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    蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究凡納濱對(duì)蝦冰藏期間肌肉蛋白的變化

    2019-03-14 13:29:22鄭鴦鴦吉宏武蘇偉明劉書成
    關(guān)鍵詞:肌球蛋白凡納濱新鮮度

    鄭鴦鴦 ,吉 薇 ,吉宏武 *,2,3,4,蘇偉明 ,2,3,劉書成 ,2,3,4

    (1.廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院,廣東 湛江 524088;2.廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 湛江524088;3.廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心,廣東 湛江524088;4.水產(chǎn)品深加工廣東省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 湛江 524088)

    凡納濱對(duì)蝦 (Litopenaeus vannamei)屬于對(duì)蝦科、濱對(duì)蝦屬[1],是中國主要的對(duì)蝦品種,也是我國出口對(duì)蝦的主要品種[2],深受消費(fèi)者的歡迎。但是凡納濱對(duì)蝦水分含量高,內(nèi)源酶種類豐富,運(yùn)輸銷售過程中極易出現(xiàn)肌肉自溶、組織軟化等問題,致使品質(zhì)下降、貯藏時(shí)間縮短而影響其商業(yè)價(jià)值。文獻(xiàn)報(bào)道指出,內(nèi)源酶和微生物作用引起的肌原纖維蛋白等細(xì)胞骨架成分的蛋白質(zhì)降解是水產(chǎn)品肌肉軟化、腐敗變質(zhì)的主要原因[3-6]。

    澳大利亞學(xué)者Wilkins和Williams早在1994年最先提出了“蛋白質(zhì)組”這個(gè)概念[7],定義為一個(gè)基因組表達(dá)的所有蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組研究的是不同時(shí)間和空間上發(fā)揮功能的特定蛋白質(zhì)群體,目的是要從蛋白質(zhì)水平上探索蛋白質(zhì)的作用方式、調(diào)控機(jī)制、功能機(jī)理以及蛋白質(zhì)群體內(nèi)的相互作用[8]。蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫是生物信息學(xué)的重要信息來源,通過這些已建數(shù)據(jù)庫展開蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析能夠提供各種生理機(jī)制過程中參與決定肌肉品質(zhì)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能等方面的信息[9]。近年來,蛋白組學(xué)已被廣泛應(yīng)用到水產(chǎn)品的研究中。早期蛋白組學(xué)對(duì)水產(chǎn)品的研究主要集中在分類學(xué)上,隨后蛋白組學(xué)又逐步成為了解免疫應(yīng)答機(jī)制的的一種手段,如Jiang H等[10]利用比較蛋白組學(xué)從中國對(duì)蝦肝胰臟中鑒定出33種能夠承受低氧環(huán)境的蛋白、Silvestre F等[11]指出抗生素對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦血淋巴蛋白表達(dá)的影響會(huì)被外部養(yǎng)殖條件所誤導(dǎo)。對(duì)于大西洋三文魚、鱒魚、鯰魚、鱈魚等這些具有重要商業(yè)價(jià)值的魚種,目前研究內(nèi)容主要涉及魚類病原體或致敏蛋白、篩選表征新鮮度和品質(zhì)的標(biāo)記物、營養(yǎng)價(jià)值[12]。Lanfen Fan等[13]利用蛋白組學(xué)技術(shù)研究了對(duì)照組和處理組凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞中的冷應(yīng)激蛋白,結(jié)果表明血藍(lán)蛋白在凡納濱對(duì)蝦對(duì)環(huán)境的調(diào)節(jié)機(jī)制中起重要作用。張帥[14]優(yōu)化了凡納對(duì)蝦肌肉雙向電泳體系,采用質(zhì)譜鑒定出了精氨酸激酶、肌動(dòng)蛋白T2和磷酸丙酮酸水合酶這3種差異蛋白能用作新鮮度指示蛋白。李婷婷[15]篩選出8個(gè)能代表大黃魚品質(zhì)變化的差異蛋白質(zhì)。李學(xué)鵬[16]采用蛋白組學(xué)技術(shù)研究中國對(duì)蝦在冷藏過程中的肌肉蛋白質(zhì)變化,指出腺苷鈷啉胺酸合成酶可作為新鮮度指示蛋白。此外,Verrez.Bagnis等[17]利用單向和雙向電泳探索黑鱸在保藏期間肌肉蛋白質(zhì)變化情況,最后提出了潛在魚肉新鮮度指示蛋白,Capillas和Moral指出鵝肌肽可以作為冰藏鱈魚的新鮮度指示物。

