鼻咽癌及其不同臨床分期microRNA表達(dá)特征*

周小軍 林葆睿

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山醫(yī)院耳鼻咽喉科（中山市，528400）

microRNA（miR）是一類長(zhǎng)度約為19～25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小RNA分子，通過(guò)與靶基因的3′端非翻譯區(qū)互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合的方法，非常復(fù)雜地調(diào)控內(nèi)源基因的表達(dá)，與生物的生長(zhǎng)發(fā)育及多種疾病如腫瘤等密切相關(guān)，癌的起始和發(fā)展都涉及miR的改變。癌細(xì)胞中miR的表達(dá)水平異于正常組織而用于揭示人類癌癥發(fā)病機(jī)理，miR已成為腫瘤的診斷、分期、預(yù)后和療效相關(guān)的標(biāo)記物，為目前癌癥研究的前沿和熱點(diǎn)。鼻咽癌為好發(fā)于中國(guó)南方的具有明顯地域特性的腫瘤，號(hào)稱廣東瘤，惡性程度高，易發(fā)生淋巴結(jié)和全身轉(zhuǎn)移。既往已有專家研究了鼻咽癌miR特征[1-3]，但由于樣本及研究技術(shù)的限制，使得本研究有繼續(xù)研究的需要。本研究選擇在全世界鼻咽癌最高發(fā)區(qū)之一的廣東省中山市進(jìn)行，同時(shí)研究miR與鼻咽癌分期、病理的關(guān)系，報(bào)道如下。

資料與方法

1 臨床資料

病例來(lái)源于廣東中山市中醫(yī)院門(mén)診病例，時(shí)間從2014年5月～2015年10月，其中鼻咽癌患者17例，年齡 22～64歲，平均（46.47±11.17）歲，男 11例，女6例。

以鼻咽內(nèi)鏡檢查及增強(qiáng)CT確定鼻咽癌腫塊大小及浸潤(rùn)情況，以增強(qiáng)CT和/或頸部彩超確定頸部淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，全身肝膽脾腎B超及胸部X線檢查確定有無(wú)鼻咽癌全身轉(zhuǎn)移，鼻咽癌分期標(biāo)準(zhǔn)參見(jiàn)中國(guó)鼻咽癌2008年福州標(biāo)準(zhǔn)[4]，17例鼻咽癌，包括Ⅱ期6例，Ⅲ期6例，Ⅳ期5例。

鼻咽癌病理分類標(biāo)準(zhǔn)參照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)[5]，17例鼻咽癌包括分化型非角化性癌10例，未分化型癌7例。

慢性鼻咽炎患者12例，年齡20～55歲，平均（34.17±11.25）歲，男 8例，女 4例。

所有臨床病人在取得知情同意簽字后取鼻咽組織行病理診斷，另一份標(biāo)本置-80℃冰箱中保存待測(cè)。

2 miR Array

miRCURY LNATMmicroRNA Array（Exiqon，丹麥），探針數(shù)達(dá)3100個(gè)，覆蓋miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)人、小鼠、大鼠三物種全部miR及與三物種相關(guān)的所有病毒的miR，此芯片采用LNA專利捕獲探針技術(shù)，LNA是一類寡核苷酸衍生物，在寡核苷酸鏈中摻入LNA而制備的LNA捕獲探針，可升高熔解溫度（Tm），并且可以自由設(shè)計(jì)Tm值，從而實(shí)現(xiàn)Tm值均一化（72℃），保證了對(duì)所有靶點(diǎn)具有相同的親和性，且雜交溫度高可有效地避免非特異性雜交信號(hào)，從而具有高靈敏和高特異性（能檢測(cè)單堿基差異的miR）。在miR表達(dá)分析領(lǐng)域具有國(guó)際領(lǐng)先地位。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 樣品RNA提取及質(zhì)量控制

取-80℃保存的待檢鼻咽組織100mg，使用BioPulverizerTM冰凍粉碎組織，加1ml的RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen），使用Mini-Bead-Beater-16勻漿后抽提RNA。使用Nanodrop ND-1000測(cè)定RNA在分光光度計(jì)260nm、280nm和230nm的吸收值，以計(jì)算濃度并評(píng)估純度。變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)RNA純度及完整性。樣品質(zhì)量可靠，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 鼻咽癌組織明顯上調(diào)的miR

