泡盛曲霉β-1，3-1，4-葡聚糖酶的純化、性質(zhì)及其用于制備β-葡寡糖

陳子賢，劉學(xué)強， 張 彬， 閆巧娟，江正強

（1.河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，洛陽 471023；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院，北京 100083；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

β-1，3-1，4-葡聚糖主要存在于谷物胚乳和麩皮的細胞壁中，是由葡萄糖通過β-1，3和β-1，4混合糖苷鍵連接而成[1]。β-1，3-1，4-葡聚糖可用于生產(chǎn)β-葡寡糖。β-葡寡糖具有較好的生理活性，如燕麥β-葡寡糖對鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhammosus）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）和雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum）等益生菌有較好增殖效果[2]；地衣多糖葡寡糖對大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）和鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）等有害菌具有較高的抑制活性[3]；還有研究報道β-葡寡糖具有改善脂代謝和延緩衰老的功能活性[4]。目前，生物酶解β-1，3-1，4-葡聚糖是制備β-葡寡糖的主要方法。

β-1，3-1，4-葡聚糖酶（EC 3.2.1.73）又稱地衣多糖酶，能專一性水解β-1，3-1，4-葡聚糖中臨近β-1，3-糖苷鍵的 β-1，4-糖苷鍵生成 β-葡寡糖。β-1，3-1，4-葡聚糖酶在啤酒和飼料工業(yè)中具有重要的應(yīng)用價值[5]。該酶可降解大麥中β-葡聚糖，從而降低啤酒醪黏度，提高過濾速度，提升啤酒生產(chǎn)效率和品質(zhì)[6]。該酶添加于飼料中可有效降低動物消化道食糜的黏度，提高飼料利用率，促進動物生長[7]。

β-1，3-1，4-葡聚糖酶來源廣泛，微生物 β-1，3-1，4-葡聚糖酶是報道最多的，其中細菌來源多以芽孢桿菌屬和類芽孢桿菌屬為主，如枯草芽孢桿菌 （Bacillus subtilis）[8]、 地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）[9]、巴倫葛茲類芽孢桿菌（Paenibacillus barengoltzii）[10]等。真菌來源相對較少，如嗜熱擬青霉（Paecilomycesthermophila）[11]、 米 黑 根 毛 霉（Rhizomucor miehei）[12]、 樟 絨 枝 霉 （Malbranchea cinnamomea）[13]、黑曲霉（Aspergillus niger）[14]、黃曲霉（Aspergillus flavus）[15]等報道產(chǎn) β-1，3-1，4-葡聚糖酶。目前已有一些真菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶純化和性質(zhì)的報道，如：丁葉梅等[16]從碎囊毛霉（Mucorpetrinsularis）發(fā)酵液中分離純化了一個 β-1，3-1，4-葡聚糖酶，該酶相對分子質(zhì)量為17.2×103，其最適pH和溫度分別為5.5和55℃。Elgharbi等[17]從黑曲霉發(fā)酵液中分離純化了一個 β-1，3-1，4-葡聚糖酶，該酶相對分子質(zhì)量為3.2×104，其最適pH和溫度分別為5.0和60℃。但目前尚未有泡盛曲霉β-1，3-1，4-葡聚糖酶純化和性質(zhì)的報道。

泡盛曲霉CAU33是作者所在研究室篩選的一株高產(chǎn)β-1，3-1，4-葡聚糖酶的真菌。前期研究優(yōu)化了泡盛曲霉液體發(fā)酵和固體發(fā)酵產(chǎn)β-1，3-1，4-葡聚糖酶的條件，最終發(fā)酵酶活力分別可達8 447 U/mL和40 833 U/g[18-19]，但并未研究分離純化和酶學(xué)性質(zhì)。根據(jù)泡盛曲霉的葡聚糖酶酶譜分析表明，該菌在液體發(fā)酵時能夠分泌一種β-1，3-1，4-葡聚糖酶 （29 kDa），而固體發(fā)酵時可同時分泌3種β-1，3-1，4-葡聚糖酶，其中最主要的是相對分子質(zhì)量2.9×104的 β-1，3-1，4-葡聚糖酶。 因此作者主要研究該酶（AaBglu29）的純化和酶學(xué)性質(zhì)。另外，燕麥麩皮作為一種農(nóng)業(yè)廢棄物，其β-1，3-1，4-葡聚糖質(zhì)量分數(shù)可達5.5%～9.0%[10]，可做為一種優(yōu)良的葡寡糖制備原料，故進一步考察了AaBglu29水解燕麥麩皮制備葡寡糖。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

