肺癌干細(xì)胞在肺癌中的研究進(jìn)展

羅詳沖，劉晶晶，朱家宏，安樂，浦瀟，王周清#

曲靖市第二人民醫(yī)院1心胸外科，2藥劑科，云南 曲靖655000 0

肺癌是全球發(fā)病率和病死率均位居前列的惡性腫瘤[1]。盡管近年來肺癌的治療已經(jīng)取得了重大的進(jìn)展，但是肺癌患者的總生存期（overall survival，OS）并未明顯延長[2]，因此，尋找新的治療靶點(diǎn)和治療策略以提高肺癌患者的臨床療效成為了目前肺癌治療的當(dāng)務(wù)之急。腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell，CSC）是近年來肺癌防治研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，其是一類具有無限自我更新能力并可導(dǎo)致腫瘤形成的細(xì)胞亞群[3]。肺癌干細(xì)胞（lung cancer stem cell，LCSC）是存在于肺癌組織中的一類具有無限增殖、自我更新能力和多向分化潛能的特殊細(xì)胞亞群。研究表明，LCSC在肺癌的發(fā)生和發(fā)展過程中可能起到了重要的作用，LCSC能夠?yàn)榉伟┑呐R床治療提供新的治療靶點(diǎn)[4]。本文就LCSC的發(fā)展史、LCSC相關(guān)標(biāo)志物、LCSC的相關(guān)信號通路、針對LCSC的靶向治療在肺癌中的研究進(jìn)展作一綜述。

1 LCSC的發(fā)展史

LCSC是指一群特定的能夠?qū)е履[瘤發(fā)生的細(xì)胞，具有無限增殖、自我更新和多向分化的潛能，其具備與CSC類似的生物學(xué)特性[5]。CSC引發(fā)腫瘤的形成最早是在急性粒細(xì)胞白血?。╝cute myeloblastic leukemia，AML）中得以證實(shí)的[6]。目前，CSC的起源仍備受爭議，其可能通過祖細(xì)胞基因突變、成體干細(xì)胞（adult stem cell，ASC）基因突變及已分化的細(xì)胞經(jīng)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）而形成[7-9]。Kim等[10]采用熒光激活細(xì)胞分選儀（fluorescence-activated cell sorter，F(xiàn)ACS）從小鼠肺損傷模型的終末細(xì)支氣管和肺泡管交界區(qū)分離出表型為Sca-1+CD45-Pecam-CD34+的細(xì)胞，并將其命名為支氣管肺泡干細(xì)胞（bronchioalveolar stem cell，BASC）；在正常情況下，BASC處于靜息狀態(tài)，當(dāng)支氣管、肺泡管受到損傷時(shí)進(jìn)入增殖期，可分化為克拉拉細(xì)胞、Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞，表現(xiàn)出明顯的自我更新和多向分化潛能。當(dāng)BASC發(fā)生惡性突變時(shí)可轉(zhuǎn)化為LCSC。由此推測，LCSC可能起源于BASC，為LCSC的研究提供了重要證據(jù)。LCSC的提出為肺癌的發(fā)生和復(fù)發(fā)機(jī)制做出了合理解釋，對于研發(fā)更加有效的抗腫瘤藥物具有重大的指導(dǎo)意義。

2 LCSC的標(biāo)志物

2.1 SP細(xì)胞

側(cè)群細(xì)胞（side population cell，SP）又稱邊緣細(xì)胞，是采用Hoechst染料和流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）對造血干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞進(jìn)行分離時(shí)發(fā)現(xiàn)的一群特殊細(xì)胞亞群，可特異性地通過細(xì)胞膜上的腺苷三磷酸結(jié)合盒式（adenosine triphosphate-binding cassette，ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將 Hoechst 33342染料快速地泵出細(xì)胞外。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要定位于細(xì)胞膜，主要包括乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP，也稱ABCG2）、P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp，也稱ABCB1）、多藥耐藥相關(guān)蛋白1-5（multidrug-resistant associate protein 1-5，MRP1-5）[11]。Ho等[12]采用 FCM 和 Hoechst 33342染料分離和鑒定6種人肺癌細(xì)胞株的SP細(xì)胞（H460、H23、HTB-58、A549、H441、H2170），結(jié)果表明，與非SP細(xì)胞相比，SP細(xì)胞具有更強(qiáng)的致瘤性、轉(zhuǎn)移及化療藥物耐受能力，同時(shí)高表達(dá)ABCG2、人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT），低表達(dá)微小染色體維持蛋白7（minichromosome maintenance protein 7，MCM7）。hTERT的存在提示腫瘤細(xì)胞具有無限增殖的能力，從而認(rèn)為SP細(xì)胞具有CSC的特征。