m i R 上調(diào)倍數(shù) P值 n o r m a l i z e d r a t i o鼻咽炎（1 2例） 鼻咽癌（1 7例）h s a-m i R-5 5 0 b-2-5 p 5.1 4 8 0.0 1 9 h s a-m i R-5 1 3 b-5 p 4.8 3 2 0.0 0 2 0.6 2 9±0.6 5 5 0.1 5 4±0.0 9 4 h s a-m i R-1 2 5 5 b-2-3 p 4.5 8 1 0.0 0 5 0.0 5 3±0.0 3 0 0.2 4 2±0.1 4 6 0.1 2 2±0.1 8 0 0.0 3 2±0.0 2 0 h s a-m i R-4 7 4 8 4.4 4 2 0.0 4 6 0.0 3 0±0.0 2 2 0.1 3 4±0.1 5 5 h s a-m i R-3 7 8 c 4.2 7 4 0.0 2 9 0.1 3 1±0.1 4 1 0.5 5 8±0.5 7 1 h s a-m i R-3 4 0-5 p 4.1 7 4 0.0 1 5 1.3 4 7±0.8 0 0 5.6 2 3±5.4 8 2 h s a-m i R-3 9 4 5 4.1 5 4 0.0 0 4 0.0 2 2±0.0 1 6 0.0 9 2±0.0 6 1 h s a-m i R-4 4 3 1 4.1 3 3 0.0 0 0 0.4 1 0±0.1 6 1 1.6 9 5±1.0 5 9 h s v 2-m i R-H 3 4.0 4 8 0.0 4 9 0.0 3 2±0.0 3 8 0.1 2 9±0.1 2 2 h s a-m i R-5 0 8 9-5 p 4.0 4 2 0.0 2 4 0.4 3 1±0.4 7 2 1.7 4 3±1.5 2 8 h s a-m i R-4 2 5 3 3.8 1 7 0.0 1 3 0.0 0 3±0.0 0 2 0.0 1 0±0.0 0 2 h s a-m i R-9 9 a-5 p 3.7 3 1 0.0 0 6 0.2 6 0±0.2 9 4 0.9 6 7±0.6 1 3 e b v-m i R-B A R T 1 8-3 p 3.7 2 1 0.0 0 5 0.4 1 6±0.4 4 4 1.5 5 0±1.1 8 8 h s a-m i R-1 6-2-3 p 3.6 3 0 0.0 2 1 0.2 8 6±0.2 2 5 1.0 3 8±1.0 0 4 h s a-m i R-4 5 2 9-3 p 3.6 1 2 0.0 0 9 0.0 8 3±0.0 8 0 0.3 0 0±0.1 9 4 h s a-m i R-1 9 1-5 p 3.6 1 2 0.0 4 8 2.2 4 5±1.5 5 8 8.1 0 8±9.3 8 5 h s a-m i R-4 5 2-5 p 3.5 2 4 0.0 0 9 0.1 0 2±0.0 8 8 0.3 6 0±0.2 7 0 h s a-m i R-1 7-5 p 3.5 2 2 0.0 1 7 0.4 2 2±0.1 4 9 1.4 8 8±1.1 9 3 h s a-m i R-4 3 2 2 3.4 0 3 0.0 4 1 0.0 0 4±0.0 0 3 0.0 1 3±0.0 0 5 h c m v-m i R-U S 2 5-1-3 p 3.2 1 0 0.0 0 0 0.0 7 4±0.0 4 0 0.2 3 6±0.1 2 4 h s a-m i R-3 3 9-5 p 3.2 0 6 0.0 1 3 0.2 3 8±0.1 8 4 0.7 6 4±0.6 4 3 h s a-m i R-3 7 8 e 3.1 1 8 0.0 1 4 0.1 2 3±0.1 1 2 0.3 8 3±0.2 9 8 h s a-m i R-4 2 5-5 p 3.1 0 7 0.0 2 9 0.1 6 9±0.0 9 1 0.5 2 6±0.4 0 7 h s a-m i R-4 7 7 3 3.1 0 2 0.0 4 3 0.0 2 1±0.0 1 9 0.0 6 4±0.0 2 2 h s a-m i R-3 1 7 5 3.0 4 8 0.0 4 2 0.4 7 2±0.6 3 5 1.4 3 8±1.4 1 7 h s a-m i R-3 7 8 b 3.0 3 3 0.0 0 5 0.1 2 0±0.1 0 4 0.3 6 5±0.2 3 7 h s a-m i R-4 3 3-5 p 3.0 2 8 0.0 3 7 2.7 8 8±0.8 4 2 8.4 4 4±8.5 9 1 h s a-m i R-4 6 7 3 2.9 9 8 0.0 2 9 0.0 3 6±0.0 2 6 0.1 0 9±0.0 9 2 h s a-m i R-6 7 6-5 p 2.9 7 1 0.0 1 6 0.0 1 1±0.0 0 3 0.0 3 2±0.0 1 2 h s a-l e t-7 c-3 p 2.9 2 1 0.0 4 5 0.0 4 3±0.0 2 6 0.1 2 6±0.0 8 8 h s a-m i R-5 8 7 2.9 1 6 0.0 4 1 0.0 0 2±0.0 0 2 0.0 0 7±0.0 0 2 h s a-m i R-4 6 7 7-3 p 2.9 0 4 0.0 4 0 0.0 9 8±0.0 9 0 0.2 8 4±0.2 4 9 h s a-m i R-2 0 0 b-3 p 2.9 0 0 0.0 1 3 1.3 6 0±1.1 0 8 3.9 4 5±3.1 0 3 h s a-m i R-1 0 6 a-5 p 2.8 8 8 0.0 4 1 0.3 2 6±0.3 1 2 0.9 4 2±0.7 9 2 h s a-m i R-3 9 3 4-5 p 2.8 7 4 0.0 0 2 0.0 6 8±0.0 4 5 0.1 9 6±0.1 1 5 h s a-m i R-1 8 1 a-5 p 2.8 7 3 0.0 3 2 1.7 8 5±1.8 4 2 5.1 2 8±4.6 6 5 h s a-m i R-1 8 1 d-5 p 2.8 2 9 0.0 2 6 0.2 6 7±0.2 3 0 0.7 5 6±0.6 6 6 h s a-m i R-4 3 1-3 p 2.8 2 5 0.0 2 4 0.0 2 2±0.0 1 9 0.0 6 2±0.0 4 6 h s a-m i R-9 2 a-2-5 p 2.7 5 1 0.0 3 4 0.0 1 8±0.0 1 4 0.0 5 0±0.0 3 0 h s a-m i R-1 0 6 b-5 p 2.7 1 4 0.0 3 3 1.4 3 6±0.8 8 4 3.8 9 9±3.5 9 6 h s a-m i R-2 1-3 p 2.5 5 7 0.0 4 2 0.2 3 8±0.1 8 8 0.6 0 8±0.4 7 3 h s a-m i R-4 4 4 1 2.4 8 4 0.0 4 7 0.5 6 0±0.2 9 6 1.3 9 2±1.3 1 1 h s a-m i R-4 7 3 6 2.4 7 1 0.0 3 5 0.0 0 4±0.0 0 1 0.0 1 1±0.0 0 3 h s a-m i R-4 8 9-3 p 2.4 5 4 0.0 1 9 0.0 2 3±0.0 0 5 0.0 5 6±0.0 2 9 h s a-m i R-1 8 a-3 p 2.3 9 7 0.0 4 4 0.0 3 3±0.0 1 6 0.0 7 9±0.0 5 2 h s a-m i R-7 1 1 2.3 7 2 0.0 0 8 0.2 0 8±0.1 1 0 0.4 9 3±0.3 2 0 h s a-m i R-4 2 3-3 p 2.3 5 6 0.0 4 2 0.2 9 3±0.1 8 8 0.6 9 0±0.6 0 1 h s a-m i R-1 8 1 b-5 p 2.3 1 0 0.0 4 9 0.2 9 7±0.2 8 3 0.6 8 6±0.5 4 6 h s a-m i R-2 0 5-5 p 2.2 8 9 0.0 1 5 6.4 0 4±3.8 5 6 1 4.6 5 7±1 0.1 7 1 h s a-m i R-3 6 1 3-5 p 2.2 4 8 0.0 1 8 0.0 1 0±0.0 0 6 0.0 2 2±0.0 0 8 h s a-m i R-9 9 b-3 p 2.2 4 3 0.0 2 9 0.3 3 9±0.1 8 8 0.7 6 0±0.5 8 9 h s a-m i R-6 1 2 2.2 2 8 0.0 0 7 0.0 3 5±0.0 2 2 0.0 7 8±0.0 4 1 h s v 1-m i R-H 1 4-3 p 2.1 9 4 0.0 0 8 0.0 8 1±0.0 5 7 0.1 7 7±0.0 9 6 h s a-m i R-5 1 8 8 2.1 4 5 0.0 0 2 0.0 4 7±0.0 3 0 0.1 0 1±0.0 3 6

