LncROR在促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用中的研究*

張雪 薛曉成 陳曉平 張燚 滕偉強(qiáng) 李璨 魯?shù)?/p>

1上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室（200135）

2上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院耳鼻咽喉科

3第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（上海）

4寧夏醫(yī)科大學(xué)在讀研究生

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）是我國(guó)南方地區(qū)高發(fā)腫瘤之一，占頭頸部腫瘤發(fā)病率首位，其發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)[1]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition,EMT）是上皮細(xì)胞失去細(xì)胞極性并獲得間充質(zhì)表型，從而誘導(dǎo)細(xì)胞增殖遷移的過(guò)程[2]。研究表明，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化在鼻咽癌的發(fā)生中起重要作用，但具體機(jī)制尚不清楚。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)是長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，LncRNA具有調(diào)控基因間相互作用，并在腫瘤致病過(guò)程中扮演重要角色[3]?；蜷gLncRNA-重編碼調(diào)控因子 [regulator of reprogramming（ROR），LncROR]是由Loewer首先在胚胎干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，其主要參與細(xì)胞重編程過(guò)程[4]。近期研究表明，LncROR在多種腫瘤組織及細(xì)胞中異常表達(dá)[5]，但對(duì)于LncROR在鼻咽癌中的研究，國(guó)內(nèi)外少見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)在組織和細(xì)胞水平檢測(cè)LncROR在鼻咽癌中的表達(dá)，及對(duì)細(xì)胞增殖、抗凋亡和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，旨在為鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展及研究新的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

資料與方法

1 臨床樣本收集

收集2016年6月～2017年6月上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院及長(zhǎng)海醫(yī)院經(jīng)病理確診的初治鼻咽癌患者及慢性鼻咽炎患者的病例標(biāo)本各15例，所有鼻咽癌病理診斷均為未分化非角化型癌（WHO分型），臨床分期Ⅱ期2例，Ⅲ期8例，Ⅳ期5例（UICC頭頸腫瘤臨床分期第六版，2002年），腫瘤及鼻咽炎組織標(biāo)本獲取后經(jīng)液氮凍存。所有患者術(shù)前均未行放療、化療及其他輔助治療，最終診斷由常規(guī)病理檢查確診。該研究通過(guò)公利醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn),并獲得患者及家屬的知情同意。

2 細(xì)胞培養(yǎng)

人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2,HNE1,HONE-1,SUNE-1及人鼻咽部上皮細(xì)胞株NP69，均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞均按細(xì)胞培養(yǎng)說(shuō)明使用RPMI-1640培養(yǎng)基（Hyclone,SH30809.01）添加10%胎牛血清(biowest,S1820-500)、1%濃度 100U/ml青霉素和 100μg/ml鏈霉素進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)于37℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

使用總RNA提取試劑盒（中國(guó)上海飛捷生物公司，220010）提取細(xì)胞和組織總RNA。使用Rever Tra Ace qPCR-RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Toyobo生物有限公司，QPK-212T）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。按照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（日本Toyobo生物有限公司，PCR311）使用說(shuō)明進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。qRT-PCR及數(shù)據(jù)采集均使用ABI PRISM 7900HT序列檢測(cè)系統(tǒng) (美國(guó)Applied Biosystems公司)，GAPDH作為內(nèi)參。

4 LncROR沉默穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株及對(duì)照組細(xì)胞株構(gòu)建

鼻咽癌細(xì)胞CNE-2種于6孔板中，置于37℃，5%CO2分壓的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，生長(zhǎng)24小時(shí)后，將合成的siRNA-ROR基因沉默轉(zhuǎn)染序列用siRNA-Mate轉(zhuǎn)染（上海吉瑪生物公司，G04001），48小時(shí)后換液，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