2.2 CD133

CD133又稱人Prominin-1和AC133，是一種含5個(gè)跨膜區(qū)域的細(xì)胞表面糖蛋白，該蛋白的分子量約為97 kD，由865個(gè)氨基酸組成，包括N端胞外域、5個(gè)跨膜區(qū)和一個(gè)胞內(nèi)C端[13]。CD133被認(rèn)為是CSC的標(biāo)志物，其在直腸癌、腦膠質(zhì)瘤和肺癌等腫瘤的CSC中均有表達(dá)[14]。研究表明，肺癌中含CD133+類腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞群，這種細(xì)胞能夠自我更新，并具有高致瘤性[15]。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中CD133的表達(dá)情況與NSCLC的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和疾病預(yù)后有關(guān)，高表達(dá)CD133的NSCLC患者預(yù)后較差[16-17]。含CD133+細(xì)胞的NSCLC患者對順鉑會(huì)產(chǎn)生耐藥[18]。

2.3 ALDH

乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）是催化細(xì)胞內(nèi)的乙醛氧化為乙酸的細(xì)胞溶質(zhì)酶，能夠?qū)⒁朁S醇氧化為視黃酸，并參與正常干細(xì)胞的分化。研究表明，乙醛脫氫酶1（aldehydedehydrogenase1，ALDH1）可作為CSC的功能性標(biāo)志物[19]。Patel等[20]通過FCM發(fā)現(xiàn)ALDH1A1和ALDH3A1兩種亞型在肺鱗狀細(xì)胞癌和肺腺癌患者中呈高表達(dá)。另一項(xiàng)研究表明，高表達(dá)ALDH1A1的Ⅰ期NSCLC患者的生存率降低[21]。Jiang等[22]發(fā)現(xiàn)NSCLC中ALDH1的表達(dá)情況與肺癌細(xì)胞的增殖、分化、自我更新有關(guān)。在體外環(huán)境中，表達(dá)ALDH1+的肺癌細(xì)胞具有無限增殖、自我更新、多向分化、化療耐藥等干細(xì)胞特征。肺癌細(xì)胞表達(dá)的ALDH+對表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制藥（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）——吉非替尼（gefitinib）具有一定的耐藥性[23]。上述研究表明ALDH1可以作為LCSC的一個(gè)功能性標(biāo)志物。

2.4 CD44

CD44是細(xì)胞表面的一種跨膜糖蛋白，在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要的作用。研究表明，CD44在肺鱗狀細(xì)胞癌中的陽性表達(dá)率為89.5%[24]。Liu等[25]采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR）檢測發(fā)現(xiàn)Nanog基因在CD44+陽性LCSC中的表達(dá)水平高，說明Nanog基因在細(xì)胞惡性表型的形成過程中起著重要的作用[26]。另一項(xiàng)研究表明，CD44的高表達(dá)是肺腺癌復(fù)發(fā)的高危因素[27]。除此之外，Leung等[28]采用FCM檢測發(fā)現(xiàn)，CD44+的NSCLC細(xì)胞比CD44-的NSCLC細(xì)胞更具有成瘤能力，同時(shí)，CD44+的NSCLC細(xì)胞比CD44-的NSCLC細(xì)胞對順鉑的耐藥性更強(qiáng)。因此，CD44可能成為LCSC的分子標(biāo)志物。

2.5 其他標(biāo)志物

除上述標(biāo)志物之外，用于分離LCSC的細(xì)胞表面分子標(biāo)志物還有Oct4、Sox2、Nanog、階段特異性胚胎表面抗原4（stage specific embryonic antigen 4，SSEA4）、CD166、CD24、CD147等。Chen 等[29]通過對肺癌患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，CD133+細(xì)胞中Oct-4的表達(dá)水平高于CD133-細(xì)胞；當(dāng)Oct-4的表達(dá)受到抑制時(shí)，其成瘤能力下降。目前，對于LCSC標(biāo)志物的研究是一個(gè)熱點(diǎn)，單個(gè)標(biāo)志物對于肺癌診斷的特異度和靈敏度均較低，可通過聯(lián)合多種標(biāo)志物提高肺癌的早期診斷率；同時(shí)，對于LCSC標(biāo)志物的研究可為肺癌的靶向治療策略帶來廣闊前景。