m i R 上調(diào)倍數(shù) P值 n o r m a l i z e d r a t i o鼻咽炎（1 2例） 鼻咽癌（1 7例）h s a-m i R-3 1 7 8 2.0 7 4 0.0 4 1 h s a-m i R-4 6 9 0-5 p 2.0 5 0 0.0 3 6 1.7 9 3±1.2 8 9 0.0 7 4±0.0 4 2 h s a-m i R-5 5 2-3 p 2.0 4 8 0.0 4 1 0.0 4 9±0.0 2 6 0.1 0 0±0.0 6 4 0.8 6 4±0.6 7 5 0.0 3 6±0.0 2 7 h s a-m i R-1 8 3-5 p 2.0 4 3 0.0 1 9 0.2 9 2±0.1 8 1 0.5 9 7±0.3 8 1 h s a-m i R-7 6 5 2.0 3 8 0.0 3 7 0.0 5 1±0.0 3 8 0.1 0 5±0.0 7 4 h s a-m i R-3 6 7 0 2.0 0 6 0.0 0 4 0.0 8 8±0.0 5 8 0.1 7 6±0.0 4 6 h s a-m i R-3 0 b-5 p 2.0 0 5 0.0 2 6 0.5 9 4±0.4 0 7 1.1 9 0±0.7 7 6 h s a-m i R-3 7 2-5 p 1.9 8 9 0.0 4 0 0.0 6 2±0.0 2 4 0.1 2 3±0.0 7 3 h s a-m i R-3 6 5 5 1.9 7 7 0.0 0 9 0.0 4 3±0.0 2 5 0.0 8 4±0.0 3 8 h s a-m i R-6 7 6-3 p 1.9 2 5 0.0 3 7 0.0 2 8±0.0 2 3 0.0 5 4±0.0 2 6 h s a-m i R-3 0 e-3 p 1.9 0 3 0.0 4 4 0.4 4 4±0.2 4 6 0.8 4 6±0.6 0 0 h s a-m i R-8 8 7-3 p 1.8 6 5 0.0 0 7 0.0 5 0±0.0 2 2 0.0 9 2±0.0 3 5 h s a-m i R-1 2 7 3 e 1.7 6 8 0.0 4 5 0.4 9 4±0.2 5 4 0.8 7 3±0.5 6 3 h s a-m i R-6 2 8-3 p 1.7 5 5 0.0 2 5 0.2 1 6±0.1 5 2 0.3 7 9±0.1 8 1 h s a-m i R-3 1 3 5 b 1.5 3 1 0.0 3 2 0.1 1 2±0.0 4 0 0.1 7 1±0.0 7 7

3.2 RNA標(biāo)記

使用miRCURYTMArray Power Labeling kit標(biāo)記試劑盒（Cat#208032-A,Exiqon）對(duì)miRNA進(jìn)行標(biāo)記。具體步驟如下：

①1微克的 RNA加水至 2μL加 1μL的 CIP buffer and CIP酶（Exiqon）。混合后置于 37°C下 30 min。

②將樣品置于95°C下5min終止反應(yīng)。加入3μL 的 labeling buffer，1.5μL 的 fluorescent label(Hy3TM)，2.0μL 的 DMSO,2.0μL 的 labeling enzyme。在16°C下反應(yīng)1h。

③將樣品置于65°C下15min終止反應(yīng)。

3.3 RNA與芯片雜交

將待測(cè)樣品與miRCURY LNATMmicroRNA Array芯片雜交，具體步驟如下：

①)25μL的樣品與25μL的雜交緩沖液混合，95°C變性2min，然后置于冰上2min。

②與芯片在56°C下雜交16～20h，雜交系統(tǒng)為Nimblegen Systems,Inc.,Madison,WI,USA。

③雜交完成后，使用Wash buffer kit（Exiqon）清洗芯片。

④圖像采集及數(shù)據(jù)分析

使用Axon GenePix 4000B芯片掃描儀掃描芯片的熒光強(qiáng)度，并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)換成數(shù)字型數(shù)據(jù)保存，使用配套軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析運(yùn)算。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 鼻咽癌組織明顯上調(diào)及下調(diào)的miR

對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理及Median均一化處理后，以上調(diào)或下調(diào)差異達(dá)1.5倍以上且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，檢測(cè)結(jié)果顯示明顯上調(diào)的miR 96個(gè)，其中上調(diào)2倍以上者88個(gè)，上調(diào)3倍以上者54個(gè)，見(jiàn)表1；明顯下調(diào)的miR73個(gè)，其中下調(diào)2倍以上者24個(gè)，下調(diào)3倍以上者5個(gè)，見(jiàn)表1及表2。

