并使之完善，該方法也是當前應用較為廣泛的模型復制方法。即將牛Ⅱ型膠原蛋白(collagen Ⅱ，CⅡ)溶解于乙酸中，再與不完全弗氏佐劑(incomplete Freund’s adjuvant, IFA)混合至完全乳化，以制備Ⅱ型膠原乳劑，模型復制時使用注射器在大鼠背部和尾巴基底部注射二者的混合劑。為加強效果，在初次免疫后第7天和第14天給予加強注射[5-6]。當前研究認為，實驗動物自身的T和B淋巴細胞的激活在CIA模型的復制過程中發(fā)揮重要作用，疾病的誘導期主要由T細胞介導，其意義在于支持膠原特異性B細胞的活化。B細胞活化后可產(chǎn)生膠原特異性抗體，該抗體可結合關節(jié)中膠原蛋白，最終引起免疫復合物的形成、補體激活和局部炎癥反應等免疫與病理變化[7-8]。

為檢測模型質量，學者們從病理與免疫改變等方面對模型進行評估。在病理改變上，杜成成等[9]發(fā)現(xiàn)部分大鼠足趾在初次免疫10 d后開始腫脹，14 d后模型復制基本成功。顯微鏡下見大鼠踝關節(jié)明顯病變，軟骨組織有增生或增大，軟骨部分細胞消失或變小，滑膜細胞與毛細血管增生，并且間質出現(xiàn)水腫，可見炎細胞浸潤與血管翳。在免疫改變上，鮮瑤瑤等[10]發(fā)現(xiàn)CIA模型大鼠的外周血中Th17細胞升高，Treg細胞下降，而Th17與Treg細胞是CD4+T細胞的兩種亞型，這與人類RA的免疫學變化一致，由此體現(xiàn)了CIA模型的核心原理之一在于模擬人體內T細胞的免疫功能失衡狀態(tài)。CIA模型是當前應用較為廣泛的RA模型，其優(yōu)勢在于模型復制過程簡便，且與主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)相關，而MHC在限制性免疫應答中意義重大，因而模型動物的關節(jié)炎病變和免疫學改變均與人類具有一致性。Alabarse等[11]證實CIA小鼠表現(xiàn)出與RA患者相似的臨床癥狀，如肌肉質量減輕、疲勞加重和虛弱，為此該模型還可很好地模擬RA患者的惡病質綜合征，為該病的治療與預后研究提供更加契合實情的模型。基于上述優(yōu)點，CIA模型是當前公認的RA模型，其在免疫研究、新藥研發(fā)、療效評價等領域為RA的相關研究提供了較大的幫助[12]。但此模型復制方法不統(tǒng)一，且注射劑量因動物體型不同而差異過大，注射部位也不統(tǒng)一，進口的CⅡ試劑價格過高造成經(jīng)費困難，同時實驗的操作難度上升而可重復性下降。

1.2 AA動物模型 AA模型又稱弗氏佐劑關節(jié)炎，由細菌學家Freund創(chuàng)立，是RA動物模型復制的基本方法之一。模型復制方法是于實驗動物尾根部皮下注射或足跖皮下注射完全弗氏佐劑(complete Freund’ adjuvant, CFA)，CFA的主要成分為減毒活卡介苗。若效果不理想，則加強免疫一次。AA的模型復制原理主要是基于卡介苗誘導的分子發(fā)病理論，其來源于65 kDa的抗熱休克蛋白65(heat shock protein 65, HSP65)，HSP65與關節(jié)滑膜上自身抗原HSP60在保守序列上高度相似，使得兩者可以被同一株T細胞克隆識別。從而通過結核桿菌的不斷刺激，造成免疫功能的亢進以引起機體自身的免疫和病理反應[13]。