5 CCK-8法檢測(cè)CNE-2細(xì)胞增殖情況

細(xì)胞按30%～50%的濃度比例鋪于96孔板，24小時(shí)待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染結(jié)束后,用PBS清洗3次。每孔加入CCK8試劑（日本同仁化學(xué),CK04），在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3小時(shí)，分別在 0、12、24、48、72 小時(shí)時(shí)間點(diǎn)用酶標(biāo)儀檢測(cè)，吸光度值為450nm波長(zhǎng)，繪制細(xì)胞增殖曲線(xiàn)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

6 Western blot法檢測(cè)蛋白

細(xì)胞蛋白提取后，BCA法測(cè)蛋白濃度（江蘇碧云天生物公司，P0010S）。配10%分離膠進(jìn)行電泳(江蘇碧云天生物公司，P0012A)，轉(zhuǎn)膜后孵育一抗（1：1000稀釋?zhuān)?℃過(guò)夜，用TBST清洗3次后，二抗（1：2000稀釋?zhuān)┦覝胤跤?小時(shí)，用TBST清洗3次后。用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目的條帶灰度值，完成統(tǒng)計(jì) 分 析 。 抗 體 ：Activated caspase-3（9661），Total caspase-3(9662)，Activated caspase-9（9505），Total caspase-9 (9502)，E-cadherin (14472)，β -catenin(8480)，N-cadherin(13116)，Vimentin(5741)，GADPH（5174）均購(gòu)自于Cell Signaling公司。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果

1 LncROR在鼻咽癌組織及鼻咽癌細(xì)胞株中表達(dá)升高

用實(shí)時(shí)定量熒光PCR法檢測(cè)臨床樣本中LncROR的表達(dá)水平。鼻咽癌患者瘤體組織LncROR表達(dá)水平明顯高于慢性鼻咽炎組織，(P＜0.05,圖1)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證LncROR在鼻咽癌中的表達(dá)情況,我們選擇在1種正常鼻咽部上皮細(xì)胞株NP69及4種鼻咽癌細(xì)胞株中 (CNE-2,HNE1,HONE-1,SUNE-1)進(jìn)行LncROR表達(dá)水平檢測(cè)。鼻咽癌細(xì)胞株中LncROR的表達(dá)水平均高于鼻咽部上皮組織細(xì)胞NP69（P＜0.05,圖2）。上述4種鼻咽癌細(xì)胞株中,LncROR在CNE-2中表達(dá)量最高。所以，我們選擇CNE-2細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)體外實(shí)驗(yàn)研究。

圖1 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)LncRNA-ROR在鼻咽癌組織和鼻咽炎黏膜組織相對(duì)表達(dá)量。樣本間數(shù)據(jù)分析采用配對(duì)t檢驗(yàn)（n=15，*:P＜0.05）。

圖2 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)鼻咽部上皮細(xì)胞株NP69和鼻咽癌細(xì)胞株 (CNE-2,HNE1,HONE-1,SUNE-1)中LncRNA-ROR相對(duì)表達(dá)量。數(shù)據(jù)分析采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，每組樣本平均重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。與Mock組相比，*表示P＜0.05。

2 體外研究LncROR對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖能力及凋亡相關(guān)蛋白的影響

用基因沉默方法抑制LncROR在CNE-2細(xì)胞中的表達(dá)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，提取細(xì)胞總RNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染成功（P＜0.05，圖3）

圖3 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，經(jīng)RNA干擾后，鼻咽癌細(xì)胞株CNE2中LncROR表達(dá)含量。Mock組：空載轉(zhuǎn)染對(duì)照組；sh-ROR:LncROR基因抑制組數(shù)據(jù)分析采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，每組樣本平均重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。與Mock組相比，*表示P＜0.05。

經(jīng)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)證實(shí)，抑制LncROR表達(dá)后，與轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比,細(xì)胞增殖能力明顯減弱（P＜0.05，圖 4）。用Western blot方法檢測(cè)，LncROR 對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化 (活化caspase-3、caspase-3總蛋白、活化caspase-9蛋白、caspase-9總蛋白)。結(jié)果顯示，抑制LncROR后，活化的caspase-3、caspase-9蛋白表達(dá)升高，但總蛋白的水平?jīng)]有明顯變化（P＜0.05，圖5）。上述結(jié)果顯示，LncROR表達(dá)下降可以減弱CNE-2細(xì)胞增殖能力,增加凋亡能力。