表2 鼻咽癌組織明顯下調(diào)的miR

以上結(jié)果表明：在鼻咽癌組織中，miR上調(diào)表達(dá)數(shù)量要多于下調(diào)表達(dá)，上調(diào)表達(dá)的幅度也明顯大于下調(diào)表達(dá)，故miR在鼻咽癌組織中以上調(diào)表達(dá)為主。

m i R 下調(diào)倍數(shù) P值 n o r m a l i z e d r a t i o鼻咽炎（1 2例） 鼻咽癌（1 7例）h s a-m i R-4 5 3 9 2.3 6 3 0.0 0 4 0.9 5 4±0.5 0 5 0.4 0 4±0.3 4 7 h s a-m i R-2 9 6-3 p 2.3 5 4 0.0 0 2 0.2 3 1±0.1 3 2 0.0 9 8±0.0 6 0 h s a-m i R-3 1 6 0-3 p 2.3 0 7 0.0 1 6 0.0 5 4±0.0 2 2 0.0 2 3±0.0 0 9 h s a-m i R-4 2 9 2 2.2 2 3 0.0 0 2 3.0 3 9±1.4 4 9 1.3 6 7±1.1 1 6 h s a-m i R-4 7 1 5-3 p 2.1 8 1 0.0 3 4 0.1 5 7±0.0 9 2 0.0 7 2±0.0 6 0 h s a-m i R-3 7 1 b-5 p 2.1 7 4 0.0 0 1 6.0 7 2±2.8 1 9 2.7 9 3±1.9 5 5 h s a-m i R-3 6 5 3-3 p 2.1 6 7 0.0 1 9 1 5.4 2 7±9.2 5 8 7.1 2 0±7.9 3 9 h s a-m i R-5 0 4-5 p 2.1 6 0 0.0 4 2 0.0 5 4±0.0 2 0 0.0 2 5±0.0 1 6 h s a-m i R-2 9 c-5 p 2.1 4 4 0.0 4 8 0.3 6 7±0.3 1 3 0.1 7 1±0.1 1 7 h s a-m i R-3 9 7 2 2.1 3 3 0.0 0 4 0.2 5 5±0.1 5 1 0.1 1 9±0.0 6 7 h s a-m i R-3 3 5-3 p 2.1 0 4 0.0 0 1 5.0 2 4±2.2 5 7 2.3 8 7±1.3 3 4 h s a-m i R-3 1 2 7-3 p 2.0 7 8 0.0 1 2 0.4 2 8±0.2 8 1 0.2 0 6±0.1 2 2 h s a-m i R-4 6 6 5-3 p 2.0 1 2 0.0 1 4 0.3 8 5±0.2 4 5 0.1 9 1±0.1 3 5 s v 4 0-m i R-S 1-5 p 2.0 0 8 0.0 0 1 5.9 7 7±2.2 8 8 2.9 7 7±1.6 6 8 h s a-m i R-6 6 4 b-5 p 2.0 0 1 0.0 2 8 1.0 5 5±0.7 7 0 0.5 2 7±0.4 0 2 e b v-m i R-B A R T 1 9-5 p 1.9 9 8 0.0 3 1 0.2 4 2±0.1 7 6 0.1 2 1±0.0 7 9 h s a-m i R-4 6 4 2 1.9 6 2 0.0 1 2 0.4 0 0±0.2 2 2 0.2 0 4±0.1 5 7 h s a-m i R-3 9 4 3 1.9 6 0 0.0 2 1 0.3 7 2±0.2 5 1 0.1 9 0±0.1 3 0 h s a-m i R-1 4 9-3 p 1.9 5 9 0.0 1 1 1.3 2 3±0.6 6 3 0.6 7 5±0.5 6 4 h s a-m i R-2 9 a-5 p 1.9 5 1 0.0 4 8 0.4 6 1±0.2 7 6 0.2 3 6±0.2 7 1 h s a-m i R-3 3 0-3 p 1.9 4 6 0.0 4 9 0.2 7 5±0.1 9 0 0.1 4 1±0.0 9 5 h s a-m i R-4 6 4 9-3 p 1.9 4 0 0.0 0 1 0.2 1 6±0.0 8 8 0.1 1 2±0.0 6 1 h s a-m i R-3 6 5 b-5 p 1.9 3 4 0.0 3 2 0.2 7 8±0.1 9 5 0.1 4 4±0.1 0 3 h s a-l e t-7 d-3 p 1.9 2 5 0.0 2 2 1.1 0 4±0.7 6 6 0.5 7 4±0.3 3 9 h s a-m i R-6 3 8 1.8 8 2 0.0 2 3 1.2 2 3±0.8 3 8 0.6 5 0±0.3 6 4 h s a-m i R-9 4 0 1.8 7 4 0.0 1 9 0.3 8 2±0.2 3 4 0.2 0 4±0.1 3 5 h s a-m i R-4 3 1 3 1.8 7 1 0.0 4 6 0.1 5 9±0.1 0 5 0.0 8 5±0.0 6 3 h s a-m i R-4 7 3 1-3 p 1.8 5 9 0.0 1 7 0.3 3 6±0.1 9 8 0.1 8 1±0.1 1 9 h s a-m i R-1 3 8-5 p 1.8 5 7 0.0 4 2 0.2 1 8±0.1 5 8 0.1 1 7±0.0 6 6 h s a-m i R-4 5 3 7 1.8 4 8 0.0 3 5 0.2 3 0±0.1 4 0 0.1 2 4±0.0 6 3 h s a-m i R-3 2 4-3 p 1.8 4 4 0.0 0 3 0.3 6 9±0.1 7 5 0.2 0 0±0.0 9 5 h s a-m i R-5 1 8 e-5 p* 1.8 3 2 0.0 1 1 0.9 5 5±0.5 3 2 0.5 2 1±0.2 8 6 h s a-m i R-2 1 1 5-3 p 1.8 1 7 0.0 0 7 0.2 8 2±0.1 3 4 0.1 5 5±0.0 9 3 h s a-m i R-4 6 6 8-5 p 1.8 0 7 0.0 1 4 5.1 6 6±3.0 3 6 2.8 5 9±1.4 7 3 h s a-m i R-3 1 5 0 b-5 p 1.8 0 6 0.0 4 2 0.3 3 6±0.2 3 4 0.1 8 6±0.1 3 0 k s h v-m i R-K 1 2-1 0 b 1.7 9 3 0.0 1 9 0.5 0 6±0.2 9 9 0.2 8 2±0.1 6 3 k s h v-m i R-K 1 2-1 0 a-3 p 1.7 9 0 0.0 2 1 0.5 7 3±0.3 5 5 0.3 2 0±0.1 7 1 h s a-m i R-4 9 1-3 p 1.7 6 0 0.0 0 3 3 9.6 9 8±1 3.7 4 3 2 2.5 5 4±1 3.0 5 8 h s a-m i R-5 1 9 e-3 p 1.7 4 4 0.0 4 9 3.9 4 3±2.6 7 0 2.2 6 1±1.0 9 9 h s v 1-m i R-H 8-3 p 1.7 2 1 0.0 2 7 2.7 3 8±1.3 3 1 1.5 9 1±1.1 9 6 h s a-m i R-3 1 4 6 1.7 0 8 0.0 0 5 0.4 5 0±0.2 3 1 0.2 6 4±0.0 6 5 h s a-m i R-5 1 0 0 1.7 0 6 0.0 1 3 2 4.5 4 3±7.3 9 2 1 4.3 8 9±1 1.1 6 3 h s a-m i R-3 7 1 4 1.6 9 4 0.0 1 6 0.5 2 1±0.2 5 8 0.3 0 7 5±0.1 7 5 h s a-m i R-4 7 8 7-5 p 1.6 9 2 0.0 1 2 1 1.3 6 1±4.4 4 7 6.7 1 3±4.3 8 8 h s a-m i R-4 3 0 0 1.6 9 1 0.0 4 9 0.6 4 8±0.4 4 0 0.3 8 3±0.2 1 9 h s a-m i R-3 6 8 9 a-5 p# 1.6 8 6 0.0 3 1 0.2 5 9±0.1 3 8 0.1 5 4±0.0 7 6 h s a-m i R-4 6 9 7-3 p 1.6 8 4 0.0 1 7 0.2 8 9±0.1 2 6 0.1 7 2±0.1 1 3 h s a-m i R-6 1 5-3 p 1.6 8 4 0.0 3 8 0.9 9 7±0.6 3 2 0.5 9 2±0.2 8 8 h s a-m i R-4 7 0 8-3 p 1.6 7 9 0.0 2 8 1 0.3 5 4±4.3 9 6 6.1 6 7±4.7 3 7 h s v 2-m i R-H 2 4 1.6 7 6 0.0 0 8 0.8 6 7±0.4 3 2 0.5 1 7±0.1 7 9 h s a-m i R-4 8 0 0-3 p 1.6 6 1 0.0 3 2 6.5 4 9±3.6 1 1 3.9 4 3±2.3 7 2 h s a-m i R-1 2 4 6 1.6 5 7 0.0 0 1 1 0.2 4 7±3.7 1 2 6.1 8 4±1.6 1 1 h s a-m i R-4 7 4 2-3 p 1.6 5 1 0.0 5 0 0.7 6 7±0.5 0 8 0.4 6 4±0.2 4 5 h s a-m i R-4 6 8 5-3 p 1.6 4 4 0.0 2 5 0.4 2 2±0.2 3 4 0.2 5 7±0.1 2 6

