非小細(xì)胞肺癌組織中NF-κB和CyclinD1及p27表達(dá)與患者化療敏感性*＊

黃 虎，栗 娜，楊 柳，王志剛＊＊，李自健，姚 杰，李鳴芳，詹姍姍

(1.中國(guó)人民解放軍第161醫(yī)院腫瘤科，湖北 武漢 430010;2.武漢市衛(wèi)生計(jì)生執(zhí)法督察總隊(duì)，湖北 武漢 430010;3.湖北省腫瘤醫(yī)院腫瘤科，湖北武漢 430079)

肺癌是預(yù)后較差的一種常見(jiàn)惡性腫瘤，非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌中最為常見(jiàn)的一種，化療是治療NSCLC的主要措施之一，但許多患者化療效果并不理想，腫瘤細(xì)胞耐藥是導(dǎo)致化療失敗的最主要原因，如何克服化療耐藥，提供個(gè)體化的治療方案是臨床亟待解決的問(wèn)題［1－2］。有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)檢測(cè)各種耐藥因子及預(yù)后因子，能給患者提供有效的個(gè)體化化療方案，提高患者生存期［3］。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)［4］、細(xì)胞周 期 素 D1(CyclinD1)［5－8］和 p27［9－11］是 與NSCLC的化療敏感性有關(guān)的預(yù)后因子，也可能是NSCLC 治療的新靶點(diǎn)［12－14］。本研究通過(guò)檢測(cè)NSCLC組織中 NF-κB、CyclinD1及 p27表達(dá)，分析其與鉑類(lèi)為基礎(chǔ)的化療方案療效及患者預(yù)后的關(guān)系，為NSCLC患者的個(gè)體化化療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料、組織標(biāo)本與試劑

1.1.1 臨床資料 2007年5月～2015年5月收治的進(jìn)展期NSCLC患者84例，男50例、女性34例，35～74歲、中位年齡54歲，其中鱗癌39例、腺癌40例、大細(xì)胞癌5例，按國(guó)際抗癌聯(lián)盟UICC推薦的分期標(biāo)準(zhǔn)Ⅲ期50例、Ⅳ期34例。治療前均行卡氏(Karnofsky，KPS)評(píng)分，所有患者KPS評(píng)分≥70分;既往未行化療，有可測(cè)量或可評(píng)價(jià)的病灶。

1.1.2 組織標(biāo)本與試劑 所有病例樣本均經(jīng)過(guò)病理診斷，在化療前采集組織標(biāo)本，標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋保存;鼠抗人單克隆抗體NF-κBp65(工作濃度為1∶200)、鼠抗人單克隆抗體CyclinD1(工作濃度為1∶100)均購(gòu)自santa cruz公司，鼠抗人單克隆抗體p27工作液、SP試劑盒和DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中山金橋生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色 所有組織標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片厚度為4μm，全部切片經(jīng)微波修復(fù)抗原，操作步驟按照SP試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，具體為抗原修復(fù)后分別加入相應(yīng)一抗和二抗孵育，然后滴加新鮮配制的DAB顯色液，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間(2～10 min)，清水充分沖洗;最后用蘇木素輕度復(fù)染(1 min 40 s)，清水充分沖洗10 min;經(jīng)不同梯度酒精依次脫水，二甲苯透明，干燥后中性樹(shù)脂封片在顯微鏡下觀察結(jié)果。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，各視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，計(jì)數(shù)染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，NF-κB p65染色細(xì)胞漿呈棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞，CyclinD1染色胞漿或胞核呈棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜50%定為低表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞50%為高表達(dá);p27染色細(xì)胞核呈棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%定為低表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞10%為高表達(dá)。

1.2.2 化療方法及效果 化療采用NSCLC一線化療方案，所有患者均接受＞2個(gè)周期的化療，對(duì)可測(cè)量病灶采用實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(response evaluation criteria in solid tumors，RECIST)評(píng)價(jià)療效，觀察患者生存期，末次隨訪患者仍存活則定為截尾值。根據(jù)實(shí)體瘤的療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)將化療效果分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、穩(wěn)定(SD)及疾病進(jìn)展(PD)，總有效率為RR=CR+PR，化療結(jié)果有效者1個(gè)月后檢查確認(rèn);總生存期(OS)為從治療開(kāi)始到患者死亡或失訪時(shí)間，無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)為從治療開(kāi)始到疾病進(jìn)展的時(shí)間，以月為單位計(jì)算。

1.3 觀察指標(biāo)