3 LCSC相關(guān)信號通路

3.1 Wnt信號通路

Wnt信號通路參與細(xì)胞的增殖、分化、遷移和凋亡等多種細(xì)胞生長過程，并且與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。Wnt信號通路包括經(jīng)典途徑[Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）途徑]和非經(jīng)典途徑[Wnt/Ca2+和Wnt/應(yīng)激活化蛋白激酶（stress-activated proteinkinases，SAPK，也稱JNK）途徑]。其中，經(jīng)典的Wnt信號通路在腫瘤的增殖和分化過程中起著重要的作用。當(dāng)經(jīng)典的Wnt通路被激活時(shí)，Wnt蛋白與細(xì)胞表面的跨膜受體卷曲蛋白（Frizzled，F(xiàn)rz）、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6，LRP5/6）結(jié)合形成三聚體，激活細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蓬亂蛋白，降低由βcatenin與糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）、軸蛋白（axin）、結(jié)直腸腺瘤性息肉病基因（adenomatous polyposis coli，APC）組成的復(fù)合物的穩(wěn)定性，使磷酸化的β-catenin不能被降解，處于去磷酸狀態(tài)的β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)累積，進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與T細(xì)胞因子/淋巴樣增強(qiáng)因子（T-cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF）相互作用，激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[30]。Teng等[31]研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)A549細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)，可抑制A549細(xì)胞的增殖、克隆形成、遷移及耐藥性。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，非典型Wnt途徑中的配體Wnt5a可以促進(jìn)A549肺腺癌細(xì)胞和順鉑耐藥A549/DDP細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移，同時(shí)增加A549/DDP細(xì)胞中ALDH+細(xì)胞的比例[32]。上述研究表明，對Wnt信號通路的靶向抑制可能成為肺癌治療的新策略。

3.2 Notch信號通路

Notch信號通路是在進(jìn)化方面具有高度保守性的細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，共包含4種Notch受體（Notch 1～Notch 4）和 5個(gè)配體（Jagged1、Jagged2、Delta-like1、Delta-like3、Delta-like4），其在細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等多種生物功能中發(fā)揮著重要的作用，同時(shí)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。當(dāng)Notch配體（Delta、Jagged）與受體結(jié)合后，受體由腫瘤壞死因子α轉(zhuǎn)化酶（tumor necrosisi factor α converting enzyme，TACE）和γ-分泌酶（γ-secretase）催化發(fā)生一系列水解，形成活化的胞內(nèi)區(qū)（notch intracellular domain，NICD），并進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子（CBF1/RBP-Jk/Suppressor of Hairless/LAG-1，CSL）結(jié)合，進(jìn)一步激活發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子（hairy and enhancer of split，HES）、Myc、p21等下游靶基因的表達(dá)[33]。研究表明，Notch信號通路對NSCLC細(xì)胞的增殖和凋亡具有重要作用。抑制Notch1受體能夠促進(jìn)肺腺癌A549細(xì)胞的增殖，同時(shí)抑制其凋亡，但是，對肺鱗癌細(xì)胞的增殖與凋亡無明顯影響[34]。Hassan等[35]研究發(fā)現(xiàn)高活性的Notch與肺腺癌的致瘤性和腫瘤耐藥性等有關(guān)。此外，Notch信號通路對小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）的生物學(xué)行為也具有重要影響。Meder等[36]通過體外實(shí)驗(yàn)激活NOTCH-ASCL1-RB-p53信號通路可滅活Notch基因的突變進(jìn)而維持SCLC表型，提示Notch通路與LCSC之間具有一定的相關(guān)性。