*hsa-miR-518e-5p 與 hsa-miR-519a-5p、hsa-miR-519b-5p、hsa-miR-519c-5p、hsa-miR-522-5p、hsa-miR-523-5p 為同一個(gè)ID探針（13137）#hsa-miR-3689a-5p與hsa-miR-3689b-5p/hsa-miR-3689e為同一個(gè)ID探針（148251）

2 鼻咽癌不同臨床分期差異表達(dá)的miR

鼻咽癌重要特征為浸潤(rùn)、擴(kuò)散及轉(zhuǎn)移，其不同的臨床分期代表鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的不同階段。對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理及Median均一化處理后，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在鼻咽癌不同臨床分期存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的miR有77個(gè)，見(jiàn)表3。結(jié)果顯示隨著鼻咽癌病情的變化（即臨床分期不同），miR表達(dá)的種類及水平也可出現(xiàn)不同，說(shuō)明miR既參與調(diào)控鼻咽癌的發(fā)生也參與調(diào)控鼻咽癌病情的進(jìn)展。而同時(shí)在鼻咽癌及其不同臨床分期中都參與調(diào)控作用的（即差異表達(dá)）miR有20個(gè)，其中2個(gè)miR為上調(diào)表達(dá)，見(jiàn)表4，18個(gè)miR為下調(diào)表達(dá)，見(jiàn)表5。

在鼻咽癌及鼻咽癌不同臨床分期均有差異表達(dá)的miR，它們的表達(dá)也非線性關(guān)系，即在鼻咽癌高（低）表達(dá)的miR，并非依臨床分期的增高（病情加重）而呈現(xiàn)一致性高（低）表達(dá)，如在鼻咽癌及鼻咽癌不同臨床分期均高表達(dá)的2個(gè)miR，在Ⅱ期、Ⅲ期的表達(dá)為高值，而在Ⅳ期的表達(dá)為低值；在鼻咽癌及鼻咽癌不同臨床分期均低表達(dá)的18個(gè)miR，其相對(duì)低表達(dá)的大部分在Ⅱ期，而相對(duì)高表達(dá)的在Ⅲ期及Ⅳ期，顯示miR表達(dá)活性與臨床分期的負(fù)相關(guān)性和復(fù)雜性。