記錄 NSCLC組織中 NF-κB、CyclinD1及 p27的陽(yáng)性表達(dá)率，采用Spearman法分析 NF-κB、CyclinD1和p27表達(dá)水平的相關(guān)性，比較不同NF-κB、CyclinD1和p27表達(dá)水平的NSCLC患者的近期和遠(yuǎn)期療效;分析不同 NF-κB、CyclinD1及 p27表達(dá)水平的NSCLC患者中位OS及中位PFS，COX回歸分析年齡、性別、分期、病理類(lèi)型、NF-κB表達(dá)、CyclinD1表達(dá)及p27表達(dá)中影響NSCLC預(yù)后的因素。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，計(jì)數(shù)資料用率(%)表示，數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗(yàn)，不同NF-κB、CyclinD1及p27表達(dá)水平的NSCLC患者中位OS及中位PFS比較運(yùn)用Kaplan-Meier生存分析法，分析采用Spearman相關(guān)分析，影響NSCLC預(yù)后的因素分析采用COX回歸分析，以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)結(jié)果

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，NSCLC組織中NF-κB表達(dá)率為88.1%(74/84)，CyclinD1的表達(dá)率為71.4%(60/84)，p27的表達(dá)率為32.1%(21/84)，見(jiàn)圖 1。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，NF-κB與CyclinD1的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.256，P=0.019)，CyclinD1與 p27的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=－0.730，P=0.000)，NF-κB 與 p27 無(wú)相關(guān)關(guān)系(r= －0.212，P=0.053)。

圖1 NF-κB、CyclinD1及p27在NSCLC組織中表達(dá)(IHC，×400)Fig.1 The high expression of NF-κB，cyclin D1 and p27 in NSCLC

2.2 不同 NF-κB、CyclinD1及 p27表達(dá)水平NSCLC患者的化療效果

所有患者均完成治療，均可評(píng)價(jià)療效。結(jié)果顯示，NF-κB、CyclinD1高表達(dá)患者的總有效率 (CR+PR)顯著低于低表達(dá)的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.95、5.11，P＜0.01);p27 高表達(dá)患者的總有效率(CR+PR)顯著高于低表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.99，P＜0.01);見(jiàn)表1。

表1 不同NF-κB、CyclinD1及p27表達(dá)水平NSCLC患者的化療效果(n，%)Tab.1 Chemotherapeutic effects of NSCLC patients with different NF-κB，CyclinD1 and p27 expression levels

2.3 遠(yuǎn)期生存

84例患者中，82例(97.6%)死亡，中位OS為13.6個(gè)月，中位 PFS為 4.1個(gè)月。NF-κB、CyclinD1及p27不同表達(dá)水平患者的中位OS和中位PFS比較結(jié)果顯示，NF-κB、CyclinD1高表達(dá)患者的中位OS及中位PFS顯著低于低表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);p27高表達(dá)患者的中位OS及中位PFS顯著高于低表達(dá)的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);見(jiàn)表2。

表2 NF-κB、CyclinD1及 p27不同表達(dá)水平NSCLC患者的生存期(月)Tab.2 Survival time of patients with different expression levels of NF-κB，CyclinD1 and p27

2.4 影響NSCLC預(yù)后的因素

將年齡、性別、分期、病理類(lèi)型、NF-κB表達(dá)、CyclinD1表達(dá)及p27表達(dá)逐個(gè)納入COX回歸模型進(jìn)行單因素分析，結(jié)果顯示，NF-κB、CyclinD1和p27表達(dá)水平是NSCLC預(yù)后的影響因素，而年齡、性別、分期、病理類(lèi)型與預(yù)后無(wú)相關(guān)性。見(jiàn)表3。

表3 NSCLC患者生存期單因素COX回歸分析Tab.3 Univariate COX regression analysis of survival time in patients with NSCLC

3 討論

細(xì)胞周期調(diào)控出現(xiàn)異常在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。許多細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)分子不但參與了腫瘤的增殖、侵襲以及轉(zhuǎn)移，還與腫瘤細(xì)胞化療耐藥有關(guān)［1］。腫瘤細(xì)胞的耐藥性與多種基因的表達(dá)異常有著密切的關(guān)系［3］，在肺癌治療研究中，細(xì)胞周期調(diào)控因子已成為判斷肺癌化療敏感性和預(yù)后的重要指標(biāo)。