泡盛曲霉CAU33：作者所在實驗室篩選并保存；燕麥葡聚糖：購于武漢百特純產(chǎn)品；大麥葡聚糖、地衣多糖、櫸木木聚糖、CMC、可得然膠、昆布多糖、殼聚糖、槐豆膠和對硝基苯酚化合物（pNP-βxylopyranoside，pNP-β -galactopyranoside，pNP-β -glucopyranoside和 pNP-β-cellobioside）：購于 Sigma公司；纖維二糖、纖維三糖和纖維四糖購于上海源葉生物公司；低相對分子質(zhì)量標準蛋白購于日本Takara公司；陰離子親和層析QSFF和DEAE-52柱料：購于美國GE Healthcare公司；薄層層析Gel Plate：購于德國Merck產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

LRH-恒溫恒濕培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱：太倉實驗設(shè)備廠產(chǎn)品；TU-1900PC紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器設(shè)備有限責(zé)任公司產(chǎn)品；Power Pac BasicTM型電泳儀 BIO-RAD、GL-20B高速冷凍離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；PB21型pH計：德國賽多利斯公司產(chǎn)品；?KTA蛋白純化系統(tǒng) 美國GE Healthcare公司產(chǎn)品；立式圓形壓力滅菌鍋：上海醫(yī)用核子儀器廠產(chǎn)品；JJT-900型潔凈工作臺：北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠產(chǎn)品；DK-S24電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品；恒溫水浴搖床：金壇市榮華儀器公司產(chǎn)品；Agilent 1260 InfinityⅡ型高效液相色譜儀、G7162A型示差折光檢測器：美國Agilent公司產(chǎn)品；Shodex Sugar KS-802色譜柱：日本Shodex公司產(chǎn)品。

1.2 泡盛曲霉β-1，3-1，4-葡聚糖酶的純化

將泡盛曲霉液體發(fā)酵粗酶液[18]置于冰水浴中，緩慢攪拌，同時緩慢加入硫酸銨干粉，至粗酶液硫酸銨飽和度達到質(zhì)量分數(shù)60%，繼續(xù)攪拌30 min后，10 000g離心10 min收集上清液。向上清液中繼續(xù)加入硫酸銨，至硫酸銨飽和度至質(zhì)量分數(shù)80%，10 000g離心10 min收集沉淀。將沉淀用20 mmol/L pH 7.0磷酸緩沖液溶解，在相同緩沖體系中4℃透析4～5 h。將透析好的酶液上樣于QSFF強陰離子交換柱 （20 mmol/L pH 7.0磷酸緩沖液平衡），流量為1.0 mL/min，用0～500 mmol/L的NaCl溶液洗脫，收集具有β-1，3-1，4-葡聚糖酶酶活性組分。收集部分于20 mM pH 7.0 Tris-HCl緩沖液透析過夜，透析好的酶液上樣于DE52弱陰離子交換柱（20 mmol/L pH 7.0 Tris-HCl緩沖液平衡）， 用 0～500 mmol/L的NaCl溶液線性洗脫，流量為1.0 mL/min，收集有活性的組分，最后通過SDS-PAGE檢測純化蛋白質(zhì)的純度。