    蛋白質(zhì)組學(xué)研究可以應(yīng)用到水產(chǎn)品新鮮度的評(píng)價(jià)上,雖然目前有關(guān)于凡納濱對(duì)蝦蛋白組學(xué)的研究,但是對(duì)0℃冰藏這一更接近實(shí)際流通過程對(duì)蝦保藏溫度的研究鮮有報(bào)道。為此,作者以凡納濱對(duì)蝦為原料,以0℃作為貯藏溫度,把蛋白組學(xué)技術(shù)應(yīng)用到凡納濱對(duì)蝦冰藏期間肌肉蛋白的變化,旨在尋找能代表新鮮度的指示蛋白,以期探索出凡納濱對(duì)蝦肌肉蛋白質(zhì)的降解情況與其品質(zhì)性狀之間的相關(guān)性信息。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    干膠條 (24 cm,pH 4-7):BIORAD 公司產(chǎn)品;蛋白酶抑制劑PMSF、二硫蘇糖醇(DTT)、二硫蘇糖醇 (DTT)、甘氨酸、甘油、N,N-二甲基丙烯酰胺(Acylamide):Amresco公司產(chǎn)品;胎牛血清標(biāo)準(zhǔn)品BSA、N,N’- 亞 甲 基 雙 丙 烯 酰 胺 (N,N’ -methylenebisacrylamide)、 碳酸氫銨,Sigma公司產(chǎn)品;IPG Buffer(pH4-7)、水化盤、覆蓋油:GE 公司產(chǎn)品;過硫酸銨、四甲基乙二胺(TEMED)、碘乙酰胺(IAA)、硫脲(Thiourea)、脲(Urea),購于 Amersham;胰酶、三氟乙酸、低熔點(diǎn)瓊脂糖:Promega公司產(chǎn)品;普通瓊脂糖公司產(chǎn)品Gene tech companylimited公司產(chǎn)品;甲醇、乙腈:Fisher公司產(chǎn)品;HCCA:ABI公司產(chǎn)品;丙酮:Baker公司產(chǎn)品。

    1.2 儀器與設(shè)備

    MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀:德國布魯克(Bruker Dalton)Autoflex speedTM公司產(chǎn)品;等電聚焦儀:GE ETTAN IPGPHOR3公司產(chǎn)品;垂直電泳槽:GE ETTAN DALTsix公司產(chǎn)品;超聲儀:寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

    1.3 樣品預(yù)處理

    用蒸餾水將鮮活的凡納濱對(duì)蝦清洗后立即冰猝致死。置于0℃冰箱中冰藏,取樣時(shí)間依次為0、2、4、6、8、10 d。

    1.4 雙 向 電 泳 (Two-dimensionalgel electrophoresis,2-DE)

    用裂解液(20 mmol/L Tris、2 mol/L 硫脲、7 mol/L尿素、2 g/dL CHAPs)溶解、提取凡納濱對(duì)蝦肌肉第二腹節(jié)組織中的蛋白,再用分光光度計(jì)進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。干膠條泡脹后進(jìn)行一向等電聚焦,程序參數(shù)設(shè)置如表1所示。等電聚焦結(jié)束后,采用12.5 g/dL的二向膠進(jìn)行丙烯酰胺凝膠電泳,參數(shù)設(shè)置如表2所示。

    表1 等電聚焦程序參數(shù)設(shè)置Table 1 Setting of IEF parameters

    表2 二向SDS-PAGE電泳參數(shù)設(shè)置Table 2 Setting of SDS-PAGE parameters

    1.5 染色

    本實(shí)驗(yàn)所用分析膠采用銀染法,主要包括固定、敏化、漂洗、銀染、漂洗、顯色、終止和漂洗。銀染的分析膠上樣量一般為120 μg。作者所用質(zhì)譜膠采用考馬斯亮藍(lán)染色法,以質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.12%G-250、質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%(NH4)2SO4和體積分?jǐn)?shù)20% 甲醇為染色液。主要包括固定、漂洗、染色和終止??既镜馁|(zhì)譜膠上樣量一般為1 200 μg。

    1.6 圖像掃描和分析

    染色完的凝膠當(dāng)天掃描,采用Image Master 2D platinum 5.0(GE)專業(yè)圖像分析軟件讀取分析二維圖像數(shù)據(jù)。兩組2-DE圖譜中同一蛋白點(diǎn)的灰度值之比>1.5,且 t-test檢驗(yàn)p<0.05,才可判斷為差異蛋白點(diǎn)。當(dāng)一組2-DE圖譜中蛋白點(diǎn)灰度值高于另一組圖譜中同一蛋白點(diǎn)灰度值1.5倍時(shí)記為上調(diào),灰度值低于1.5倍時(shí)則記為下調(diào)。