3.3 Hedgehog信號通路

Hedgehog信號通路在胚胎發(fā)育及維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)等多種生理過程中起著重要作用。該通路主要由 3種配體[Sonic Hedgehog（Shh）、Indian Hedgehog（Ihh）和Desert Hedgehog（Dhh）]、2種跨膜受體蛋白[Patched（PTCH）和 Smoothened（SMO）]及3種轉(zhuǎn)錄因子 GLI（GLI1、GLI2、GLI3）]構(gòu)成。在Hedgehog信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中通過正負(fù)反饋調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)情況，各環(huán)節(jié)均受到嚴(yán)密的基因調(diào)控，當(dāng)信號通路被異常激活時(shí)則多種腫瘤形成[37]。研究表明，Hedgehog信號通路在肺癌、胰腺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起到重要作用[38-39]。在肺鱗癌組織中，Hedgehog信號通路的激活與PTCH1SMO表達(dá)水平的升高有關(guān)，哺乳動(dòng)物叉頭框蛋白M1（forkhead box protein M1，F(xiàn)OXM1）過表達(dá)也與PTCH1、SMO和GLI1的表達(dá)密切相關(guān)[38]，而FOXM1在細(xì)胞增殖的調(diào)控中起關(guān)鍵作用。Lemjabbar-Alaoui等[40]研究發(fā)現(xiàn)暴露于香煙煙霧中的支氣管上皮細(xì)胞具有獨(dú)立的生長性，能夠激活Hedgehog信號通路并在裸鼠中形成腫瘤，這些結(jié)果表明肺癌可能通過Hedgehog通路的激活促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞的自我更新，因此，抑制Hedgehog信號通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可成為肺癌治療的新途徑。

3.4 其他信號通路

除上述幾種信號通路外，SCF-c-kit（CD117）信號通路及STAT3通路等在LCSC的相關(guān)調(diào)控中也均起到一定的作用[41-42]。信號通路在LCSC增殖、自我更新、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥等過程中均發(fā)揮著重要的作用，但仍需深入地研究并闡述各通路在LCSC中的作用機(jī)制，通過阻斷上述LCSC中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能為肺癌的治療提供新的靶點(diǎn)，也將成為以后的研究趨勢及熱點(diǎn)。

4 LCSC在SCLC中的靶向治療研究進(jìn)展

研究表明，RRX-001抑制劑可通過靶向CSC逆轉(zhuǎn)SCLC的化療耐藥。該研究是一項(xiàng)多中心開放的RRX-001臨床Ⅱ期試驗(yàn)（NCT02489903），納入26例鉑類耐藥/難治性SCLC或接受二線以上治療的SCLC患者，結(jié)果顯示，接受RRX-001治療患者的1年生存率為45.6%，中位無進(jìn)展生存期（progression free survival，PFS）為7.5個(gè)月，其中12例SCLC患者接受RRX-001治療后開始進(jìn)行依托泊苷/順鉑化療，疾病控制率（disease control rate，DCR）為75%，客觀緩解率（objective response rate，ORR）為33%。上述研究提示，可通過靶向CSC逆轉(zhuǎn)SCLC的化療耐藥性，從而提高SCLC患者的治療效果[43]。