1.3 β-1，3-1，4-葡聚糖酶活力及蛋白質(zhì)濃度的測定

β-1，3-1，4-葡聚糖酶酶活力測定參照Yang等[11]的方法：添加50 μL質(zhì)量分數(shù)1%的大麥β-葡聚糖于小試管中，55℃預(yù)熱3 min，然后加入150 μL用50 mmol/L乙酸-乙酸鈉 （Acetate）緩沖液（pH 5.0）適當(dāng)稀釋的酶液，55℃反應(yīng)10 min后加入200 μLDNS試劑，煮沸15 min后加入200 μL質(zhì)量分數(shù)40%酒石酸鉀鈉溶液，冷卻后于540 nm波長下測定吸光值，以葡萄糖作為標準。β-1，3-1，4-葡聚糖酶酶活力單位（U）的定義為：在上述條件下每分鐘水解大麥β-葡聚糖生成1 μmol葡萄糖所需要的酶量。

蛋白質(zhì)濃度的測定按照Lowry法進行，以牛血清蛋白（BSA）作為標準蛋白[20]。

1.4 SDS-PAGE、β-1，3-1，4-葡聚糖酶酶譜和相對分子質(zhì)量測定

SDS-PAGE電泳按照Laemmli[21]的方法進行。分離膠質(zhì)量濃度為12.5 g/dL，濃縮膠質(zhì)量濃度為4.5 g/dL，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍R-250染色。β-1，3-1，4-葡聚糖酶酶譜參照 Yang等[13]的方法。

β-1，3-1，4-葡聚糖酶變性和活性狀態(tài)下的相對分子質(zhì)量分別采用SDS-PAGE和Sephacryl S-100 HR凝膠過濾層析法測定。SDS-PAGE測定方法：以標準蛋白相對分子質(zhì)量的對數(shù)值為縱坐標，遷移率為橫坐標，根據(jù)目標蛋白的遷移率計算出目標蛋白的相對分子質(zhì)量。Sephacryl S-100 HR凝膠層析測定：葡聚糖酶活性狀態(tài)下的相對分子質(zhì)量采用S-100凝膠過濾法測定。凝膠柱預(yù)先用乙酸-乙酸鈉緩沖液（20 mmol/L，pH 5.0，0.15 mol/L NaCl）平衡，分別將2 mg/mL的標準蛋白和目標蛋白以0.33 mL/min的流量過凝膠柱，以洗脫體積Ve為橫坐標，標準蛋白分別是：細胞色素 C（12.4×103），胰凝乳蛋白酶原（25.6×103），雞卵清蛋白（44.3×103），牛血清白蛋白（66.5×103），磷酸酶 B（97.2×103）。

1.5 β-1，3-1，4-葡聚糖酶的最適pH和最適溫度

β-1，3-1，4-葡聚糖酶最適pH的測定：采用50 mmol/L pH 2.0-11.0范圍內(nèi)的不同緩沖液配制質(zhì)量分數(shù)1%大麥葡聚糖底物，然后在55℃下按標準方法測定 β-1，3-1，4-葡聚糖酶酶活，以最大值為100%，分別計算各pH條件下的相對酶活。緩沖體系包括：Glycine-HCl （pH 2.0～4.0）、Mcllvaine（pH 3.0～7.0）、Acetate （pH 4.0～6.0）、Na2HPO4-NaH2PO4（pH 6.0～8.0）、CHES（pH 8.0～10.0）、CAPS（pH 10.0～11.0）。

β-1，3-1，4-葡聚糖酶最適溫度的測定：采用50 mmol/L pH 5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液配制質(zhì)量分數(shù)1%大麥葡聚糖底物，在30～80℃范圍內(nèi)測定β-1，3-1，4-葡聚糖酶酶活力，以最大值 100%，分別計算各溫度下的相對酶活。