表3 鼻咽癌不同臨床分期有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的miR

m i R n o r m a l i z e d r a t i oⅡ期(6例)Ⅲ期(6例)Ⅳ期(5例)F值 P值h s a-m i R-3 1 2 7-3 p h s a-m i R-4 7 6 9-3 p h s a-m i R-3 1 8 4-5 p 0.3 1 3±0.1 1 6 0.4 8 1±0.1 9 1 0.3 2 7±0.1 8 0 0.1 7 5±0.0 9 9 0.3 1 8±0.1 1 7 0.0 7 0±0.0 3 4 h s a-m i R-3 7 1 4 h s a-m i R-1 4 9-3 p h s a-m i R-5 0 0 a-5 p h s a-m i R-4 8 4 h s a-m i R-1 8 b-3 p 0.1 0 8±0.0 5 6 0.2 7 8±0.0 5 9 0.1 4 3±0.1 2 4 0.1 6 4±0.0 4 4 0.6 1 0±0.3 1 5 0.2 5 3±0.1 2 4 0.2 5 2±0.1 5 9 0.1 7 3±0.1 1 5 0.4 5 7±0.1 6 3 0.3 3 0±0.2 4 5 0.1 1 4±0.1 0 7 0.5 5 0±0.2 3 9 0.5 7 9±0.2 9 7 0.3 0 0±0.1 7 5 1.1 6 8±0.8 1 5 0.3 5 3±0.1 7 1 0.3 1 6±0.1 4 9 0.3 0 9±0.2 3 6 6.5 9 3 0.0 1 1 3.7 6 0 0.0 4 9 4.9 8 7 0.0 3 9 6.8 1 6 0.0 0 9 3.9 6 8 0.0 4 3 4.4 4 6 0.0 3 2 4.0 7 4 0.0 4 0 4.8 9 4 0.0 2 4 h s a-m i R-3 1 8 0-5 p 0.1 1 0±0.0 7 3 0.2 2 9±0.1 3 6 4.3 9 4 0.0 3 3 h s a-m i R-3 6 8 7 2.3 8 0±0.9 5 2 0.5 4 4±0.4 4 9 2.0 4 4±1.3 3 5 4.9 5 8 0.0 2 7 h s a-m i R-4 7 3 1-3 p 0.0 8 4±0.0 5 1 0.2 5 7±0.1 3 0 0.2 0 6±0.1 1 0 4.5 1 6 0.0 3 1 h s a-m i R-1 4 4-3 p 1.3 2 5±1.6 6 8 0.8 1 5±0.7 5 9 4.5 7 8±3.2 3 4 5.2 7 6 0.0 2 0 h s a-m i R-2 1 1 6-5 p 0.6 5 2±0.5 7 6 1.7 5 1±1.2 0 7 0.5 8 7±0.1 8 5 3.8 2 2 0.0 4 7 h s a-m i R-6 6 5 0.7 1 0±0.3 7 8 0.2 3 9±0.1 9 5 0.4 8 7±0.2 5 0 4.0 4 1 0.0 4 1 h s a-m i R-1 2 6 9 b 0.0 2 6±0.0 0 8 0.0 9 6±0.0 7 5 0.0 2 9±0.0 1 8 4.2 7 9 0.0 4 5 h s a-m i R-4 6 8 6 0.5 3 3±0.1 8 8 0.2 3 0±0.1 8 7 0.3 8 3±0.1 9 0 3.9 0 6 0.0 4 5 h s a-m i R-6 5 9-5 p 0.0 9 1±0.0 6 7 0.0 6 4±0.0 5 4 0.2 1 8±0.0 9 7 5.7 0 9 0.0 1 8 h s a-m i R-6 3 5 0.0 9 5±0.0 7 4 0.0 4 9±0.0 6 1 0.2 0 4±0.1 1 4 4.7 9 9 0.0 2 6 h s a-m i R-2 5-5 p 0.5 9 5±0.1 6 2 0.3 6 9±0.1 7 1 0.6 3 0±0.1 1 0 4.9 7 2 0.0 2 3 h s a-m i R-1 1 8 4 0.7 1 6±0.1 7 7 0.2 8 6±0.1 6 7 0.7 5 7±0.3 0 3 5.5 8 4 0.0 2 1 h s a-m i R-9 4 0 0.0 9 5±0.0 4 2 0.2 7 2±0.1 3 0 0.2 5 2±0.1 6 3 3.9 0 4 0.0 4 5 h s a-m i R-4 4 8 1 0.2 2 7±0.0 9 3 0.0 6 6±0.0 9 9 0.1 4 1±0.0 3 5 4.9 2 9 0.0 2 7 h s a-m i R-3 3 1-5 p 0.0 2 5±0.0 2 1 0.0 9 2±0.0 5 6 0.0 7 0±0.0 2 1 5.6 6 0.0 2 h s a-m i R-1 9 a-3 p 2.6 4 3±2.1 6 6 0.4 8 9±0.3 2 1 3.8 4 3±2.9 9 7 3.7 6 6 0.0 4 9 h s a-m i R-2 0 8 a-5 p 0.4 2 3±0.1 0 5 0.6 5 2±0.1 0 5 0.4 2 8±0.1 4 