小型豬不停跳冠脈旁路移植模型建立初探

王 鑫 黃墨林 張 銳 偉 俊 鄭遠(yuǎn)彪 葛建軍

冠狀動脈旁路移植術(shù)（CABG）作為冠狀動脈粥樣硬化型心臟病（CHD）治療的主要方法，由于取材的限制，通常選用大隱靜脈作為橋血管的主要血管，因此使得內(nèi)膜增生成為了靜脈移植后通暢的主要障礙，雖然血管平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖樞轉(zhuǎn)會影響血管重塑過程，但尚未有系統(tǒng)預(yù)防靜脈移植物內(nèi)膜增生的治療方法[1]?？v觀當(dāng)前國內(nèi)外研究，多通過建立大鼠[2]、家兔[3]、狗[4]的頸靜脈移植模型及小型豬的大隱靜脈-頸內(nèi)動脈模型[5～6]來尋找靜脈移植物內(nèi)膜增生的系統(tǒng)療法，缺乏對完全模擬人類心臟不停跳冠脈搭橋手術(shù)動物模型構(gòu)建的研究。眾所周知，臨床實踐中，冠脈較頸動脈的分支更多，血流情況相對更復(fù)雜，冠脈旁路移植手術(shù)的難度也更大，單純的頸靜脈移植物內(nèi)膜增生情況缺乏一定的代表性，因此，有針對性的模擬人類不停跳冠脈搭橋手術(shù)建立動物模型是十分有必要的。通過文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，豬的冠脈解剖更接近于人[7]。故本文創(chuàng)新性的選擇小型巴馬豬建立不停跳冠脈旁路移植模型，結(jié)合實踐過程理清實驗的思路、方法、遇到的問題及解決辦法，總結(jié)經(jīng)驗，完成構(gòu)建小型巴馬豬建立不停跳冠脈旁路移植模型的初探，為建立成熟穩(wěn)定的小型豬冠脈搭橋模型奠定理論及實踐基礎(chǔ)。同時也對CABG術(shù)后橋血管的再狹窄的研究及年輕臨床醫(yī)生練習(xí)不停跳冠狀動脈旁路移植術(shù)產(chǎn)生一定的指導(dǎo)意義。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)后，采用簡單隨機抽樣法從泰州小型豬生產(chǎn)基地選取30頭健康小型巴馬豬，雌雄不分，體重35～40 kg，術(shù)前正常喂養(yǎng)1周。

1.2 實驗器械及藥品 器械主要包含動物呼吸機1臺，心電監(jiān)護(hù)儀1臺，電刀1臺，負(fù)壓吸引器1臺，除顫儀1臺，搭橋器械1套，組織剪、組織鑷、止血鉗、蚊氏鉗若干，6/0及7/0 prolene線，普通絲線，氣管插管、心表固定器，吹管等。藥品主要包含舒泰（替來拉明+唑拉西泮）、鹽酸賽拉嗪等。

1.3 實驗過程

1.3.1 實驗前準(zhǔn)備 正常喂養(yǎng)1周，術(shù)前禁食12 h，禁水4 h，稱重，準(zhǔn)備手術(shù)臺，準(zhǔn)備多巴胺、利多卡因、阿托品等搶救藥品。

1.3.2 麻醉 給予舒泰2.5 mg/kg，鹽酸賽拉嗪2 mg/kg進(jìn)行肌注麻醉。麻醉后給予手術(shù)區(qū)域備皮，固定后于耳緣靜脈建立靜脈通道，氣管插管并連接呼吸機，參數(shù)：吸入氧濃度（FiO2）60%，通氣頻率（f）20次/分，潮氣量8～10 mL/kg。并于后腿第二關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)切開行股動脈穿刺，檢測動脈血壓及血氧飽和度。

1.3.3 手術(shù)過程 ①手術(shù)區(qū)域消毒后于后腿關(guān)節(jié)外側(cè)切開，采用“NO-TOUCH”技術(shù)分離大隱靜脈，用0號或1號線結(jié)扎分支，離取約8～10 cm血管，用肝素水沖洗管腔后備用。②胸骨正中切開，分離組織后用胸骨劈刀劈開胸骨，分離組織并暴露心臟及主動脈，靜推2 mg/kg肝素，于主動脈上選取合適位置縫合主動脈-大隱靜脈，待心率血壓穩(wěn)定后，分離前降支，于合適位置縫合大隱靜脈-前降支。止血，關(guān)胸，鋼絲固定胸骨，縫皮。

1.3.4 術(shù)中管理 術(shù)中每小時追加一次舒泰（劑量為初始劑量的1/3）及肝素（劑量為初始劑量的1/2），持續(xù)泵入丙泊酚6～8 mL/h維持麻醉；同時加以青霉素10萬單位/公斤靜滴預(yù)防感染，500 mL生理鹽水加入1 g氯化鉀及1.25 g硫酸鎂補充液體和電解質(zhì)。

1.3.5 術(shù)后管理 術(shù)后單籠喂養(yǎng)觀察，持續(xù)靜脈補液，每天分兩次靜脈給予青霉素（10萬單位/公斤），待3天后恢復(fù)自主進(jìn)食，精神良好后可返回普通飼養(yǎng)籠。