1.6 β-1，3-1，4-葡聚糖酶的底物特異性

用50 mmol/L pH 5.0乙酸-乙酸鈉緩沖液配制不同的聚糖底物（質(zhì)量分數(shù)%）。于55℃下參照標準方法測定酶活力，以葡聚糖酶對大麥葡聚糖的酶活力為100%，分別計算葡聚糖酶對各種底物的比酶活力和相對酶活力。聚糖底物包括：大麥葡聚糖、燕麥葡聚糖、地衣多糖、可得然膠、昆布多糖、CMC、櫸木木聚糖、槐豆膠、殼聚糖。另人工合成糖苷類底物pNP-glycosides：pNP-β -xylopyranoside，pNP-β -glucopyranoside，pNP-β-galactopyranoside 和 pNP-β-cellobioside用50 mmol/L pH 5.0乙酸-乙酸鈉緩沖液配制成5 mmol/L濃度的底物，55℃反應(yīng)10 min，測定410 nm處的吸光值。酶活力（U）定義為，在上述反應(yīng)條件下每分鐘水解底物釋放1 μmol pNP所需要的酶量。

1.7 β-1，3-1，4-葡聚糖酶的水解特性

最適緩沖體系下，底物質(zhì)量分數(shù)為1%的大麥葡聚糖，加酶量為10 U/mL，50℃水浴反應(yīng)，間隔一定時間取樣，沸水5 min滅活，之后采用薄層層析法（TLC）分析水解產(chǎn)物。

薄層層析法：硅膠板 Merck Slica Gel 254，展層液為V（正丁醇）∶V（乙酸）∶V（水）=2∶1∶1 系統(tǒng)，樣品點樣后將硅膠板用展層劑展開兩次，吹干后在其表面均勻用V（硫酸）∶V（甲醇）=5∶95 溶液浸濕，最后在150℃烘箱中烘烤3 min顯色。以葡萄糖及纖維寡糖（DP 2-4）的混合物為標準。

1.8 AaBglu29酶解燕麥麩皮制備葡寡糖

燕麥麩皮中β-1，3-1，4葡聚糖含量的測定參照Megazyme Mixed-linkage β-glucan含量測定試劑盒。燕麥麩皮內(nèi)源酶滅活參照Zhang等[10]的方法。以下所提到的燕麥麩皮均為內(nèi)源酶失活燕麥麩皮。

取40目燕麥麩皮2 g，加50 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液（50 mmol/L pH 5.0），加酶 200 U/g 底物，于50℃酶解8 h后，煮沸10 min終止酶解反應(yīng)，10 000 g離心10 min后取上清液過0.45 μm濾膜備TLC和HPLC分析。

按照如下順序依次優(yōu)化產(chǎn)糖條件：固液質(zhì)量體積比：1 g∶15 mL～1 g∶30 mL；酶解溫度：45～60 ℃；加酶量：50～150 U/g；酶解時間：0～8 h 間于不同時間取樣。TLC分析同1.7。HPLC分析：Agilent高效液相，RID檢測器，色譜條件：色譜柱為Shodex KS-802，流動相：水，流量：0.8 mL/min，柱溫：65 ℃，運行時間：20 min。

β-葡寡糖得率：YGOS=CG2-G4×V/2000×8.9%×100%式中：CG2-G4為酶解上清液二糖～四糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為酶解完成后離心上清液體積，mL；2 000為燕麥麩皮質(zhì)量，8.9%為本實驗燕麥麩皮中的β-1，3-1，4 葡聚糖質(zhì)量分數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 β-1，3-1，4-葡聚糖酶的純化

粗酶液經(jīng)硫酸銨沉淀、QSFF強陰離子柱和DEAE-52弱陰離子柱3步交換層析純化后得到電泳級純酶（AaBglu29）（圖1）。純化過程中酶活力回收率為13.9%，純化倍數(shù)為6.6，比酶活由1 432 U/mg提高到9 500 U/mg（表1）。SDS-PAGE法測定的酶相對分子質(zhì)量為30.7×103，Sephacryl-100凝膠層析方法測定的酶相對分子質(zhì)量為27.6×103，表明該酶為單亞基蛋白。

圖 1 泡盛曲霉 β-1，3-1，4-葡聚糖酶（AaBglu29）的純化電泳圖Fig.1 Purification of the β -1，3-1，4-glucanase from Aspergillus awamori