5 LCSC在NSCLC中的靶向治療研究進(jìn)展

LCSC的相關(guān)研究對NSCLC的治療具有重要的作用。目前存在5種治療策略：①針對LCSC代謝弱點(diǎn)的靶向治療。Fernandez等[44]發(fā)現(xiàn)在NSCLC細(xì)胞中，LCSC的代謝過程存在1個(gè)弱點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)LCSC通過線粒體的檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Na+-coupled citrate transporter，NaCT）SLC25A1的活性，依賴氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）所產(chǎn)生的能量來維持細(xì)胞的存活。這表明，SLC25A1在維持CSC檸檬酸的儲(chǔ)備和氧化還原平衡中起著關(guān)鍵的作用，抑制SLC25A1的活性能夠抑制LCSC的自我更新。此外，通過進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)，在不同的腫瘤中，通過介導(dǎo)SLC25A1的活性可誘導(dǎo)LCSC產(chǎn)生干性表型，從而獲得對順鉑或EGFR-TKI治療的耐藥性。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)一種SLC25A1特異性抑制劑與順鉑或EGFR-TKI聯(lián)合使用能夠產(chǎn)生更好的抗腫瘤反應(yīng)。②抑制LCSC EMT。有研究表明，EMT在維持CSC干性方面發(fā)揮著重要的作用，且干性腫瘤細(xì)胞高表達(dá)EMT相關(guān)標(biāo)志物[45-47]。通過誘導(dǎo)EMT過程的發(fā)生可使NSCLC細(xì)胞增強(qiáng)干細(xì)胞特性，進(jìn)而促進(jìn)NSCLC轉(zhuǎn)移[48]。研究證明，TGFb-1能夠誘導(dǎo)原始NSCLC細(xì)胞發(fā)生EMT，并使NSCLC細(xì)胞獲得間葉細(xì)胞表型和干細(xì)胞表面標(biāo)志物（如Oct4、Nanog、Sox2和CD133）的表達(dá)，提示LCSC與EMT有著密切的關(guān)系[49]。Li等[50]設(shè)計(jì)了一種新的雙特異性抗體BsAb-5，該抗體可以特異性靶向CD166+LCSC中的細(xì)胞間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化（cellular-mesenchymal to epithelial transition，c-MET）和細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4），使c-MET-Notch通路受到抑制，從而使小鼠移植瘤的體積縮小。③針對LCSC標(biāo)志物的靶向治療。有研究發(fā)現(xiàn)，使用三氟拉嗪處理LCSC會(huì)使NSCLC腫瘤球的形成受到抑制，同時(shí)下調(diào)了LCSC標(biāo)志物（CD44/CD133）的表達(dá)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，三氟拉嗪與吉非替尼或順鉑聯(lián)合使用可有效抑制LCSC的耐藥，提示可以通過LCSC標(biāo)志物靶向殺傷LCSC[51]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，麥角黃酮酸D（secalonic acid D，SAD）可以通過激活鈣蛋白酶1（calpain1）縮短ABCG2蛋白的半衰期，從而減少NSCLC細(xì)胞中SP細(xì)胞的百分比，使ABCG2的表達(dá)下調(diào)，提示SAD可以作為靶向殺傷CSC的藥物[52]。此外，Huang等[53]利用 CD133適配體（M-Gef-CD133）構(gòu)建負(fù)載吉非替尼的DSPE-PEG2000納米微囊，靶向肺CSC，使CD133+的LCSC比例減少，抑制了肺CSC腫瘤球的形成。④阻斷LCSC相關(guān)信號通路。You等[54]研究發(fā)現(xiàn)，使用Wnt-2蛋白N末端的單克隆抗體（mAb）可使高表達(dá)Wnt-2的NSCLC細(xì)胞株（A549細(xì)胞系）凋亡。Ma等[55]使用特異的siRNA阻斷Notch3通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NSCLC細(xì)胞中干細(xì)胞樣性質(zhì)的腫瘤球的形成比例減少，提示阻斷Notch通路可殺滅LCSC。此外，Li等[56]在肺腺癌細(xì)胞中通過使用Hedgehog信號通路抑制劑——維莫德吉（vismodegib/GDC-0449）阻斷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)一步干擾腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，從而抑制肺腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。⑤LCSC可作為抗腫瘤疫苗。Kooreman等[57]發(fā)現(xiàn)，將處理后的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）與免疫增強(qiáng)分子CpG相結(jié)合制備成疫苗，接種至實(shí)驗(yàn)組小鼠身上，發(fā)現(xiàn)接受干細(xì)胞疫苗的小鼠腫瘤縮小或消失，而對照組注射干細(xì)胞疫苗幾周后腫瘤體積變大，提示干細(xì)胞疫苗發(fā)揮了抗腫瘤的作用，可能預(yù)防腫瘤的發(fā)生。

6 小結(jié)與展望

目前，LCSC是肺癌研究中的趨勢和熱點(diǎn)，盡管臨床對LCSC進(jìn)行了廣泛的研究，但仍存在許多問題亟待解決：①LCSC標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)對于肺癌的早期診斷、鑒別及治療均具有重要的作用，但是目前缺乏能夠鑒別和鑒定LCSC的特異性分子標(biāo)志物，仍需進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)；②LCSC的相關(guān)調(diào)控機(jī)制尚未闡述清楚，深入研究LCSC相關(guān)信號通路以及關(guān)鍵調(diào)控基因的作用，能夠更好地了解LCSC在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用；③針對已知的LCSC表面標(biāo)志物或LCSC相關(guān)信號通路，分子靶向治療的效果還有限，仍需通過深入了解從而提高靶向治療效果。因此，在肺癌的治療方面，針對LCSC的靶向治療策略具有廣闊的前景，應(yīng)進(jìn)行深入研究和探索。