1.3.6 靜脈獲取 術(shù)后4周麻醉，開胸（操作同前），分離黏連組織后取出橋血管，觀察通暢情況。實驗豬可通過心房注射KCL處死。

2 研究結(jié)果

本實驗共選取30頭巴馬小型豬進(jìn)行手術(shù)，因技術(shù)操作失誤、術(shù)前準(zhǔn)備不當(dāng)、溫度失衡等原因死亡8頭，失敗2頭（見表1），成功20頭。實驗后期，經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，術(shù)中實驗豬血壓心率穩(wěn)定，橋血管充盈，血流豐富（見圖1），4周后取出大隱靜脈橋血管，肉眼可見橋血管通暢，血管與周圍組織黏連（見圖2、圖3），HE染色光鏡下見橋血管內(nèi)膜中膜有明顯增厚，細(xì)胞排列不規(guī)則（見圖4）。

表1 實現(xiàn)過程中不良事件及出現(xiàn)原因剖析

3 討 論

3.1 實驗動物的選取 通過文獻(xiàn)研究及實驗發(fā)現(xiàn)，豬類冠狀動脈與人類冠狀動脈的相似度較高。同時飼養(yǎng)簡單，抗感染能力強，較為適宜進(jìn)行動物實驗研究。本實驗在研究初期，曾選擇普通肉用豬作為實驗用豬，在實驗使用3頭豬后，發(fā)現(xiàn)普通肉用豬生長速度較快，短期內(nèi)體重變化較大，不易控制且個體差異較大，遺傳因素不穩(wěn)定，術(shù)中耐受程度較低，麻醉和血管吻合過程中易發(fā)生窒息和室顫，考慮到此些因素易使研究結(jié)果產(chǎn)生偏倚，經(jīng)實驗總結(jié)、專題小組討論、文獻(xiàn)資料研究后我們更換實驗用豬為巴馬小型豬，更換實驗動物后我們發(fā)現(xiàn)，實驗情況得到了很大程度的改善。巴馬小型豬為何更適宜作為實驗用豬，通過實驗總結(jié)我們發(fā)現(xiàn)，其具備以下幾點優(yōu)勢：①巴馬小型豬遺傳因素穩(wěn)定，一致性較好，其在我國作為實驗用豬，已近親培育20余年，廣西巴馬小型豬在21個微衛(wèi)星位點的平均基因純合率為55.5%，表明其近交程度高，平均PIC和平均雜合程度均較低，實驗研究時組間差異較小，非常適合作為實驗用豬。②巴馬小型豬的生長速度較慢，成年豬體重為35～40 kg，短期內(nèi)體重不會發(fā)生較大變化[8]，能夠保證實驗過程樣本的穩(wěn)定性，利于實驗的持續(xù)監(jiān)測。③巴馬小型豬的耐受程度高，術(shù)中對缺血缺氧的耐受程度明顯高于普通肉用豬，利于實驗的開展。④巴馬小型豬生理生化指標(biāo)相較于普通家豬和人類更為近似，其共有14項血液生理指標(biāo)及18項血液生化指標(biāo)和人類相似，更適合作為心血管系統(tǒng)研究的實驗用豬[9]。但值得注意的是，小型巴馬豬的生理結(jié)構(gòu)和人不同，大隱靜脈位于后腿外側(cè)，因此可從一側(cè)后腿第二關(guān)節(jié)取至根部，長度達(dá)10～15 cm即可。

3.2 實驗難點及解決策略 巴馬小型豬豬皮較厚，后肢粗短，股動脈較難觸及，這就造成了我們在實驗過程中遇到穿刺困難的難題，這很不利于我們在搭橋手術(shù)中對巴馬小型豬的動脈血壓進(jìn)行持續(xù)動態(tài)監(jiān)測，如果該問題得不到解決也將嚴(yán)重阻礙實驗的進(jìn)行。在多次嘗試后，我們采取切開穿刺方法，后用帶線縫合針固定，取得了較好效果，使得實驗得以順利開展。在器械的選擇上，由于豬喉和豬口腔的特殊解剖關(guān)系，無豬類專用器械可用，實驗初期插管較為困難，后經(jīng)總結(jié)經(jīng)驗及多次練習(xí)后，我們應(yīng)用成人大號彎喉鏡沿嘴角進(jìn)入，縮短距離，并以止血鉗牽舌，協(xié)助暴露，但由于巴馬豬的耳緣靜脈較細(xì)，如果靜脈留置針18G、20G、22G（國際型號）過粗則植入較為困難，靜脈留置針26G（國際型號）過細(xì)則容易堵塞，均達(dá)不到補液要求，經(jīng)換用不同型號的留置針后，最后發(fā)現(xiàn)24G（0.7 mm×19 mm，國際型號）型號留置針最為合適。如術(shù)中失血較多，可雙側(cè)耳緣靜脈建立靜脈通道，多通道同時補液。