圖4 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LncRNA-ROR表達(dá)沉默后細(xì)胞增殖能力改變。Mock組：空載轉(zhuǎn)染對(duì)照組；sh-ROR:LncROR基因抑制組數(shù)據(jù)分析采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，每組樣本平均重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。與對(duì)照組相比，*表示P＜0.05。

圖5 Western blot方法檢測(cè)，LncROR表達(dá)沉默后對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)影響。Mock組：空載轉(zhuǎn)染對(duì)照組；sh-ROR:LncROR基因抑制組。左側(cè)：Western印跡法檢測(cè)條帶圖，右側(cè)：統(tǒng)計(jì)圖。數(shù)據(jù)分析采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，每組樣本平均重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。與Mock組相比，*表示 P＜0.05,

3 LncROR促進(jìn)CNE-2細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

用Western blot檢測(cè)，在CNE-2細(xì)胞中抑制LncROR后，對(duì)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，抑制LncROR后，可以導(dǎo)致上皮標(biāo)志蛋白（E-鈣粘蛋白、β-連環(huán)蛋白）表達(dá)升高，間質(zhì)標(biāo)志蛋白（N-鈣粘蛋白、波形蛋白）表達(dá)下降(P＜0.05，圖6)。

圖6 Western blot方法檢測(cè)，LncROR表達(dá)沉默對(duì)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)影響.Mock組：空載轉(zhuǎn)染對(duì)照組；sh-ROR:LncROR基因抑制組。E-cadherin:E-鈣粘蛋白；β-catenin：β-連環(huán)蛋白；N-cadherin:N-鈣粘蛋白；Vimentin:波形蛋白；GADPH為內(nèi)參。左側(cè)：Western印跡法檢測(cè)條帶圖，右側(cè)：統(tǒng)計(jì)圖。數(shù)據(jù)分析采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，每組樣本平均重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。與Mock組相比，*表示P＜0.05,

討論

鼻咽癌中主要以低分化鱗癌為主，因其病變部位隱匿，早期不易被發(fā)現(xiàn)。故臨床就診患者約60%已出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，20%因顱神經(jīng)受累而就診，明顯影響患者預(yù)后[1]。隨著腫瘤學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化在腫瘤中所發(fā)揮的作用越來(lái)越受到關(guān)注。因此，研究鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，尋找早期的診斷指標(biāo)，對(duì)改善鼻咽癌預(yù)后有十分重要的意義。

LncRNA存在于細(xì)胞核和胞漿中，可在表觀(guān)遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等多個(gè)層面參與基因調(diào)控[6]。近期研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA在調(diào)節(jié)腫瘤增殖、凋亡以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中起重要作用。Richards等[7]研究發(fā)現(xiàn)LncRNA-HIT有促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移的作用，在下調(diào)LncRNA-HIT的表達(dá)后，上皮標(biāo)志蛋白E-鈣粘蛋白表達(dá)上調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志蛋白波形蛋白表達(dá)下降。Ying等[8]在發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的膀胱癌組織中研究發(fā)現(xiàn)有LncRNA-MALAT-1高表達(dá)，下調(diào)MALAT-1表達(dá)后，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化調(diào)控因子ZEB1、ZEB2和Slug的表達(dá)下降，E-鈣粘蛋白表達(dá)明顯增高，其機(jī)調(diào)節(jié)制可能是通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促發(fā)了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。Liang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA-H19在間質(zhì)樣腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織中高表達(dá)，LncRNA-H19可競(jìng)爭(zhēng)性拮抗miR-138和miR-200A的功能，使波形蛋白、ZEB1和ZEB2表達(dá)上升，進(jìn)而導(dǎo)致上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。