Kumar等[14]發(fā)現(xiàn)，與模型復制前相比，復制后第5天起模型組Wistar大鼠體質量下降，踝直徑顯著增加，兩只后肢的爪體積顯著增加(P<0.01)。通過病理學研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠滑膜增厚，滑膜間隙減少，出現(xiàn)水腫。水腫和血管損傷導致關節(jié)軟骨亦受損，并有致密的炎癥細胞浸潤。對于模型復制是否成功，則以關節(jié)炎評分和免疫器官指數(shù)等指標作為評價標準。模型復制第5天起，模型組大鼠關節(jié)炎評分逐漸上升，檢測發(fā)現(xiàn)TNF-α增加。TNF-α是炎癥標記物，因此其增加的水平表明炎癥和關節(jié)組織破壞，提示模型復制成功。本法是一種較為經(jīng)典的模型復制方法，其優(yōu)勢在于操作簡便，可重復，試劑易于購買，價格低廉，模型復制效果穩(wěn)定，發(fā)病速度快，而且大鼠的免疫和病理改變與人類RA相近，可以較好地模擬發(fā)病的相關機制。但AA模型由于發(fā)病較快，且發(fā)病的時間不統(tǒng)一，導致其不能較好地反映慢性病理過程[15]。此外，其還會出現(xiàn)發(fā)病程度不均勻，模型復制成功率偏低等問題。若需深入了解RA的病理過程，單純使用AA模型有較大的局限性，還需要結合其他類型的動物模型綜合考慮。

1.3 OVA誘導的關節(jié)炎模型 OVA模型由Dumonde和Glynn于1962年首次建立,OVA是一種外源性抗原。此法包括基礎致敏和局部注射兩個部分，基礎致敏使用OVA生理鹽水在兔肩胛間區(qū)的5個部位進行皮內注射，局部注射是指28 d后，在脛骨結節(jié)最高點與髕骨下緣連線之中點的髕韌帶兩側，雙膝各注射雞卵清蛋白乳劑以加強免疫[16]。該模型的復制原理在于通過皮下反復注射外源性抗原，以促進機體產(chǎn)生大量抗體，使得抗原與抗體在關節(jié)滑膜上沉積，激活機體的免疫細胞與補體系統(tǒng)，并最終產(chǎn)生抗原-抗體-補體免疫復合物，通過該復合物可以誘發(fā)關節(jié)局部的炎癥反應并導致關節(jié)腫脹[17]。

曹慶勇等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在注射24 h后家兔即可出現(xiàn)局部皮膚發(fā)紅、腫脹并伴有發(fā)熱，膝關節(jié)明顯腫脹。2周后家兔關節(jié)腔中充斥膿液，關節(jié)滑膜增厚，關節(jié)腔纖維化，滑膜上皮細胞增生并伴有炎癥細胞浸潤。家兔血清IL-1與TNF-α含量上升，與正常組相比，差異具有統(tǒng)計學意義。這些變化表明模型復制成功。此法當前主要適用于家兔等大型動物，模型復制成功率高，且無需麻醉。由于乳劑對于抗原的釋放作用緩慢，因此可以不斷地對免疫細胞產(chǎn)生刺激作用以延長作用時間，可以更好地模擬慢性病理過程。同時該模型在免疫學和病理學上也較為接近人類RA，如IL-1與TNF-α的增高即是RA患者的常見免疫改變，可用于反映炎癥程度[19]。OVA模型的主要弊端：其對實驗動物的要求較高，多適用于以家兔為代表的大型動物，大鼠和小鼠等小型動物較少使用此法進行模型復制，因而需要較多的經(jīng)費支持；模型復制分為基礎致敏和局部注射兩個部分，導致實驗時間過長；兔源抗體稀少，后續(xù)研究困難，故其應用也受到限制。

1.4 PIA模型 PIA模型是Potter等在1981年首次創(chuàng)立的，隨后有較多的學者對PIA模型進行了一系列研究。降植烷是2,6,10,14-四甲基十五烷(2,6,10,14-tetramethyl-pentadecan)，為一種單純的烷類化合物，由于該佐劑的非免疫原性，因此它不能被T或B細胞特異性識別，其造成關節(jié)炎的原理在于降植烷可以對免疫系統(tǒng)造成非特異性刺激并引起自身反應性T淋巴細胞活化，屬于MHC Ⅱ類分子限制的T細胞依賴性疾病這一范疇[20]。