    1.7 質(zhì)譜檢測(cè)

    利用德國布魯克 (Bruker Dalton)Autoflex speedTMMALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。參數(shù)設(shè)置:UV波長為355 nm,重復(fù)速率為200 Hz,加速電壓為20 000 V,最優(yōu)質(zhì)量分辨率為1 500。掃描質(zhì)量范圍為700~3 200,收集信號(hào)。

    數(shù)據(jù)庫檢索:利用軟件 flexAnalysis(Bruker Dalton)過濾基線峰、識(shí)別信號(hào)峰。采用BioTools(Bruker Dalton)軟件進(jìn)行NCBI數(shù)據(jù)庫搜索,尋找相關(guān)的匹配蛋白質(zhì)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 凡納濱對(duì)蝦不同冰藏時(shí)間點(diǎn)肌肉蛋白質(zhì)的2-DE圖譜

    采用24 cm pH4-7 IPG膠條,分析膠采用銀染法,蛋白上樣量為120 μg,進(jìn)行等電聚焦。采用12.5 g/dL的二向膠對(duì)提取后的不同冰藏(0℃)時(shí)間的凡納濱對(duì)蝦肌肉蛋白進(jìn)行2-DE分離,銀染后獲得清晰度和分辨率較高的蛋白質(zhì)分離圖譜,如圖1所示。

    對(duì)不同冰藏時(shí)間的肌肉蛋白質(zhì)2-DE圖譜依次進(jìn)行兩兩比對(duì)。2 d與0 d對(duì)比的2-DE圖譜中差異蛋白共有200個(gè),4 d與0 d對(duì)比的差異蛋白共有190個(gè),6 d與0 d對(duì)比的差異蛋白共有171個(gè),8 d與0 d對(duì)比的差異蛋白共有167個(gè)。再對(duì)上述所有差異斑點(diǎn)進(jìn)行多重比對(duì),篩選得到2-DE圖譜上相同位置的重復(fù)點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的差異斑點(diǎn)17個(gè),依次挖取相應(yīng)的斑點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF-TOF鑒定。

    圖1 不同冰藏時(shí)間下凡納濱對(duì)蝦肌肉蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜Fig.1 2-DE gels of muscle protein of Litopeneaus vannamei during iced storage

    2.2 凡納濱對(duì)蝦冰藏期間差異蛋白的鑒定與分析

    在17個(gè)篩選到差異斑點(diǎn)中,12個(gè)蛋白斑點(diǎn)得到了成功的鑒定。在成功鑒定的蛋白斑點(diǎn)中,肌原纖維蛋白占的最多,占了1/2以上,包括肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白和肌鈣蛋白。肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白屬于結(jié)構(gòu)蛋白,分別構(gòu)成了肌原纖維蛋白的粗絲和細(xì)絲;肌鈣蛋白是肌肉的主要調(diào)節(jié)蛋白質(zhì),直接參與鈣所控制的肌肉收縮,占肌原纖維蛋白的5%。酶占了1/4,另外還成功鑒定出了唐氏綜合癥細(xì)胞粘附分子和血淋巴凝固蛋白,結(jié)果如表3所示。

    從表3可以看出,一些不同的蛋白點(diǎn),如斑點(diǎn)I19和J02、斑點(diǎn)I62和J29、I72和J16被鑒定為相同的蛋白,這可能是由于蛋白異構(gòu)體的存在和翻譯后修飾所致[18]。

    表3 差異蛋白點(diǎn)NCBI數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果Table 3 NCBI search results of differentially expressed protein spots

    為進(jìn)一步篩選出隨冰藏時(shí)間具有規(guī)律性變化的差異蛋白,對(duì)上述成功鑒定出的差異蛋白進(jìn)行灰度值和灰度值差異倍數(shù)的分析。結(jié)果顯示,初步篩選出3個(gè)隨冰藏時(shí)間具有規(guī)律性變化的差異蛋白,分別為差異蛋白 I19、I14、I75。