與人類相比，巴馬小型豬血液易凝，黏滯度較高，部分凝血活酶時間（APTT）為23.73 s（人類為30～45 s）,凝結(jié)酶凝結(jié)時間（TT）為13.66 s（人類為16～18 s）[10]，所以當(dāng)動脈穿刺成功后應(yīng)立即予以肝素水沖洗。同理，在開胸后立即予以肝素2.0～2.5 mg/kg靜推，測ACT約300 s左右，并每隔1 h給予肝素，劑量為首次劑量的一半，以防止術(shù)中出現(xiàn)血栓，誘發(fā)心梗而除顫成功率較低的情況；小型巴馬豬相較于人類具有更短的左冠狀動脈和側(cè)支，即使是回旋支動脈也無法到達(dá)后室間溝[11]，至少90%的室間靜脈流出物源自左前降支冠狀動脈灌注的心肌的血液[12]。所以在吻合前降支時，如果缺血時間過長，很容易誘發(fā)心梗及室性心律失常，故吻合時如果發(fā)生心率大于160次/分或小于60次/分、血壓波動明顯、氧飽和度下降等情況，應(yīng)立即靜脈給予利多卡因（1～2 mg/kg），同時取利多卡因少量于心臟表面浸潤，預(yù)防室顫發(fā)生。選擇吻合口應(yīng)盡量選擇前降支末端，減少吻合時的缺血范圍。若發(fā)生室顫，應(yīng)立即給予5～10焦耳心表電除顫。

3.3 實驗過程的糾偏 實驗初期，我們僅對實驗豬進(jìn)行冠狀動脈旁路移植術(shù)，對原正常冠脈不作處理，4周后取出橋血管，血管閉塞，內(nèi)皮增生嚴(yán)重，血管狹窄，無血流通過（見圖5），考慮如此短時間內(nèi)導(dǎo)致的血管閉塞，可能是由于原冠狀動脈無病變，導(dǎo)致橋血管血流不足引起的橋血管閉塞[7]。后我們采取絲線7號線完全結(jié)扎原冠脈，模擬冠心病冠脈情況，人工造成狹窄以增加橋血管血流量，4周后取出橋血管，發(fā)現(xiàn)情況得到明顯改善，血管內(nèi)膜增生情況較前有明顯減輕（見圖6），血流通暢，心臟跳動情況正常。但在橋血管建立后，結(jié)扎原冠脈時，心臟易發(fā)生心梗、室顫及室性心率失常，應(yīng)特別注意?？赡苁怯捎谌毖^程過快，心臟無法代償所致。故可緩慢結(jié)扎前降支，增加心臟適應(yīng)過程。

3.4 混雜因素的消除 心電圖示波的時候，豬毛會阻礙電極片與皮膚的接觸，影響示波，即使刮去豬毛，豬皮上的小絨毛也會使電極片接觸不穩(wěn)定，手術(shù)時間較長的情況下依舊容易脫落，因此后來我們采取電極片和縫合針直接連接，并將縫合針直接縫在四肢上，更加簡單、有效。

巴馬小型豬因術(shù)中失血、大量補充液體、開胸暴露心臟等原因使得心臟溫度下降過快，冬季情況更為明顯。如果因此導(dǎo)致室顫發(fā)生，在沒有復(fù)溫、保溫設(shè)備的情況下，則復(fù)跳困難。故我們采取提高室內(nèi)溫度（25 ℃左右）、無菌鋪單下鋪設(shè)電熱毯、術(shù)中補充加溫液體等措施，取得了較好效果。部分實驗巴馬豬由于術(shù)后疼痛會出現(xiàn)煩躁、不進(jìn)食、剮蹭靜脈留置針和引流管等情況，如不及時處理，將導(dǎo)致術(shù)后無法補液、補充能量和使用抗生素，進(jìn)而致使實驗動物死亡。我們采取舒芬太尼5～10 μg加入500 mL生理鹽水中靜滴，青霉素5萬單位/公斤，1日兩次，在未進(jìn)食情況下，每日需補液2000 mL/天。如煩躁情況較嚴(yán)重，可換至小籠（不影響呼吸）制動，固定四肢，可有效防止靜脈留置針及引流管的脫落，還可減少傷口的撕裂和感染。待情況穩(wěn)定，開始進(jìn)食（一般2～3天）后換至普通籠中飼養(yǎng)。

4 研究展望

實驗初期手術(shù)操作及實驗人員之間的配合不夠熟練，導(dǎo)致吻合遠(yuǎn)端血管的時間過長，增大了實驗難度，同時由于初期探索階段對混雜因素把握的不夠全面，導(dǎo)致了部分實驗巴馬豬的死亡。除去這些導(dǎo)致巴馬豬死亡原因，我們發(fā)現(xiàn)小型豬的不停跳旁路移植模型的建立是可行的。故在后期，我們在積累經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，亟需通過本文總結(jié)的經(jīng)驗加以優(yōu)化，嚴(yán)格控制混雜因素，選取擁有較多的臨床經(jīng)驗的實驗人員，逐步減少術(shù)后不良事件的發(fā)生，增加該實驗的穩(wěn)定性。