LncROR是近期被證實(shí)的胚胎源性干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）的重要調(diào)控因子，可維持ESCs及腫瘤干細(xì)胞的存活[4]。目前研究發(fā)現(xiàn)，LncROR在腫瘤的增殖及抗凋亡中同樣發(fā)揮重要作用。近期研究表明，LncROR在多種腫瘤組織及細(xì)胞中異常表達(dá)，如肝癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤等，且已證明其與腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)。Hou等[10]的研究表明LncROR在乳腺癌中的表達(dá)水平高于周?chē)＝M織，并通過(guò)促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，提高乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲能力，類(lèi)似的研究在肝癌和膠質(zhì)瘤中也得到證實(shí)[11，12]。不可否認(rèn)，LncROR在調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、抗調(diào)亡及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用已在多種腫瘤中得到證實(shí)，但LncROR在鼻咽癌增殖、轉(zhuǎn)移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用尚無(wú)研究報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)鼻咽癌組織及慢性鼻咽炎組織中LncROR的表達(dá)情況，結(jié)果顯示在鼻咽癌組織中LncROR的表達(dá)明顯高于慢性鼻咽炎組織。初步表明LncROR的表達(dá)可能與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展有一定的相關(guān)性。隨后，我們?cè)?CNE-2、HNE1、HONE-1、SUNE-1 四種鼻咽癌細(xì)胞株中用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)LncROR的表達(dá)，結(jié)果顯示：在CNE2中LncROR高于其他三種鼻咽癌細(xì)胞株，所以我們選擇CNE2作為后續(xù)LncROR的作用機(jī)制研究對(duì)象。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤發(fā)生增殖轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵機(jī)制之一。LncROR已被證明在多種腫瘤細(xì)胞增殖和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中具有重要作用[13-15]，其中E-鈣粘蛋白和波形蛋白可作為腫瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中最可靠的標(biāo)志蛋白[16，17]。Hou 等[10]研究發(fā)現(xiàn)：LncROR在乳腺癌組織和乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)均有增高；并通過(guò)Western blot和免疫熒光法檢測(cè)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志蛋白，發(fā)現(xiàn)調(diào)控LncROR表達(dá)水平后，E-鈣粘蛋白(E-cadherin)和閉合蛋白(occludin)等上皮標(biāo)志蛋白表達(dá)降低，而波形蛋白(vimentin)和N-鈣粘蛋白(N-cadherin)等間質(zhì)標(biāo)志蛋白的表達(dá)增高；而且shRNA干擾LncROR后，波形蛋白和N-鈣粘蛋白的表達(dá)降低，說(shuō)明LncROR可以通過(guò)調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化促使乳腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果證明，在抑制LncROR表達(dá)后，與對(duì)照組相比，CNE-2增殖能力明顯減弱。而且我們用Western blot方法檢測(cè)LncROR對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化，結(jié)果顯示，抑制LncROR后，活化的caspase-3、caspase-9表達(dá)升高，上述結(jié)果表明，LncROR表達(dá)下降可以減弱CNE-2細(xì)胞增殖和抗凋亡能力。隨后，我們還用Western blot方法檢測(cè)了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志蛋白的水平改變，結(jié)果顯示在LncROR表達(dá)抑制后，上皮標(biāo)志蛋白E-鈣粘蛋白、β-連環(huán)蛋白表達(dá)升高，間質(zhì)標(biāo)志蛋白N-鈣粘蛋白、波形蛋白表達(dá)下降。結(jié)果證明，LncROR可促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生增殖、抗凋亡及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

綜上所述，LncROR在鼻咽癌組織中高表達(dá)，并可以促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生增殖、抗凋亡及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。隨著基因組學(xué)研究水平的不斷提高，人們對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的認(rèn)識(shí)也在持續(xù)提升，一些諸如LncROR等具有重要功能的LncRNA逐漸被發(fā)現(xiàn)[18-20]。隨著該領(lǐng)域研究的不斷深入，LncROR的研究有望從基礎(chǔ)走向臨床，成為鼻咽癌新的診斷指標(biāo)及治療靶點(diǎn)。