2.2 β-1，3-1，4-葡聚糖酶的最適pH和最適溫度

在不同pH下測定酶活力，AaBglu29的最適pH為5.0，在pH 3-8之間時，酶活力殘留50%以上（圖2a）。AaBglu29的最適溫度為55℃，當(dāng)反應(yīng)溫度為30-65 ℃時，β-1，3-1，4-葡聚糖酶殘余酶活力在50%以上（圖 2（b））。

2.3 β-1，3-1，4-葡聚糖酶的底物特異性

如表2所示，AaBglu29對大麥葡聚糖的比酶活力最高（9 500 U/mg），其次是燕麥葡聚糖（7 950 U/mg），最后是地衣多糖（5 180 U/mg）。 該酶對 CMC、櫸木木聚糖、可得然膠、昆布多糖、槐豆膠、殼聚糖和人工合成糖苷底物均沒有表現(xiàn)出活性，說明該酶底物特異性專一。

表1 泡盛曲霉β-1，3-1，4-葡聚糖酶（AaBglu29）的純化表Table 1 Purification of the β-1，3-1，4-glucanase from Aspergillus awamori

圖2 AaBglu29的最適pH和最適溫度Fig.2 Optimal pH and temperature of AaBglu29

表2 泡盛曲霉AaBglu29底物特異性Table 2 Substrate specificity of the purified AaBglu29

2.4 β-1，3-1，4-葡聚糖酶的水解特性

AaBglu29水解大麥葡聚糖的前期產(chǎn)物是聚合度5以上的葡寡糖和少量的葡三糖，隨著水解時間的延長，聚合度5以上的葡寡糖轉(zhuǎn)化為葡三糖和葡四糖，最終水解產(chǎn)物主要是葡三糖和葡四糖（圖3）。

圖3 AaBglu29水解大麥葡聚糖TLC圖Fig.3 TLC analysis of the hydrolytic products of barley β-glucan by AaBglu29

2.5 AaBglu29水解燕麥麩皮制備葡寡糖

燕麥麩皮中通常含有質(zhì)量分數(shù)5.5%～9.0%的β-1，3-1，4-葡聚糖，但不同地區(qū)產(chǎn)地的含量略有差異。燕麥麩皮含有質(zhì)量分數(shù)8.7%的β-1，3-1，4-葡聚糖，經(jīng)內(nèi)源酶滅活預(yù)處理后，其β-1，3-1，4-葡聚糖質(zhì)量分數(shù)為8.9%。

內(nèi)源酶失活前后的燕麥麩皮經(jīng)β-1，3-1，4-葡聚糖酶水解8 h后，水解產(chǎn)物均主要為葡三糖和葡四糖，但葡寡糖轉(zhuǎn)化率有較大差別，水解燕麥麩皮葡寡糖轉(zhuǎn)化率為70%，水解內(nèi)源酶失活后的燕麥麩皮葡寡糖轉(zhuǎn)化率達90%。故以下所提到的燕麥麩皮均為內(nèi)源酶失活燕麥麩皮。

首先考察不同燕麥麩皮底物質(zhì)量濃度對制備葡寡糖的影響（圖 4（a））。固液質(zhì)量體積比為 1 g∶15 mL時，葡寡糖轉(zhuǎn)化率為80%，提高固液質(zhì)量體積比至 1 g∶20 mL 時，葡寡糖轉(zhuǎn)化率（90%）達到最高，再提高固液質(zhì)量體積比對葡寡糖轉(zhuǎn)化率影響不大。其次研究水解溫度對制備葡寡糖的影響（圖4（b））。水解溫度為50℃時，葡寡糖轉(zhuǎn)化率最高，水解溫度高于55℃，葡寡糖轉(zhuǎn)化率則出現(xiàn)明顯下降。加酶量對制備葡寡糖的影響如圖4（c）所示。加酶量為50 U/g底物時，葡寡糖轉(zhuǎn)化率為75%，提高至100 U/g底物時，葡寡糖轉(zhuǎn)化率為90%，再提高加酶量，則對葡寡糖轉(zhuǎn)化率影響不大。