陶云霞等[21]使用小鼠進行實驗，在小鼠腹腔內注射降植烷，發(fā)現(xiàn)從第18周開始模型組小鼠的關節(jié)部分出現(xiàn)紅腫現(xiàn)象，足部腫脹、關節(jié)增粗，并伴有黏膜紅腫滲出。后足厚度與正常組的差異具有統(tǒng)計學意義。病理顯示實驗小鼠骨關節(jié)結構遭到嚴重破壞，可見壞死脫落的關節(jié)軟骨，關節(jié)腔狹窄，并伴有炎癥細胞浸潤。這些變化均提示模型復制成功。流式細胞儀檢測結果顯示，模型小鼠的樹突狀細胞、吞噬細胞和中性粒細胞亞群數(shù)量上升，同時其T細胞的表達也有明顯變化，小鼠脾臟CD4、CD8以及CD154+T細胞數(shù)量上升，這與RA患者的免疫變化有較多的相似之處。GON?ALVES等[22]發(fā)現(xiàn)，PIA模型在病理上屬于多發(fā)對稱性關節(jié)炎，與人類相似。在基因層面，其可以很好地模擬RA相關基因上調與下調情況，并且發(fā)現(xiàn)miR-132-3p是易感小鼠中上調最多的miRNA，該基因在與關節(jié)炎相關的全身癥狀中發(fā)揮關鍵作用。同時，不同的基因可調控不同的病程階段，因此適于研究人類RA的病理機制，操作也較為便捷，結果易于重復，對實驗動物造成的不適感和對實驗動物的要求也相對較低，因此是一類良好的RA模型[23]。但就目前文獻看，該模型成功率偏低，其對動物與實驗環(huán)境都有較高的要求，且花費較多。

2 病證結合RA動物模型

由于單純西醫(yī)疾病動物模型不能很好地模擬RA與中醫(yī)證候間的關系，因此在中醫(yī)藥研究領域，許多學者在CIA和AA模型的基礎上，根據(jù)中醫(yī)證候的特征，加入中醫(yī)致病因素，模擬RA的中醫(yī)證候進行模型復制。此類模型既能考慮西醫(yī)病因，又具有中醫(yī)特色，在中西醫(yī)結合研究中發(fā)揮重要的作用。目前，常見的有風濕寒阻RA模型、風濕熱郁RA模型、脾虛RA模型和腎虛痹證RA模型。

2.1 風寒濕痹與風濕熱郁RA動物模型 風寒與風熱之邪是RA發(fā)病的主要外邪，由于風性善行而數(shù)變，故其較易侵襲人體薄弱之處，為此復制風寒濕痹與風濕熱郁模型是當前研究的主要思路。魏艷霞利用SD大鼠，將其置于模型復制箱中，給予風速5 m/s，濕度90%～95%，溫度0 ℃的風寒濕刺激14 d。第15天起采用AA模型復制方法復制RA模型，繼續(xù)風寒濕刺激30 d，直到實驗結束[24]。實驗結束后發(fā)現(xiàn)接受風寒刺激的大鼠足腫脹程度和依據(jù)足腫脹容積進行的AI評分均有明顯差異，病理改變亦更加明顯。鎮(zhèn)蘭芳[25]在CIA模型基礎上，每天將大鼠置于人工氣候箱內進行風濕熱刺激，連續(xù)30 d。人工氣候箱內濕度為90%±4%，溫度為(33±2)℃，風力3級。模型復制15 d后出現(xiàn)相應癥狀，大鼠萎靡少動，大便稀溏臭穢，符合濕熱之邪停滯證的表現(xiàn)。關節(jié)炎指數(shù)與正常組相比具有明顯差異，病理發(fā)現(xiàn)滑膜細胞增生，炎癥細胞浸潤，提示模型復制成功。

2.2 瘀血痹阻RA動物模型 瘀血痹阻是RA的常見中醫(yī)證型之一，也是痹證所發(fā)生的主要病機。RA患者常因血脈瘀阻、血行不暢而表現(xiàn)為關節(jié)刺痛，痛有定處，皮下見瘀點瘀斑，舌下絡脈曲張。研究者在西醫(yī)模型復制的基礎上，復制瘀血痹阻病證結合模型。李茜等[26]在CIA模型的基礎上，在大鼠背尾部注射CFA與鹽酸腎上腺素混合溶劑，2 h后將大鼠置于4 ℃冷水中游泳，持續(xù)14 d。觀察發(fā)現(xiàn)實驗組大鼠活動減少，第4天足趾開始腫脹，舌質紫暗或出現(xiàn)瘀點，全血黏度和血漿黏度均高于正常組，其病理和血液流變學改變與血瘀證以及RA表現(xiàn)具有高度的一致性，提示模型復制成功。