    如圖2所示,差異蛋白點(diǎn)I19和I14的灰度值均隨冰藏時(shí)間呈持續(xù)上升趨勢(shì),且這2個(gè)差異蛋白點(diǎn)最先的灰度值很小基本為零,說明差異蛋白I19和I14是凡納濱對(duì)蝦肌肉中固有的蛋白或酶的降解產(chǎn)物,這與質(zhì)譜鑒定結(jié)果一致,這2個(gè)差異蛋白依次為肌球蛋白重鏈1和腺苷酸脫氨酶。隨冰藏時(shí)間越久,肌球蛋白重鏈1和腺苷酸脫氨酶產(chǎn)生的降解產(chǎn)物越多,因此這些差異蛋白點(diǎn)灰度值也隨之升高。而差異蛋白點(diǎn)I75為精氨酸激酶,在冰藏前期灰度值也一直上升,但到冰藏末期8 d時(shí)精氨酸激酶的降解產(chǎn)物本身也發(fā)生了降解,因此最后I75灰度值開始下降。無脊椎動(dòng)物的精氨酸激酶與脊椎動(dòng)物中的肌酸激酶類似,它屬于磷酸激酶,參與細(xì)胞代謝。它將ATP上的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移給精氨酸,生成磷酸精氨酸和ADP,這在無脊椎動(dòng)物的能量代謝中有著重要作用。

    凡納濱對(duì)蝦蝦肉水分含量較高,同時(shí)富含蛋白質(zhì),肌肉組織較松軟,主要由肌原纖維蛋白組成[19],其中肌球蛋白是肌原纖維蛋白的重要組成成分,構(gòu)成了肌原纖維蛋白的粗絲。肌球蛋白由2條重鏈和4 條輕鏈組成,肌球蛋白重鏈 1(MHC1,I19)是肌球蛋白的其中一條重鏈。因此,凡納濱對(duì)蝦MHC1的降解會(huì)造成肌肉組織結(jié)構(gòu)的崩塌和肌肉的軟化,致使對(duì)蝦品質(zhì)下降。對(duì)蝦死后肌肉發(fā)生的第一個(gè)變化是內(nèi)源酶活性引起的肌肉蛋白和結(jié)締組織的降解[20-22],另外有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)指出蛋白酶水解活動(dòng)能降解海鯡魚和大西洋鱈魚提取物中的肌球蛋白重鏈[23-24]。

    凡納濱對(duì)蝦在冰藏期間MHC1在冰藏期間被逐漸降解,降解產(chǎn)物的灰度值呈上升趨勢(shì)。為尋找差異蛋白在冰藏期間的變化規(guī)律,對(duì)灰度值進(jìn)行線性回歸,結(jié)果表明差異蛋白點(diǎn)I19即MHC1的灰度值變化與冰藏時(shí)間呈良好的線性正相關(guān),決定系數(shù)R2為0.920。差異蛋白I14腺苷酸脫氨酶是嘌呤腺苷代謝中重要的酶類,它與冰藏時(shí)間用二次多項(xiàng)式回歸擬合效果較好,決定系數(shù)R2達(dá)到0.986,而差異蛋白點(diǎn)I75精氨酸激酶相關(guān)性較差。不同的蝦類品種在不同的貯藏條件下,蝦肉的蛋白質(zhì)將會(huì)發(fā)生不同的變化。李學(xué)鵬[16]在研究中國對(duì)蝦4℃和-2℃冷藏過程中的肌肉蛋白質(zhì)變化時(shí),鑒定出的差異蛋白腺苷鈷啉胺酸合成酶,它的灰度變化與冷藏時(shí)間有良好的線性關(guān)系,可以作為新鮮度指示蛋白。

    圖2 凡納濱對(duì)蝦冰藏期間差異蛋白的局部放大2-DE圖譜Fig.2 Local amplification of differentially expressed protein spots in the 2-DE maps of Litopeneaus vannamei during different storage times

    3 結(jié) 語

    作者通過蛋白組學(xué)技術(shù)研究了冰藏期間凡納濱對(duì)蝦肌肉蛋白的變化規(guī)律,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,肌球蛋白重鏈1和腺苷酸脫氨酶在冰藏期間生成的降解產(chǎn)物為差異蛋白I19和I14,兩者的灰度值均隨冰藏時(shí)間呈上升趨勢(shì)。其中,差異蛋白肌球蛋白重鏈1的灰度值變化與冰藏時(shí)間呈良好的線性正相關(guān),腺苷酸脫氨酶的灰度值與時(shí)間用二次多項(xiàng)式回歸擬合效果較好。因此,肌球蛋白重鏈1和腺苷酸脫氨酶均對(duì)凡納濱對(duì)蝦新鮮度具有指示作用,有望成為新鮮度的指示蛋白。

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