在最優(yōu)水解條件基礎(chǔ)上，考察了AaBglu29水解燕麥麩皮制備葡寡糖的水解歷程（圖5）。隨著水解時間的增加，葡三糖和葡四糖得率不斷提高，當(dāng)酶解時間為4 h時，葡寡糖轉(zhuǎn)化率達到最高（90%），此時葡三糖和葡四糖的得率分別為53.3%和33.8%。酶解時間繼續(xù)增至8 h時，葡寡糖轉(zhuǎn)化率不再變化。

圖4 AaBglu29酶解燕麥麩皮制備葡寡糖條件優(yōu)化Fig.4 Optimization of conditions for production of glucooligosaccharides from oat bran by AaBglu29

圖5 AaBglu29酶解燕麥麩皮產(chǎn)葡寡糖酶解歷程及HPLC分析圖Fig.5 Time course profile of glucooligosaccharides production from oat bran by AaBglu29

3 討 論

β-1，3-1，4-葡聚糖酶在食品和飼料等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用并受到很多研究者的關(guān)注[5]。目前，已經(jīng)有很多細菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶的純化和性質(zhì)報道，但真菌 β-1，3-1，4-葡聚糖酶報道較少[5]。 作者從泡盛曲霉液體發(fā)酵液中分離純化出一個酸性β-1，3-1，4-葡聚糖酶（AaBglu29），并對其酶學(xué)性質(zhì)和應(yīng)用進行了研究。

粗酶液經(jīng)3步純化得到電泳級純酶，比酶活（9 500 U/mg） 高于絕大多數(shù)微生物 β-1，3-1，4-葡聚糖酶，如來源于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilisLC-9，3 502 U/mg）[8]、 甲基營養(yǎng) 型芽 孢桿 菌（Bacillus methylotrophicus363.55 U/mg）[22]、巴倫葛茲類芽孢桿菌（Paenibacillus barengoltzii431 U/mg）[10]、碎囊毛霉 （Mucor petrsularis225.02 U/mg）[16]、 樟絨枝 霉（Malbranchea cinnamomea52.7 U/mg）[13]和嗜熱擬青霉（Paecilomyces thermophila6 241.6 U/mg）[11]的 β-1，3-1，4-葡聚糖酶，但低于黑曲霉（Aspergillus niger12 450.6 U/mg）[14]， 嗜 熱 子 囊 菌 （Thermoascus aurantiascus13 527 U/mg）[23]和米黑根毛霉（Rhizomucor miehei28 818 U/mg）[12]的 β-1，3-1，4-葡聚糖酶。AaBglu29的相對分子質(zhì)量為29×103，低于多數(shù)真菌 β-1，3-1，4-葡聚糖酶，如：嗜熱擬青霉（38.6×103）[11]、米黑根毛霉（35.4×103）[12]、樟絨枝霉（44.7×103）[13]和黑曲霉 （52×103）[14]來源的β-1，3-1，4-葡聚糖酶，但高于碎囊毛霉（17.2×103）的 β-1，3-1，4-葡聚糖酶[16]。