2.3 腎虛型RA動物模型 腎主骨生髓，而RA的主要病理改變即是關節(jié)與骨骼的破壞，為此復制合適的腎虛證動物模型，有助于從中醫(yī)角度研究RA的發(fā)病機制與藥物療效。陶黎等[27]先切除SD大鼠雙側卵巢，再復制腎虛證CIA模型，同時為了避免手術因素對模型復制的影響，設立假手術組，即僅切除卵巢周圍的脂肪組織而不切除卵巢。與正常組和假手術組相比，腎虛組大鼠關節(jié)炎指數(shù)明顯高于正常組和假手術組，且病理變化更為嚴重，出現(xiàn)大量破骨細胞，并且血清雌二醇水平降低。這一系列的病理生理改變接近人類RA的相關特征，即RA的病灶部位出現(xiàn)大量成熟的破骨細胞，而腎虛通過影響其功能改變骨骼重建。

2.4 脾虛型RA動物模型 脾虛也是RA發(fā)病的常見證候之一。脾主運化，脾虛則水濕不運而停聚于體內，化而為痰，痰濁阻滯于經(jīng)脈骨骼關節(jié)，發(fā)為痹證。脾又為后天之本，脾虛則正氣不足，不能固護機體而易受外邪侵襲，發(fā)為本病。同時脾虛則水谷精微運化不利，脾虛及腎，腎臟失于濡養(yǎng)，日久腎虛。腎者主水，全身水濕泛濫，元氣不足，風寒易于侵犯人體，亦發(fā)為本病[28]，故復制脾虛證動物模型對于本病的研究具有相應意義。肖誠等[29]給予大鼠腹腔注射利血平，復制脾虛證，14 d后再復制CIA模型。利血平是一種吲哚類生物堿，作用于腎上腺素能神經(jīng)，通過消耗動物體內兒茶酚胺，造成自主神經(jīng)功能絕對或相對亢進，繼而出現(xiàn)納差、活動少、萎靡不振、腹瀉等與脾虛類似的癥狀。肉眼觀察發(fā)現(xiàn)模型組大鼠出現(xiàn)踝關節(jié)紅腫，并伴有倦怠乏力、食少便溏。光鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠關節(jié)腔內出現(xiàn)血管翳，滑膜組織增生，關節(jié)的結構也遭到明顯的破壞，提示模型復制成功。

3 展望

RA動物模型的復制是RA實驗研究的重要環(huán)節(jié)，良好的RA模型需要滿足技術成熟、方法簡便、成本低廉和成功率高等要求。上述模型中，CIA與AA模型是當前最為常用的經(jīng)典模型，其歷史悠久，可復制程度高，能較好地模擬人類RA的病理狀態(tài)。

單純疾病動物模型不能模擬RA的中醫(yī)證候，而病證結合動物模型達到西醫(yī)學病因和病理變化與中醫(yī)學證候的有機結合。但西醫(yī)的“病”并不等同于中醫(yī)的“證”，中醫(yī)證候復雜程度較高，因此模型復制的可靠性與成功率并不穩(wěn)定。中醫(yī)在辨證論治時講究四診合參，而模型復制過程中難以對實驗動物進行準確地診斷，故明顯降低模型的可靠性。并且在模型復制過程中給予的刺激可能會增加變證，如給予風寒刺激時，可能也會帶來心膽氣虛的變證，應進一步研究規(guī)避變證的方法。當前所復制的病證結合動物模型多數(shù)僅僅實現(xiàn)了“病”與“證”的疊加，沒有深入研究中醫(yī)證候的具體特點和相關臨床表現(xiàn)，也沒有從中醫(yī)病因病機的角度出發(fā)進行研究，需要今后繼續(xù)探索。

綜上所述，由于實驗動物與人存在較大的差異，因而當前沒有一種模型復制方法能完全模擬人類的RA狀態(tài)。未來的模型復制研究中，應最大程度地貼近人類的疾病狀態(tài)，深入臨床實際，探究RA發(fā)病的相關機制和臨床癥狀，從病理和免疫等角度加強對模型的評估?？梢越柚F(xiàn)代的醫(yī)學影像技術，提高觀察的準確性。還應深入研究中醫(yī)證候的內涵，從一個證候所對應的病因病機入手，研究證候的病機和發(fā)病規(guī)律，同時契合現(xiàn)代醫(yī)學病因，做到病證結合，確保模型復制的科學性、規(guī)范性和統(tǒng)一性，探索出符合西醫(yī)病理和中醫(yī)辨證要求的RA模型。