8 4.9 3 3 0.0 3 0 h s a-m i R-1 4 2-3 p 1 5.4 6 2±9.7 3 0 1.0 2 2±1.0 1 5 9.6 8 8±5.5 6 6 6.2 5 5 0.0 1 4 k s h v-m i R-K 1 2-1 0 b 0.1 5 8±0.0 6 6 0.4 1 6±0.1 5 9 0.2 7 0±0.1 6 1 5.6 0 4 0.0 1 6 h s a-m i R-4 4 4 5-5 p 5.5 9 7±1 1.3 8 0 2 3.4 3 2±1 8.1 0 4 1.9 6 2±0.8 6 1 4.6 1 8 0.0 2 9 h s a-m i R-1 2 5 a-3 p 0.2 3 5±0.0 7 9 0.0 9 9±0.0 8 4 0.1 9 7±0.0 5 5 4.0 3 1 0.0 4 9 h s a-m i R-2 9 c-3 p 1.3 5 8±1.2 9 9 0.1 0 2±0.1 0 1 1.4 5 3±0.4 1 4 5.0 2 0.0 2 3 h s a-m i R-1 4 0-3 p 1.2 0 4±0.9 6 6 0.8 2 5±0.9 7 8 3.2 8 7±2.0 8 4 4.8 7 2 0.0 2 5 h s a-m i R-1 3 5 a-3 p 0.0 9 2±0.0 4 8 0.0 3 7±0.0 2 5 0.0 8 5±0.0 2 3 4.3 6 0 0.0 3 4 h s a-m i R-1 5 a-5 p 1.7 8 5±1.2 0 3 0.6 5 3±0.3 7 7 2.5 2 3±1.4 7 9 4.1 2 9 0.0 3 9 h s a-m i R-1 9 5-5 p 0.1 2 3±0.0 5 4 0.0 6 8±0.0 4 9 0.3 6 0 v 0.2 5 6 5.0 8 3 0.0 2 5 h s a-m i R-2 9 a-3 p 2.5 2 8±2.2 1 5 0.4 1 2±0.3 2 7 2.5 0 1±0.9 5 6 4.1 8 9 0.0 3 8 h s a-m i R-1 2 7 3 f 0.2 5 7±0.1 6 7 0.0 6 2±0.0 6 1 0.1 9 2±0.1 0 7 4.0 7 2 0.0 4 0 h s a-m i R-4 6 6 5-3 p 0.0 7 7±0.0 4 2 0.2 7 3±0.1 2 4 0.2 2 9±0.1 5 7 4.7 9 5 0.0 2 6 h s a-m i R-4 6 4 2 0.0 8 2±0.0 3 2 0.2 9 6±0.1 7 4 0.2 3 9±0.1 7 0 3.7 8 4 0.0 4 9 h s a-m i R-4 7 5 8-3 p 0.1 5 4±0.0 9 2 3 0.0 7 4±0.0 6 5 0.3 2 6±0.0 9 9 1 2.0 8 4 0.0 0 1 h s a-m i R-5 1 8 e-5 p* 0.5 3 2±0.2 3 4 0.2 9 3±0.1 5 4 0.7 8 4±0.2 9 0 6.3 3 8 0.0 1 1 h s a-m i R-3 9 4 3 0.0 8 3±0.0 5 7 0.2 8 1±0.1 2 1 0.2 0 9±0.1 4 2 4.9 5 4 0.0 2 4 h s a-m i R-4 3 0 0 0.5 1 3±0.2 1 0 0.1 9 9±0.1 4 5 0 0.4 4 9±0.2 0 3 4.6 8 3 0.0 2 8 h s a-m i R-4 4 3 4 0.1 6 2±0.0 6 8 0.0 5 5±0.0 5 4 0.1 4 3±0.0 5 9 4.6 5 9 0.0 3 0 h s a-m i R-4 8 0 0-5 p 0.4 9 9±0.1 5 0 0.2 7 6±0.1 2 7 0.5 0 6±0.1 6 3 4.6 2 6 0.0 2 9 e b v-m i R-B H R F 1-2-3 p 0.7 4 6±0.3 6 1 0.2 2 9±0.0 4 6 0.7 4 1±0.2 7 6 5.0 0 7 0.0 2 8 h s a-m i R-5 5 7 1-5 p 0.5 5 5±0.1 6 9 1.0 3 7±0.2 0 6 0.5 0 4±0.1 1 0 1 4.0 5 4 0.0 0 1 h s a-m i R-3 3 8-3 p 0.0 6 7±0.0 1 7 0.0 0 6±0.0 0 5 0.0 6 7±0.0 2 0 1 4.3 2 8 0.0 0 2 h s a-m i R-5 5 0 b-3 p 0.1 2 0±0.0 6 7 0.1 4 4±0.1 0 1 0.3 5 8±0.2 0 9 4.7 0 7 0.0 2 9 h s a-m i R-6 6 3 a 0.6 2 5±0.1 1 0 0.2 4 2±0.1 4 3 0.5 3 2±0.2 6 0 4.9 9 7 0.0 2 9 k s h v-m i R-K 1 2-1 0 a-3 p 0.1 7 5±0.0 6 4 0.4 5 0±0.1 4 7 0.3 4 0±0.1 8 7 5.9 8 6 0.0 1 3 0.2 9 1±0.1 1 1