NF-κB是一種核轉(zhuǎn)錄因子，與抑制蛋白IκB組成無(wú)活性的 NF-κB/IκB三聚體形式，在相關(guān)因素刺激下IκB磷酸化后降解，NF-κB被激活，其活化物NF-κBp65可調(diào)控多種基因的表達(dá)。NF-κB在調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用，與腫瘤發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，其調(diào)控的靶基因參與了腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、血管生成和抗凋亡等多個(gè)過(guò)程［2－3］。NSCLC的化療可引起NF-κB活化，并因此誘導(dǎo)腫瘤抗凋亡或其他的機(jī)制從而逃避藥物殺傷作用，引起了腫瘤細(xì)胞的耐藥，NF-κB高表達(dá)的NSCLC對(duì)化療敏感性差［4］。本研究的結(jié)果提示接受化療的進(jìn)展期NSCLC患者中，NF-κB低表達(dá)者可獲得更高的化療療效(90%)、更長(zhǎng)的OS(20.9月)和PFS(10.2月)，與NF-κB高表達(dá)者比較P＜0.01，這表明NF-κB與NSCLC化療耐藥有關(guān)，也是NSCLC預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)。CyclinD1在細(xì)胞周期中促進(jìn)G1期向S期轉(zhuǎn)換，多種癌基因可誘導(dǎo)CyclinD1的過(guò)表達(dá)，CyclinD1的過(guò)表達(dá)可使細(xì)胞持續(xù)增殖，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生［5］。CyclinD1還與NSCLC的化療敏感性有關(guān)，并且是 NSCLC 的預(yù)后因子之一［6－8］。在其他腫瘤組織中，CyclinD1的表達(dá)水平和化療效果也有相關(guān)性，CyclinD1陰性的患者化療有效率明顯高于陽(yáng)性者［9－10］。本研究結(jié)果顯示，CyclinD1 的表達(dá)與化療療效有關(guān)，CyclinD1低表達(dá)者可獲得更高的化療療效、更長(zhǎng)的OS及PFS，與 CyclinD1高表達(dá)者比較P＜0.01。提示在化療前對(duì)肺癌組織進(jìn)行CyclinD1表達(dá)水平的檢測(cè)，對(duì)于預(yù)測(cè)患者的化療療效具有一定意義。p27也是細(xì)胞周期調(diào)控因子，它可以抑制細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶復(fù)合物如cyclinD/CDK4、6及 cyclinE/CDK2等的活性，從而阻斷Rb磷酸化，使細(xì)胞停滯于G1期［11］。p27蛋白的低表達(dá)可以使其抑制功能降低，導(dǎo)致細(xì)胞的無(wú)限增殖，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生。p27是判斷腫瘤預(yù)后的重要指標(biāo)，在多種腫瘤中p27蛋白表達(dá)越低預(yù)后越差，同時(shí)p27是多種化療藥物抗腫瘤過(guò)程中的關(guān)鍵靶分子，化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程中p27起著重要的作用，其表達(dá)異常與多種腫瘤對(duì)化療的耐藥有關(guān)［12－14］。本研究發(fā)現(xiàn)，p27 的表達(dá)也與NSCLC化療療效有關(guān)，p27高表達(dá)者可獲得更高的化療療效及更長(zhǎng)的OS和PFS，與p27低表達(dá)者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。p27低表達(dá)的患者預(yù)后較高表達(dá)者更差。

NF-κB、CyclinD1和p27在細(xì)胞周期調(diào)控過(guò)程中相互影響相互作用。NF-κB可通過(guò)間接誘導(dǎo)生存因子或直接激活CyclinD1轉(zhuǎn)錄來(lái)促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)換。CyclinD1啟動(dòng)子有兩個(gè)κB位點(diǎn)，可與 NF-κB 結(jié)合啟動(dòng) CyclinD1［15］。本研究顯示NF-κB與CyclinD1具有明顯的正相關(guān)性，進(jìn)一步證實(shí)了腫瘤細(xì)胞中NF-κB的活化可激活CyclinD1從而導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控，細(xì)胞生長(zhǎng)表現(xiàn)為自主分裂和無(wú)限增殖［16］。p27可以抑制 CyclinD1/CDK4、6的活性，當(dāng) p27蛋白表達(dá)減少時(shí)，CyclinD1/CDK4、6復(fù)合物的活性增強(qiáng)，細(xì)胞無(wú)限增殖，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生。Marco等［17］認(rèn)為CyclinD1和p27之間存在反饋抑制環(huán)路，本研究也支持這一觀點(diǎn)，CyclinD1與p27的表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)。NF-κB、CyclinD1及p27蛋白的各種通路，如MAPK通路、AKT通路等可能在NSCLC的化療敏感性中起著重要的作用，深入研究 NF-κB、CyclinD1和 p27蛋白及其相關(guān)通路對(duì)NSCLC化療敏感性的作用機(jī)制，將為NSCLC的治療提供新的途徑。

綜上，化療是治療腫瘤的重要手段，但許多腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性較低，細(xì)胞周期特異性化療藥物也會(huì)出現(xiàn)耐藥，腫瘤細(xì)胞處于不同細(xì)胞周期可能是耐藥原因之一。而腫瘤治療強(qiáng)調(diào)個(gè)體化，多項(xiàng)細(xì)胞周期相關(guān)基因的檢測(cè)對(duì)于腫瘤個(gè)體化治療具有重要意義，目前腫瘤的靶向治療位點(diǎn)通常為一個(gè)基因，本研究發(fā)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè) NF-κB、CyclinD1和p27的表達(dá)可作為NSCLC患者化療敏感性及預(yù)后判斷的指標(biāo)，這可能成為腫瘤治療的新途徑。