一般說來，酸性和耐熱性的β-1，3-1，4-葡聚糖酶更加適合應(yīng)用于啤酒釀造和飼料加工工業(yè)中[5]。但已報道的β-1，3-1，4-葡聚糖酶的最適pH大多處在中性范圍內(nèi) （pH 6.5～7.5），如碎囊毛霉（pH 6.0）[16]、嗜熱子囊菌（pH 6.0）[23]、枯草芽孢桿菌（pH 6.5）[8]、嗜熱擬青霉（pH 7.0）[11]和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（7.5）[22]的 β-1，3-1，4-葡聚糖酶，均高于本研究的 AaBglu29（pH 5.0）。 另外，樟絨枝霉 β-1，3-1，4-葡聚糖酶的最適pH為10.0，是目前真菌來源報道中最為耐堿的β-1，3-1，4-葡聚糖酶[13]。AaBglu29的最適溫度為55℃，高于碎囊毛霉（40℃）[16]和枯草芽孢桿菌（45 ℃）[8]的 β-1，3-1，4-葡聚糖酶，與樟絨枝霉[13]、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌[22]和巴倫葛茲類芽孢桿菌[10]的 β-1，3-1，4-葡聚糖酶（55 ℃）相同，但低于少數(shù)嗜熱真菌的β-1，3-1，4-葡聚糖酶 （嗜熱擬青霉 70 ℃和嗜熱子囊菌 75 ℃）[11，23]。AaBglu29 對β-1，3-1，4-葡聚糖表現(xiàn)出嚴格的底物專一性，與嗜熱擬青霉[11]、樟絨枝霉[13]、碎囊毛霉[16]和枯草芽孢桿菌[8]的β-1，3-1，4-葡聚糖酶是相似的。但也有一些β-1，3-1，4-葡聚糖酶表現(xiàn)出較寬泛的底物特異性，如米黑根毛霉的β-1，3-1，4-葡聚糖酶不僅對β-1，3-1，4-葡聚糖表現(xiàn)出活力，還對昆布多糖 （β-1，3-葡聚糖）表現(xiàn)出較高酶活力[12]。黑曲霉和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的β-1，3-1，4-葡聚糖酶不僅對β-1，3-1，4-葡聚糖表現(xiàn)酶活力，還對羧甲基纖維素鈉（β-1，4-葡聚糖）呈現(xiàn)酶活力[14，22]。 AaBglu29 水解大麥葡聚糖的產(chǎn)物為葡三糖和葡四糖，與樟絨枝霉[13]、米黑根毛霉[12]和枯草芽孢桿菌[8]的 β-1，3-1，4-葡聚糖酶相似，但與嗜熱擬青霉（葡二糖和葡三糖）[11]和嗜熱子囊菌（葡二糖和葡三糖）[23]的 β-1，3-1，4-葡聚糖酶不同。綜合比較而言，AaBglu29在食品和飼料領(lǐng)域具有很大的工業(yè)應(yīng)用潛力。

燕麥麩皮作為一種β-1，3-1，4-葡聚糖含量豐富的農(nóng)業(yè)廢棄物，其利用價值較大。目前國內(nèi)外研究大多集中于尋找從中提取β-1，3-1，4-葡聚糖的廉價、高效且環(huán)保的方法[23]。但隨著β-葡寡糖越來越多的功能活性報道[2-4]，利用燕麥麩皮制備葡寡糖的研究受到一些研究者的關(guān)注。如：Zhang等[10]利用巴倫葛茲類芽孢桿菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶水解燕麥麩皮制備以葡三糖和葡四糖為主的葡寡糖，轉(zhuǎn)化率為77.2%。 Yan等[23]利用嗜熱子囊菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶水解燕麥麩皮制備以葡二糖、葡三糖和葡四糖為主的葡寡糖，轉(zhuǎn)化率為47.1%。作者利用AaBglu29水解燕麥麩皮制備葡寡糖，經(jīng)優(yōu)化β-1，3-1，4-葡聚糖轉(zhuǎn)化率達90%，終產(chǎn)物為葡三糖和葡四糖。因此，AaBglu29在制備葡寡糖工業(yè)中具有較大的應(yīng)用潛力。

4 結(jié) 語

泡盛曲霉液體發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨沉淀和兩步陰離子交換層析純化后，可得到一個比酶活為9 500 U/mg 的 β-1，3-1，4-葡聚糖酶（AaBglu29）。該酶最適pH和最適溫度分別為5.0和55℃，其底物特異性專一，高效水解燕麥麩皮90%的β-1，3-1，4-葡聚糖轉(zhuǎn)化為葡寡糖。該酶優(yōu)良的酶學(xué)性質(zhì)說明其工業(yè)應(yīng)用潛力較大。