*hsa-miR-518e-5p 與 hsa-miR-519a-5p、hsa-miR-519b-5p、hsa-miR-519c-5p、hsa-miR-522-5p、hsa-miR-523-5p 為同一個(gè)ID探針（13137）

表4 鼻咽癌明顯上調(diào)且與臨床分期有關(guān)的miR

表5 鼻咽癌明顯下調(diào)且與臨床分期有關(guān)的miR

3 鼻咽癌不同病理類型差異表達(dá)的miR

鼻咽癌病理類型主要分為角化癌、非角化性分化型癌和未分化型癌，在鼻咽癌高發(fā)區(qū)（廣東中山）主要多見(jiàn)后兩者，其中未分化癌惡性程度高，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，相比于非角化性分化型癌，未分化癌明顯下調(diào)表達(dá)的miR有6個(gè)，見(jiàn)表6，明顯上調(diào)表達(dá)的miR有10個(gè)，見(jiàn)表7，顯示隨著鼻咽癌惡性程度升高，表達(dá)上調(diào)的miR種類增加。

表6 未分化型鼻咽癌明顯下調(diào)表達(dá)miR

表7 未分化型鼻咽癌明顯上調(diào)表達(dá)miR

討論

1 miR與鼻咽癌

miR是一類在進(jìn)化過(guò)程高度保守的具有時(shí)間及空間特異性表達(dá)的非編碼RNA，但卻可以調(diào)節(jié)超過(guò)60%的蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)，功能廣泛包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡和發(fā)育過(guò)程，目前成為腫瘤領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，在覆蓋miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)三物種（人、小鼠、大鼠）全部miR表達(dá)譜芯片2800個(gè)miR中，明顯上調(diào)1.5倍以上且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的miR有96個(gè)，下調(diào)1.5倍以上且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的miR有73個(gè)。與鼻咽癌臨床分期相關(guān)的miR有77個(gè)，與鼻咽癌病理類型相關(guān)的miR有16個(gè)。miR與鼻咽癌的研究已有相當(dāng)多的文獻(xiàn)，但由于所選用的標(biāo)本差異（鼻咽組織或血液）及技術(shù)差異，使得研究結(jié)果存在著差異。最近有作者[6]對(duì)既往研究采用Meta分析方法顯示在鼻咽癌上調(diào)及下調(diào)分別有3個(gè)及4個(gè)miR，就包括了本研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的miR-205-5p及下調(diào)表達(dá)的miR-29（本研究為miR-29a-5p及 miR-29c-5p）。hsa-miR-205定位于1q32.2，在多種腫瘤中均有相關(guān)的研究報(bào)道。由于腫瘤在發(fā)生發(fā)展中具有不同的背景，miR-205在不同的腫瘤中發(fā)揮不同的作用,在乳腺癌[7]、在肺癌[8]都顯著上調(diào)。

2 鼻咽癌與EB病毒miR

在上調(diào)的96個(gè)miR中，與EB病毒相關(guān)的miR數(shù)量較多（16個(gè)）而且上調(diào)的倍數(shù)也較高，包括了ebv-miR-BART1-5p、ebv-miR-BART1-3p、ebvmiR-BART4-5p、ebv-miR-BART10-3p、ebv-miRBART2-5p、ebv-miR-BART16、ebv-miR-BART12、ebv-miR-BART6-3p、ebv-miR-BART5-5p、ebvmiR-BART2-3p、ebv-miR-BART9-5p、ebv-miRBART13-3p、ebv-miR-BART9-3p、ebv-miRBART8-3p、ebv-miR-BART21-3p、ebv-miRBART18-3p、高表達(dá)，僅 ebv-miR-BART19-5p低表達(dá)。這種情況在其他學(xué)者研究中也得到證實(shí)[9，10]。EBV相關(guān)miR可能通過(guò)潛伏期膜蛋白（LMP1）進(jìn)而調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）信號(hào)而控制細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡[9]。眾所周知，EBV與鼻咽癌密切相關(guān)，臨床已將EBV相關(guān)抗體檢查作為早期篩查鼻咽癌的指標(biāo)。而本項(xiàng)目的進(jìn)一步研究，將使特異性EBVmiR的高表達(dá)成為鼻咽癌分子診斷指標(biāo)。

3 特定miR與鼻咽癌

結(jié)合文獻(xiàn)分析，特定miR與鼻咽癌關(guān)系分析如下。hsa-miR-378與癌癥關(guān)系密切，為目前癌癥研究熱點(diǎn)，在胃癌、大腸癌表達(dá)下調(diào)，擔(dān)當(dāng)抑癌基因角色；在乳腺癌及肺癌表達(dá)上調(diào)，擔(dān)當(dāng)促癌基因角色。本研究發(fā)現(xiàn) hsa-miR-378b、hsa-miR-378c、hsamiR-378e在鼻咽癌均高表達(dá)，這也在其他學(xué)者的研究中得到佐證[11]，且hsa-miR-378c還與鼻咽癌臨床分期有關(guān)，主要表現(xiàn)為在Ⅲ期高表達(dá)，與Ⅱ期及Ⅳ期表達(dá)有明顯差異。但也有相反結(jié)論[12]，顯示hsamiR-378在鼻咽癌為低表達(dá)，這是否與其分期有關(guān)？特此列明。hsa-miR-29a-5p在肝癌中呈現(xiàn)高表達(dá)[13]，但我們研究顯示hsa-miR-29a-5p、hsa-miR-29c-5p在鼻咽癌均低表達(dá)，而且hsa-miR-29a-5p、hsamiR-29c-3p低表達(dá)與分期有關(guān)，其低表達(dá)主要在Ⅲ期，與Ⅱ期及Ⅳ期表達(dá)有明顯差異。本研究顯示hsa-miR-34在鼻咽癌低表達(dá)，其實(shí)，miR-34在多種腫瘤中包括鼻咽癌在內(nèi)多呈現(xiàn)低表達(dá)[1]，且其低表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，目前已傾向性認(rèn)為它是腫瘤治療的潛在靶標(biāo)[14]，顯示出miR-34在癌癥研究中的價(jià)值。

4 miR調(diào)控的復(fù)雜性

miR調(diào)控腫瘤已成為腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)，但調(diào)控的復(fù)雜性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出我們的想像。miR在鼻咽癌與鼻咽炎、鼻咽癌的不同臨床分期及不同病理類型均存在著表達(dá)差異，miR在鼻咽癌發(fā)病方面表達(dá)差異明顯，而在其不同進(jìn)展階段及不同惡性程度的表達(dá)差異要小些，而更有特點(diǎn)的是，在鼻咽癌變時(shí)上調(diào)或下調(diào)的miR并未隨著病情進(jìn)展而繼續(xù)上調(diào)或下調(diào)，多呈現(xiàn)負(fù)反饋表現(xiàn)，即表現(xiàn)為下調(diào)或上調(diào)。若遵循尋找“單一特征性miR對(duì)鼻咽癌診斷”這一臨床思維肯定存在著缺陷，網(wǎng)絡(luò)樣miR調(diào)控鼻咽癌可能為鼻咽癌今后研究的出路。